玉米生长素应答因子ZmARF21基因及其应用
【专利摘要】本发明公开了玉米生长应答因子ZmARF21基因及其应用。本发明首先提供了从玉米两个自交系Ye478和Wu312中克隆得到的ZmARF21基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明进一步将上述ZmARF21基因转入到拟南芥中进行功能验证，结果表明，超表达ZmARF21基因能调控转基因拟南芥主根生长，其中，Ye478?ZmARF21基因能显著提高拟南芥在低氮胁迫下根生长的能力。本发明分离的ZmARF21基因是调控根系发育的QTL，可提高植物抗低氮胁迫的能力，在培育抗低氮胁迫的转基因植物新品种等方面有重要应用前景。
【专利说明】
玉米生长素应答因子ZmARF21基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及玉米生长素应答因子ZmARF21基因，尤其涉及玉米生长素应答因子 ZmARF21基因编码序列，进一步涉及它们在低氮胁迫下提高植物根生长能力的应用，属于生 长素应答因子基因及其应用领域。
【背景技术】
[0002] 氮是植物生长所必需的大量营养元素之一，是植物体内含量最丰富的矿质元素， 是生物体内多种有机分子的组成元素。植物对氮素的缺乏可导致植物生长缓慢，产量和品 质下降。玉米是高需氮作物，氮的吸收利用效率与玉米的产量直接相关。发达的根系是植物 高效吸收水分以及营养元素的重要生理基础之一，因此，在影响玉米氮效率的诸多因素中， 根系性状与玉米的吸氮能力密切相关。
[0003] 氮对于根系生长的影响可能与根中生长素有关。生长素是一种重要的促进侧根 (LR)形成的植物激素，Aux/IAAs和ARFs作为介导生长素信号的转录因子家族，是侧根(LR) 形成所必需的。生长素应答因子(Auxin response factor，ARF)，在生长素信号传导途径中 起着重要的作用，影响植物生长的多个过程，包括细胞伸长、顶端优势、衰老以及调控植物 根系的生长发育等。正反向遗传学分析已经证明侧根的形成需要ARF基因，例如在拟南芥 中，ARF7和ARF19作为转录激活子对靶基因激活对侧根的起始发育是必要的，miR160靶向导 入ARF10、ARF16和ARF17负调控侧根的形成。因此，研究生长素应答因子家族基因是否在硝 酸盐介导的调控根系生长途径中发挥作用，并应用于调控植物氮胁迫下根的生长能力具有 重要的科学意义。
【发明内容】
[0004] 本发明目的之一是提供玉米生长素应答因子ZmARF21基因的编码序列及其所编码 的蛋白；
[0005] 本发明目的之二是提供含有上述ZmARF21基因的重组植物表达载体以及含有该表 达载体的宿主细胞。
[0006] 本发明目的之三是将所述ZmARF21基因应用于提高或改善植物在低氮胁迫下根生 长能力的转基因植物新品种。
[0007] 本发明为达到以上目的，所采取的技术方案为：
[0008] 本发明通过设计相应引物，从两个玉米自交系Ye478和Wu312中克隆ARF21基因 DNA 和RNA序列，序列进行比对结果显示：ZmARF21在两个玉米自交系中存在插入缺失变异，与 B73(其核苷酸序列为SEQ ID如.3所示）相比41^21基因序列在￥6478和111312中存在5个 SNP位点和2段插入缺失突变；与Ye478-ZmARF21(其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示）相比， Wu312-ZmARF21(其核苷酸序列为SEQ ID腸.2所示）在762-773处缺失12&口碱基序列； Ye478-ZmARF21 相对于 Wu312-ZmARF21 在 1916-1921 处缺失 6bp 碱基序列。进一步对 ZmARF21 基因在两个玉米自交系中进行不同浓度的NOf处理，结果显示：在根系发达的Ye478根中， ZmARF21被0.04mmol/L、0.4mmol/L低氮浓度显著抑制，但在Wu312中对低氮无应答。
[0009] 本发明进一步提高了所述本发明玉米生长素应答因子ZmARF21基因所编码的蛋 白，其氨基酸序列为SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示。
[0010] 本发明还提供了含有所述玉米生长素应答因子ZmARF21基因的重组植物表达载体 以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。
[0011]本发明为研究ZmARF21基因是否在玉米根系应答到硝酸盐途径中发挥作用，以野 生型为对照，分析在正常生长条件下转Wu312-ZmARF21与Ye478-ZmARF21基因拟南芥根系指 标差异显示:转Ye478-ZmARF21拟南芥主根长与野生型相比存在极显著差异(卩〈0.01)，转 Wu312-ZmARF21拟南芥与野生型相比存在显著差异(P〈0.05)，推测超表达ZmARF21基因调控 转基因拟南芥主根生长，来自不同自交系的ZmARF21基因存在功能上的差异；另外，分析生 长两周后的转ZmARF21基因拟南芥在不同浓度勵 3_处理下主根长差异显示:Wu312-ZmARF21 转基因拟南芥在不同氮浓度下主根长变化与野生型一致，而Ye478-ZmARF21基因提高转基 因拟南芥在低氮胁迫下根生长能力。
[0012]鉴于来自两个不同于米自交系中ZmARF21基因存在功能上的差异，利用分子遗传 学方法进一步分析ZmARF21基因是否是与根系性状相关的QTL。首先确定了 ZmARF21落在6号 染色体的与玉米根系(包括节根、侧根和主根)生长发育相关的umc100 6标记区域。进一步对 ZmARF21基因是否是调控根系发育的QTL进行鉴定，结果显示ZmARF21在Ye478中是一个与根 系性状、氣应答相关的QTL。
[0013]由此，本发明提供了一种低氮胁迫下提高植物根生长能力的方法，包括:将本发明 ZmARF21基因引入到目标植物或植物细胞中，能够有效提高低氮胁迫下目标植物根生长能 力。
[0014] 本发明还提供了一种培育低氮胁迫下提高根生长能力的转基因植物新品种的方 法，其特征在于，包括：（1)构建含有所述ZmARF21基因的重组植物表达载体；（2)将所构建的 重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；（3)培育筛选得到低氮胁迫下根生长能 力提尚的转基因植物新品种。
[0015] 本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
[0016] 本发明克隆的Ye478-ZmARF21和Wu312-ZmARF21基因可调控植物根生长能力，其中 Ye478-ZmARF21基因可显著提高转基因拟南芥在低氮胁迫下根生长能力，对于提高低氮胁 迫下植物主根生长以及培育在低氮胁迫下根生长能力提高的转基因植物新品种有重要意 义。
[0017] 本发明所涉及的术语定义
[0018] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0019] 术语"生长素应答因子"意指调节生长素响应基因表达的一类转录因子。
[0020] 术语"重组宿主细胞"或"宿主细胞"意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用 何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的 其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
[0021] 术语"多核苷酸"或"核苷酸"意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核 苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸 的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的 核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括 PNA(肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指 定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取 代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或 所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代 (Batzer等人，Nucleic Acid Res · 19:5081 (1991) ;Ohtsuka等人，J.Biol ·Chem. 260: 2605-2608( 1985);和Cassol等人，（1992) ;Rossolini等人，Mol Cell.Probes8:91-98( 1994))。
[0022] 术语"表达"指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。
[0023] 术语"转化"指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。
[0024] 术语"外源基因"指对特定的宿主细胞而言，该基因序列是属于外来的来源，或是 来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。
【附图说明】
[0025] 图 1 B73、Ye478-ZmARF21 和 Wu312-ZmARF21 基因序列比对结果；
[0026]图2不同N(V离子浓度下ZmARFs家族基因在两个玉米自交系根中的表达；
[0027] 图3不同时间转Ye478-ZmARF21和Wu312-ZmARF21拟南芥主根生长变化；
[0028] 图4不同氮处理下转Ye478-ZmARF21和Wu312-ZmARF21拟南芥主根生长变化；
[0029] 图5低氮处理下转基因 Ye478-ZmARF21拟南芥主根生长变化；
[0030] 图6 Ye478XWu312RIL群体构建分子标记图谱；
[0031] 图7 Ye478XWu312RIL群体中ZmARF21插入缺失带型。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和 形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0033]试验例lZmARF21的分离及鉴定 [0034] 1、试验方法
[0035] l.lZmARF21 的分离鉴定
[0036] 设计相应引物，从两个玉米自交系Ye478和Wu312中克隆ARF21基因 DNA和RNA序列， 进行序列对比分析。引物序列如下：
[0037] 正向：5，ATGATTACTTTCGTGGACTCGGC 3，
[0038] 反向：5，CTACCTCGCGTCCGTTTGTATG 3，
[0039] 1 · 2ZmARF21基因表达分析
[0040] 用不同浓度的 N〇3-(0.04mmol/L、0.4mmol/L、4mmol/L、10mmol/L)处理玉米自交系 Ye478和Wu312,测定不同N(V离子浓度下ZmARFs家族基因在两个玉米自交系根中的表达情 况。
[0041 ] 2、试验结果
[0042] 2.1ZmARF21 的分离鉴定
[0043] 基因测序结果如图1所示，从图中可以看出：ZmARF21在两个玉米自交系中存在插 入缺失变异，ARF21基因序列在Ye478和Wu312中存在5个SNP位点和2段插入缺失突变；与 Ye478-ZmARF21 相比，Wu312-ZmARF21 在 762-773 处缺失 12bp 碱基序列；Ye478-ZmARF21 相对 于Wu312-ZmARF21在1916-1921处缺失6bp碱基序列。
[0044] 2.2ZmARF21基因表达分析
[0045] ZmARF21基因在两个玉米自交系中对不同N〇3_处理应答如图2所示，结果表明 ZmARF21基因在两个玉米自交系中对不同N〇3_处理应答显著不同。在根系发达的Ye478根中， ZmARF21被0.04mmol/L、0.4mmol/L低氮浓度显著抑制，但在Wu312中对低氮无应答。
[0046] 试验例2ZmARF21基因的功能鉴定试验
[0047]为研究ZmARF21基因是否在玉米根系应答到硝酸盐途径中发挥作用，首先通过转 基因拟南芥的分析鉴定其功能。
[0048] (1)转基因拟南芥阳性株的筛选
[0049] 提取经过测序的ZmARF21-pCMABIA1304载体的质粒，液氮冻融法转入农杆菌 GV3101中。调整农杆菌菌液浓度0D至0.8，浸花法转化拟南芥，收获T1种子后，在含有潮霉素 ZmARF21的1/2MS培养基上筛选阳性植株。转基因阳性植株含有抗生素基因，能够在含有抗 生素的培养基上长出真叶和主根后移栽到土壤中收获种子。
[0050] (2)超表达ZmARF21基因调控转基因拟南芥根生长
[00511以纯合T2代转基因拟南芥为材料，分析来自Ye478和Wu312这两个玉米自交系中的 ZmARF21基因在调控根系生长中的功能。将T2代转基因种子与野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana Columbia)种子同时种于1/2MS培养基中培养，分别进行不同的处理，分析转基因 拟南芥在正常生长条件下、在不同浓度处理下以及在低氮条件下根系指标的变化。 [0052] (3)超表达ZmARF21基因调控转基因拟南芥主根生长
[0053] 以野生型为对照，分析在正常生长条件下转Wu312-ZmARF21与Ye478-ZmARF21基因 拟南芥根系指标差异。在测定转基因和野生型拟南芥的总根长、主根长、侧根数、平均侧根 长等指标显示，〇E_ZmARF21转基因拟南芥的主根长与野生型相比存在差异。同一平板放置5 株转基因实验株和3株野生对照株，在分别培养7(1、10(1、13(1、16(1、20(1、25(1时取样测定结果 如图3所示表明：转Ye478-ZmARF21拟南芥主根长与野生型相比存在极显著差异(P〈0.01)， 转Wu312-ZmARF21拟南芥与野生型相比存在显著差异(P〈0.05)，推测ZmARF21在拟南芥中参 与调控主根生长，并且来自不同自交系的ZmARF21基因存在功能上的差异。
[0054] (4)转基因拟南芥耐低氮胁迫处理
[0055]以野生型为对照，分析生长两周后的转ZmARF21基因拟南芥在不同浓度NOf处理下 主根长差异。转Wu312-ZmARF21与Ye478-ZmARF21基因和野生型拟南芥分别在0.04mM， 0.4mM，4mM和10mM N(V的平板中生长一周后主根长变化，结果见图4,从图中可以看出：与正 常氮(4mM)相比，低氮(0.04mM，0.4mM)和高氮(10mM)均抑制野生型拟南芥主根生长，同样也 抑制了转Wu312-ZmARF21拟南芥主根长生长。但在低氮条件下，转Ye478-ZmARF21基因拟南 芥主根长显著增加，高氮条件下显著降低，指示Ye478-ZmARF21基因在转基因拟南芥在氮胁 迫条件下调控主根生长。
[0056]进一步分析转Ye478-ZmARF21基因拟南芥在低氮(0.04mM)条件下主根长的变化， 结果见图5,从图中可以看出：随着培养时间的延长，虽然野生型和转基因拟南芥主根长均 在增加，但是野生型拟南芥在低氮条件下培养10天后主根长有显著增加，随后随着时间的 延长主根生长逐渐缓慢;转基因拟南芥在低氮条件下生长了 16d-25d之后，主根长仍有显著 变化，指示Ye478-ZmARF21基因提高转基因拟南芥在低氮胁迫下根生长能力。
[0057] 试验例3ZmARF21基因的定位试验
[0058] 利用Ye478和Wu312直接的序列差异设计分子标记(Marker)，把这些Marker整合到 基于Ye478XWu312RIL群体构建分子标记图谱，结果如图6所示，确定ZmARF21落在6号染色 体的umc100 6标记区域，而此标记与玉米根系(包括节根、侧根和主根)生长发育相关。
[0059]试验例4鉴定ZmARF21基因是调控根系发育的QTL试验 [0060] 1 · lYe478 XWu312RIL群体中ZmARF21差异片段多态性
[0061 ] 玉米Ye478和Wu312的ZmARF21序列在762-775位置上有12bp大小的差异，根据此差 异序列设计引物，扩增其在Ye478XWu312RIL群体中差异片段多态性。结果如图7所示，扩增 特异性目的片段(大小约200bp)，获得A、B、AB、N/A四种条带，表明在Ye478 X Wu312的重组自 交系群体中存在A(Ye478)、B(Wu312)和AB(Ye478和Wu312)三种带型。统计四种条带数目分 别为:A 64，B 80，AB 37，N/A 27,在Ye478XWu312208个群体样本中A带型占比30·8%、Β带 型占比38.5%、ΑΒ带型占比17.8%。
[0062] 1.2基于ZmARF21基因与Ye478XWu312RIL群体表型关联分析
[0063] ZmARF21在Ye478XWu312的重组自交系群体(RIL群体样本208)中存在A(Ye478)、B (Wu312)和AB(Ye478和Wu312)三种带型。分析A、B和AB三种带型与两个氮浓度下RIL群体根 系表型数据(见表1)显示:A、B和AB三种带型对应的种子根数、主胚根长、种子总根长、节根 数和侧根数5个根系表型数据在两个氮浓度下没有显著差异，表明这些序列差异的存在没 有显著影响以上5种根部表型的变化。但节根长数据显示，三种带型所对应的节根长有一致 性的变化规律，即在4.0mM N〇3^下的节根长度均显著短于0.04mM N〇3^处理的节根长度，且 三年的数据均有一致性规律，表明这些差异序列的存在显著影响玉米在不同氮浓度下节根 长。
[0064] 表1玉米Ye478XWu312RIL群体根系表型与ZmARF21基因带型统计
[0067] 注：同年不同处理下表型存在显著差异用不同字母标注(P〈0.05).
[0068] 表2玉米Ye478XWu312RIL群体根系表型与ZmARF21基因带型统计
[0069]
[0070]关联分析表明，ZmARF21基因三种差异带型对节根长的贡献率不同，分年度分析见 表2，结果显示，A型对节根长的贡献率分别为3.15 %、2.87 %和3.21 %，B型对节根长的贡献 率分别为0.45%、0.76%和0.53%，AB型对节根长的贡献率分别为1 .15%、1.28%和 1.07 %。比较分析，A型对节根长的贡献率最大，B型对节根长的贡献率很低，AB型对节根长 的贡献率介于两者之间，而A型是根系发达的Ye478玉米独有基因带型有关，B为Wu312玉米 (根系不发达)独有基因带型。基于这些实验结果，推测ZmARF21基因与玉米根系表型存在相 关性。
【主权项】
1. 玉米生长素应答因子ZmARF21基因，其特征在于:其核苷酸序列为SEQ ID N0.1或SEQ ID NO.2所示。2. 权利要求1所述玉米生长素应答因子ZmARF21基因所编码的蛋白，其特征在于：其氨 基酸序列分别为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。3. 含有权利要求1所述玉米生长素应答因子ZmARF21基因的重组表达载体。4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体是重组植物表 达载体。5. 含有权利要求3或4所述重组表达载体的重组宿主细胞。6. 权利要求1所述的玉米生长素应答因子ZmARF21基因或权利要求2所述的蛋白在调控 植物根系发育中的应用。7. 权利要求1所述的玉米生长素应答因子ZmARF21基因或权利要求2所述的蛋白在提高 抗低氮胁迫能力中的应用。8. 按照权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的抗低氮胁迫是在低氮胁迫下促进主 根生长。9. 按照权利要求6或7所述的应用，其特征在于，包括：（1)构建含有权利要求1所述玉米 生长素应答因子ZmARF21基因的重组植物表达载体；（2)将所构建的重组植物表达载体转化 到植物组织或植物细胞中；（3)培育筛选得到低氮胁迫下根生长能力提高的转基因植物。10. -种培育低氮胁迫下根生长能力提高的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包 括：（1)构建含有权利要求1所述玉米生长素应答因子ZmARF21基因的重组植物表达载体； (2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；（3)培育筛选得到低氮胁 迫下根生长能力提尚的转基因植物新品种。
【文档编号】A01H5/00GK105936908SQ201610461477
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】王俊英, 陈范骏
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所