专利名称：用于鼻咽癌早期诊断的nag7基因诊断试剂盒的制作方法
专利说明用于鼻咽癌早期诊断的NAG7基因诊断试剂盒 本发明涉及蛋白质工程领域。鼻咽癌是东南亚和我国南方各省常见的恶性肿瘤，发病率居世界首位。对于鼻咽癌的早期诊断目前尚无有效的方法，患者一旦发现多已是中晚期，因而急待开发用于鼻咽癌早期诊断的新型手段。本发的目的是提供一种利用基因对鼻咽癌早期进行诊断的基因诊断试剂盒。
NAG7是鼻咽癌潜在的抑制基因，具备作为鼻咽癌诊断和治疗的分子标志的特点。本发明采用多聚酶链式反应(PCR)方法克隆NAG7基因蛋白编码序列，构建该基因的融合表达质粒，导入BL21的大肠杆菌中，IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达，SDS-PAGE电泳，Western blot鉴定，用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白，用HPLC大量分离与纯化蛋白质，以制备兔多抗和小鼠单抗，制备用于鼻咽癌早期诊断的NAG7基因诊断试剂盒。具体如下据原核表达载体pEGX-4T-2的GST阅读框架设计引物，使NAG7基因的编码区阅读框与GST的阅读框架一致。以含NAG7基因的质粒为模板(0.1μg)，加入上述引物各10pmol进行扩增，回收PCR产物条带。用SmalI酶切PCR回收产物及pEGX-4T-2载体，产生匹配的粘末端。小胶回收试剂回收线性的4.9kb的载体，NAG7编码区片段。将pEGX-4T-2载体与NAG7基因连接，构建成符合读框的GST-NAG7融合基因。用含融合基因的pEGX-4T-2质粒转化大肠杆菌BL21，小量制备质粒DNA，SalI和NotI酶切鉴定是否含插入片段，含插入片段的阳性克隆质粒DNA纯化后用DNA自动测序仪测序。
单个阳性菌落接种入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培养液中，37℃，过夜培养。将400μl过夜培养物分别接种到40ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37℃培养7h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，培养2.5h，转移至50ml离心管中。室温12000×g离心10min，去尽上清，置于冰上，重悬于预冷的600μl的PBS中。加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶、10μg/ml DNase I，用液氮和温水介导的反复冻融法破膜，11000rp离心10min，收集上清。重悬GST MicroSpin纯化柱中的树脂，打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，弃液体，盖上底盖，柱中加入600μl的细菌裂解液。盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温51-0min后打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，再用400μl PBS用相同的方法洗涤2次。柱中加入200μl的谷胱苷肽洗脱液，盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5～10min。735×g离心1min收集流出液。
诱导后的菌液超声破碎裂解后，SDS-PAGE电泳，KCl染色后，切下融合蛋白条带，反复冻融，加入等体积的福氏完全佐剂混匀，乳化后备用。多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗；两周后，注射抗原，采取背部多点注射；一周后加强一次，重复2-3次后采血。用环状沉淀实验确定其效价，当效价达到要求后，即可处死动物，收集血清。单抗的免疫程序免疫小鼠后收集腹腔巨噬细胞及小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性克隆，大量培养，可收集抗体，也可接种小鼠后，收集其血清或腹水。
制备试剂盒。
NAG7是鼻咽癌发生和发展的重要的相关基因之一，可抑制鼻咽癌细胞的恶性表型。NAG7的表达产物蛋白质作用于鼻咽癌细胞，具有基因治疗意义，其抗体可用于鼻咽癌诊断。细胞增殖实验、软琼脂集落形成实验和裸鼠致瘤实验证实NAG7具有抑制恶性表型的作用，研究进一步发现NAG7可改变鼻咽癌细胞基因表达谱和蛋白质表达谱，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而抑制鼻咽癌的发生与发展。本发明旨在通过对NAG7的进一步研究，获得用于鼻咽癌早期诊断的试剂盒。
图1NAG7基因重表达导致鼻咽癌细胞蛋白质表达发生改变，其中图1-a表达下调的蛋白质，图1-b表达上调的蛋白质；图2质谱技术对差异表达蛋白质点的鉴定图；图3融合蛋白的诱导与表达；图4融合蛋白的纯化。(1)据原核表达载体pEGX-4T-2的GST阅读框架设计引物，使NAG7基因的编码区阅读框与GST的阅读框架一致构建成符合阅读框的GST-NGX6融合基因。用含融合基因的pEGX-4T-2质粒转化大肠杆菌BL21，鉴定含插入片段的阳性克隆质粒(2)单个阳性菌落接种入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培养液中，37℃，过夜培养。将400μl过夜培养物分别接种到40ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37℃培养7h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，培养2.5h，转移至50ml离心管中。室温12000×g离心10min，去尽上清，置于冰上，重悬于预冷的600μl的PBS中。加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶、10μg/ml DNaseI，用液氮和温水介导的反复冻融法破膜，11000rp离心10min，收集上清。(3)重悬GST MicroSpin纯化柱中的树脂，打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，弃液体，盖上底盖，柱中加入600μl的细菌裂解液。盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5-10min后打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，再用400μl PBS用相同的方法洗涤2次。柱中加入200μl的谷胱苷肽洗脱液，盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5～10min。735×g离心1min收集流出液。(4)诱导后的菌液超声破碎裂解后，SDS-PAGE电泳，KCl染色后，切下融合蛋白条带，反复冻融，加入等体积的福氏完全佐剂混匀，乳化后备用。多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗；两周后，注射抗原，采取背部多点注射；一周后加强一次，重复2-3次后采血。用环状沉淀实验确定其效价，当效价达到要求后，即可处死动物，收集血清。单抗的免疫程序免疫小鼠后收集腹腔巨噬细胞及小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性克隆，大量培养，可收集抗体，也可接种小鼠后，收集其血清或腹水。
制备试剂盒。
权利要求
1.一种用于鼻咽癌早期诊断的基因诊断试剂盒，其特征在于本发明采用多聚酶链式反应(PCR)方法克隆NAG7基因蛋白编码序列，构建该基因的融合表达质粒，导入BL21的大肠杆菌中，IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达，SDS-PAGE电泳，Western blot鉴定，用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白，用HPLC大量分离与纯化蛋白质，以制备兔多抗和小鼠单抗，制备用于鼻咽癌早期诊断的NAG7基因诊断试剂盒。
全文摘要
一种用于鼻咽癌早期诊断的基因诊断试剂盒。本发明用多聚酶链式反应(PCR)方法克隆NAG7基因蛋白编码序列，用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白，用HPLC大量分离与纯化蛋白质，采用多点注射法制备兔多抗，骨髓瘤细胞融合法制备小鼠来源性的抗NAG7单抗。NAG7可改变鼻咽癌细胞基因表达谱和蛋白质表达谱，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而抑制鼻咽癌的发生与发展。本发明旨在通过对NAG7的进一步研究，获得用于鼻咽癌早期诊断的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1464069SQ0211421
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月21日 优先权日2002年6月21日
发明者李桂源, 谭琛, 彭聪, 李江, 董利, 张秋红 申请人:中南大学