专利名称：从福尔马林固定的毛发干内抽提dna的方法
技术领域：
本发明涉及从特殊毛发千内DNA抽提的方法。
背景技术：
在生物医学领域，福尔马林常用作动物组织标本、医学尸体及病理组织标本的防腐固定。 有文献报道福尔马林对固定后的标本组织的遗传信息存在一定的破坏，且浸泡固定的时间越 长对DNA破坏越大。
毛发分为毛干和毛根两部分，主要成分为角质蛋白，包括纤维蛋白与富含胱氨酸的非螺 旋蛋白，正是这种角质蛋白结构使得其具有不易腐烂的特点，因而在古墓遗骸清理过程中， 大多数古墓主人遗骸仅残存毛发与骨。同时，毛发也是法医鉴定常用的证物之一。利用毛发 进行遗传物质提取时，常选用含毛囊细胞的毛根部分，这是因为从毛囊细胞中获取遗传物质 相对毛发干要容易很多。但在考古学和法医学鉴定中，常常因发现时间太晚毛囊己经丢失， 或者由于防腐液浸泡时间过久毛根部分已经破坏。而从毛干部分提取遗传物质则相对困难。 目前，已有从新鲜毛发干内提取基因组的报道，也有从浸泡短暂固定的组织标本内提取基 因组的报道，但尚未有从长期浸泡固定的毛发干中提取基因组的成功例子，这一方面由于 毛发干是角质化组织、主成分为蛋白质，毛干部分消化难；另一方面，福尔马林不仅具有与 蛋白质的氨基结合，使其活性位点的活性降低或丧失，而且也能促使DNA-DNA交联和 DNA-蛋白质交联导致DNA的断裂与提取困难。
发明内容
本发明的目的在解决福尔马林长期浸泡固定的毛发干中难以提取遗传物质的难题，提 供一种从福尔马林浸泡固定的毛发干、脱离肌体较长时间的毛发干、古毛发干等各类非新鲜 的毛发干中提取DNA的方法。
本发明的详细技术方案为(1)毛发干预处理取毛发干，充分洗涤除尽杂质，随后依
次用质量浓度2.0M的NaOH与2.(P/o的HCr冼涤，之后用无菌蒸馏水多次漂洗，依次用梯度 酒精洗涤，无菌条件下晾干备用；(2)毛发干的修复处理0'C-10'C下把毛发干在装有0.01 mmol/L的柠檬酸钠溶液的匀浆器内磨碎，直到肉眼看不到毛发干碎片，转移研磨液至新的灭 菌EP管中，沸水浴5 15min;自然降至室温后加入无水乙醇混匀，室温静置，离心，收集 沉淀；(3)抽提DNA:向沉淀中加入头发消化液和蛋白酶K溶液，37'C 57'C水浴，持续消 化1~2小时;消化完毕后以酚/氯仿/异戊醇方法提取DNA。上述头发消化液的成分如下:Tris-Cl 10mmol/L (pH为8.0)、 NaCl 100 mmol/L、 CaCl2 1.0mmoI/L、 DTT 20~200 mmol/L、 SDS质 量百分比含量0.5%~5.0°/0、 Triton X-100体积百分比含量0.5%~4.0 %、其余为无菌双蒸水。
3蛋白酶K溶液的浓度为500 li g ~50mg/ml。
本发明先利用适当高温，不仅使甲醛-蛋白质、甲醛-DNA、 DNA-DNA、 DNA-蛋白质等 交联之间的键打开，而且使蛋白质封闭的活性位点的活性部分或全部恢复。同时，为了消除 长时间高温存在的负面影响，通过把古尸毛发干研磨至碎，增大了与热接触的表面积从而縮 短高温修复的时间，修复过程中释放出来的甲醛类有害物质通过离心去除。样品再用本发明 的消化液和蛋白酶K消化，然后通过酚氯仿抽提，以获取足够量的高质量的DNA。相对于现 有的EDTA-SDS-酶解、SDS-酶解、Triton X-100-酶解等方法，本发明的优点是先对毛发干样 品进行修复，使其蛋白质的活性位点的活性得以全部或部分恢复，以更好地发挥蛋白酶的酶 解活性。此外，本发明消化液的配制充分考虑毛发千裂解的特点，大大提高了毛发裂解效率， 縮短了毛发消化的时间。本方法不仅可以用于福尔马林浸泡的毛发干内基因组的抽提，而且 还可用于古毛发干内基因组的抽提，获得的基因组质量好、浓度高，可广泛应用于分子生态 多样性、分子鉴定、目的基因扩增、系统进化等各项研究。本发明的方法高效、经济、简单 且易于操作。
图1从实施例1~3得到的基因组DNA扩增后的电泳图。
具体实施方式
实施例l
从福尔马林固定10年的毛发中取远离毛囊2cm的毛发干20cm，先用洗涤精充分洗涤， 除去头发上的所有杂质，用无菌蒸馏水多次漂洗，随后用无菌的2.0 %的NaOH洗涤5分钟， 接着用无菌的2.0 %的HC1洗漆5分钟，之后用无菌蒸馏水漂洗至少3次，再依次用75%和 无水乙醇各洗漆一次，晾干后备用。
2°。条件下把毛发干在装有300 u 1 pH为6.0、浓度为0.01 mmol/L的柠檬酸钠修复液的 匀浆器内磨碎，以肉眼看不到毛发干碎片方可，转移研磨液至新的灭菌容积为2 ml的EP管 中，匀浆器用等体积的新鲜的修复液洗涤2次并都转入到EP管中，随后沸水浴修复8min。 修复完毕后自然降至室温时加入等体积无水乙醇混匀后，室温静置15 min， 14000Xg离心 20min,收集沉淀。
向沉淀中加入温度为56'C的毛发消化液600ul，头发消化液的各成分组成为pH为8.0 的Tris-Cl的含量10 mmol/L、 NaCl的含量100 mmol/L、 CaCl2的含量1.0 mmol/L、 DTT的含 量80.0mmol/L、 SDS的质量百分比含量2.0 %、 Triton X-100体积百分比含量2.0 %、其余为 无菌双蒸水。再加入10ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，56'C水浴，每10分钟轻 轻颠倒EP管数次，持续消化1小时。
消化完毕后向离心管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(V/V/V: 25: 24: 1)，上下轻轻倒
转EP管充分混匀，室温(25°C)静置10min,接着在2'C下，14000g离心14 min，轻轻收集上清液并转入到新的离心管中。将上清液用酚/氯仿/异戊醇重复抽提一次，收集上清液。
向上清液中加入2.5倍体积的-20'C冷冻的无水乙醇，上下轻轻倒转离心管10次后，室温置于沉淀lh后，2'C 10000Xg离心10min，收集沉淀。
沉淀用含10%乙醇的0.1M拧檬酸钠洗涤沉淀。每用lml消化液加入2ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2'C条件下10000Xg离心5分钟，弃上清。重复该步骤一次。随后，沉淀用75%乙醇洗沉淀1次，每用lml消化液A加入2ml 75%乙醇，室温放置10分钟，不时颠倒混合，2'C条件下10000Xg离心5分钟，弃上清。接着，用100%乙醇洗涤沉淀1次，每用lml消化液A加入2. ml 75%乙醇，室温放置20分钟，不时颠倒混合，2'C条件下10000Xg离心5分钟，弃上清，收集沉淀。沉淀物置于室温干燥15分钟后，加适量TE或无菌双蒸水溶解沉淀，即为毛发遗传信息DNA提取液，4'C保存备用。实施例2
取福尔马林固定30年的毛发，取远离毛囊的2cm处截取毛发干20cm，先用洗涤精充分洗涤，除尽头发上的所有杂质，用无菌蒸馏水漂洗8次，随后用无菌的2.0。/。的NaOH洗涤5分钟，接着用无菌的2.0 n/。的HCl洗涤5分钟，之后用无菌蒸馏水漂洗至少3次，再依次用75%和无水乙醇各洗涤一次，晾干后备用。
修复样品的制备与修复处理下把毛发干在装有300iUpH为6.0，浓度为0.01 mmol/L的柠檬酸钠修复液的匀浆器内磨碎,以肉眼看不到毛发干碎片方可，转移研磨液至新的灭菌容积为2 ml的EP管中，匀桨器用等体积的新鲜的修复液洗涤2次并都转入到EP管中，随后沸水浴修复15min。修复完毕后自然降至室温时加入等体积无水乙醇混匀后，室温静置15min，14000X g离心20min，收集沉淀。
向沉淀中加入温度为56。C的600 iU毛发消化液，头发消化液的组成为pH为8.0的Tris-Cl的含量10 mmol/L、 NaCl的含量100 mmol/L、 CaCl2的含量1.0 mmol/L、 DTT的含量500.0 mmol/L、 SDS的质量百分比含量4.0 %、 Triton X-100体积百分比含量4.0 %、溶剂为无菌双蒸水。再加入10ul浓度为50mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，56'C水浴，每10分钟轻轻颠倒EP管数次，持续消化1小时。
其余抽提DNA步骤同实施例1。 一
实施例3
从清代木伊毛发，木伊距今300年，取毛发中远离毛囊的毛发干20cm，先用洗涤精充分洗涤，除静头发上的所有杂质，用无菌蒸馏水多次漂洗，随后用无菌的2.0 。/。的NaOH洗涤5分钟，接着用无菌的2.0 Q/。的HC1洗涤5分钟，之后用无菌蒸馏水漂洗至少3次后，依次用75%和无水乙醇各洗涤一次，晾干后备用。
修复样品的制备与修复处理5'C条件下把毛发干在装有300ulpH为6.0，浓度为O.Ol
5mmol/L的柠檬酸钠修复液的匀桨器内磨碎至肉眼看不到毛发干碎片，转移研磨液至新的灭菌容积为2 ml的EP管中，匀浆器用等体积的新鲜的修复液洗漆2次并都转入到EP管中，随后沸水浴修复5min。修复完毕后自然降至室温时加入等体积无水乙醇混匀后，室温静置15 min，14000Xg离心20min，收集沉淀。
向沉淀中加入温度为56°C的毛发消化液600 " 1，头发消化液的组成为:pH为8.0的Tris-Cl的含量10 mmol/L、 NaCl的含量100 mmol/L、 CaCl2的含量1.0 mmol/L、 DTT的含量40.0mmol/L、 SDS的质量百分比含量1.0%、 Triton X-100体积百分比含量1.0 %、溶剂为无菌双蒸水。再加入10ul浓度为lmg/ml的蛋白酶K，充分混匀，56。C水浴，每10分钟轻轻颠倒EP管数次，持续消化3小时。 —
其它抽提DNA步骤同实施例1。实施例4 PCR扩增实施例1~3得到的DNA
将实施例1~3中得到的基因组DNA作为模版，用线粒体短片段重复序列引物行PCR扩增，扩增产物3%琼脂糖电泳。电泳图见附图1，其中泳道1~4依次代表Alu I site位点、Contro1region(L16209)位点、HaeIII位点、HincII位点的阴性对照；泳道5~8依次为实施例1:获得的长约106bp的Alu I site位点序列、约131bp的Control region(L16209)位点序列、约89 bp的HaeIII位点序列、约75bp的HincII位点序列；泳道9 12代表实施例2，仍获得Alu I site位点序列、Control region(L16209)位点序列、HaeIII位点序列和HincII位点序列；泳道13-16代表实施例3，仍获得Alu I site位点序列、Control region(L16209)位点序列、HincII位点序列，但未获得HaeIII位点序列；泳道17代表50bp marker;每条泳道都有一条小于50bp的DNA亮带，是引物二聚体。
权利要求
1.一种从福尔马林固定的毛发干内抽提DNA的方法，其特征在于包含下列步骤(1)毛发干预处理取毛发干，充分洗涤除尽杂质，随后依次用质量浓度2.0％的NaOH与2.0％的HCl洗涤，之后用无菌蒸馏水多次漂洗，再依次用梯度酒精洗涤，无菌条件下晾干备用；(2)毛发干的修复处理0℃～10℃下把毛发干在装有0.01mmol/L的柠檬酸钠溶液的匀浆器内磨碎，直到肉眼看不到毛发干碎片，转移研磨液至新的灭菌管中，沸水浴5～15min；自然降至室温后加入无水乙醇混匀，室温静置，离心，收集沉淀；(3)抽提DNA向沉淀中加入头发消化液和蛋白酶K溶液，37℃～57℃水浴，持续消化1～2小时；消化完毕后以酚/氯仿/异戊醇方法提取DNA；所述头发消化液的成分如下Tris-Cl 10mmol/L(pH为8.0)、NaCl 100mmol/L、CaCl21.0mmol/L、DTT 20～500mmol/L、SDS质量百分比含量0.5％～5.0％、Triton X-100体积百分比含量0.5％～4.0％、其余为无菌双蒸水；蛋白酶K溶液的浓度为0.5mg～50mg/ml。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述头发消化液的成分如下Tris-Cl 10 mmol/L (pH为8.0)、 NaCl 100 mmol/L、 CaCl2 1.0腿ol/L、 DTT 40~500 mmol/L、 SDS质量百分比含量1%~5.0%、 TritonX-100体积百分比含量1%~4.0 %、其余为无菌双蒸水；所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg 50mg/mL。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述头发消化液的成分如下 Tris画Cl 10 mmol/L (pH为8.0)、 NaCl 100 mmol/L、 CaCl2 1.0mmol/L、 DTT 500 mmol/L、 SDS质量百分比含量4.0。/。、 Triton X-100体积百分比含量4.0%、其 余为无菌双蒸水；所述蛋白酶K溶液的浓度为50mg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种从福尔马林固定的毛发干内抽提DNA的方法，将毛发干洗涤预处理后，0℃～10℃下把毛发干在装有0.01mmol/L的柠檬酸钠溶液的匀浆器内磨碎，沸水浴5～15min，修复毛发干；加乙醇静置、离心收集沉淀；向沉淀中加入头发消化液和蛋白酶K溶液，37℃～57℃水浴，持续消化1～2小时；消化完毕后提取DNA。本发明先对毛发干样品进行修复，使其蛋白质的活性位点的活性得以全部或部分恢复。此外，消化液的配制充分考虑毛发干裂解的特点，大大提高了毛发裂解效率，缩短了毛发消化的时间。本方法不仅可以用于福尔马林浸泡的毛发干内基因组的抽提，而且还可用于古毛发干内基因组的抽提。
文档编号C07H21/04GK101492486SQ20091004286
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月13日 优先权日2009年3月13日
发明者曾乐平, 慧 王, 童建斌, 罗学港, 旦 陈, 黄菊芳 申请人:中南大学