诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴将诃子药材干燥果实粉碎后进行超声提取，提取液减压浓缩干燥得粗提取物干燥粉末；⑵以正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水为溶剂系统，利用HSCCC对粗提物进行分离，分别得到诃子酸，诃黎勒酸和鞣花酸。经将所述方法分离得到的诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品采用效液相色谱(HPLC)进行检测纯度，纯度均达95％以上。本发明简便、快捷。
【专利说明】
诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制 备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种化学对照品的制备方法，尤其涉及诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸 和鞣花酸三种化学对照品的制备方法。
【背景技术】
[0002] 诃子(Terminalia chebula Retz.)为使君子科植物，是诃子药材的主要来源，主 要化学成分为多酚类、没食子酰葡萄糖类、三萜酸类等，具有较强的抗氧化、抗菌消炎、抗 癌、抗过敏、抑制糖苷酶活性等多重作用，现代药理学研究证明多酚类是主要活性成分。 然而，目前用于诃子药材及其产品质量控制的化学成分为没食子酸，不足以全面反映诃子 的质量。因此，建立多种类化学成分的质量控制方法对于诃子药材的综合开发利用具有重 要意义，而多酚类化学对照品的缺乏严重制约了这方面的研究。尤其是，同时获得高纯度的 诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品，未见相关报道。诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三 种化学对照品的结构式如下：
[0003]
[0004] 高速逆流色谱（High Speed Counter Current Chromatography，HSCCC)是由美国 国立卫生研究院(NIH)的Yoichiro Ito博士于上世纪80年代发明的一种基于液液分配机理 的新型色谱分离纯化技术，无需固体作固定相，不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、 失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，在天然产物有效成分的分离、纯化、制备方面显示 出强大的优势，非常适合于化学对照品的制备，HSCCC已成为实现中藏药现代化的一个必备 手段。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快捷的诃子药材中诃子酸、诃黎勒 酸和鞣花酸三种化学对照品的制备方法。
[0006] 为解决上述问题，本发明所述的诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学 对照品的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)提取：将诃子药材干燥果实粉碎至40~200目后，以lg: 5mL~30mL的比例用体 积浓度为10~95 %的乙醇在200~400W下进行超声提取，提取次数为1~3次，每次30~ 60min，合并得到提取液;所述提取液经减压浓缩干燥得粗提取物干燥粉末；；
[0008] (2)分离纯化：以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，下相作为流动相，将所述 目标成分的粗提物溶于下相溶液中，并注入高速逆流色谱仪进行分离，待流动相流出色谱 柱时，根据色谱峰收集分离物;该分离物依次经浓缩、干燥至恒重后，分别得到诃子酸，诃黎 勒酸和鞣花酸；
[0009] 进一步，所述步骤（1)中诃子药材干燥果实是指使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)的干燥果实。
[0010] 进一步，所述步骤(2)溶剂系统中的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为0.5~ 1·5:5~9:0·3~0·7:1~5〇
[0011] 进一步，所述步骤(2)中高速逆流色谱仪(HSCCC)的分离条件是流速0.5~3.5mL/ min，主机转速700~900rpm，分离温度15~35°C，进样量为50~200mg，固定相的保留率为50 ~71%〇
[0012] 为了确证本发明所制备的诃子酸，诃黎勒酸和鞣花酸三种化学品的纯度，将所述 高速逆流色谱仪分离得到的单体分别利用高效液相色谱检测纯度;在纯度检测中高效液相 色谱(HPLC)检测条件是指采用长度为250mm、直径为4.6mm且填料粒径为5μπι的C18色谱柱， 柱温25 °C，流动相为甲醇-0.1 %乙酸的混合溶剂，流速为lmL/min，检测波长为254nm;梯度 洗脱程序:0_60min，10-70 %甲醇;60-70min，70-90 %甲醇。结果表明本发明方法制备的诃 子酸，诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的纯度都在95%以上(参见图2~5)。
[0013] 为了确证本发明所制备诃子酸，诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品结构，将所述 高速逆流色谱仪分离得到的三种化学对照品分别测试了 h-NMR和13C-NMR。
[0014] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0015] 1、本发明所用溶剂安全无毒，可回收利用，生产成本低。
[0016] 2、本发明采用高速逆流色谱从粗提物中分离纯化目标化合物，无需固体作固定 相，不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，非 常适合于化学对照品的制备。
[0017 ] 3、本发明操作简单、方便、易于实现自动化控制。
[0018] 4、采用本发明方法获得的诃子酸，诃黎勒酸和鞣花酸均通过h-NMR和13C_NMR鉴定 符合该化合物结构(参见图1);同时，利用HPLC检测纯度都在95%以上(参见图2~5)。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明诃子酸，诃黎勒酸和鞣花酸的HSCCC分离图谱；
[0020] 图2为诃子酸HPLC分析图谱；
[0021]图3为诃黎勒酸HPLC分析图谱；
[0022]图4为鞣花酸HPLC分析图谱；
[0023] 图5为诃子酸1H NMR图谱；
[0024] 图6为诃子酸13C NMR图谱；
[0025] 图7为诃黎勒酸1H NMR图谱；
[0026] 图8为诃黎勒酸13C NMR图谱；
[0027] 图9为鞣花酸1H NMR图谱；
[0028] 图10为鞣花酸13C NMR图谱。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[0030] 诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备方法，包括以下步 骤：
[0031] (1)提取:将诃子药材干燥果实粉碎至40目后，取500g，用质量浓度为10%的乙醇 2.5L在200W下进行超声提取，提取次数为1次，提取时间30min，得到提取液;提取液在60 °C， 0.04MPa条件下减压浓缩干燥得提取物干燥粉末。
[0032] 其中：诃子药材干燥果实是指使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)的 干燥果实。
[0033] (2)分离纯化:分离纯化：以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，下相作为流动 相，将所述目标成分的粗提物溶于下相溶液中，并注入高速逆流色谱仪进行分离，待流动相 流出色谱柱时，根据色谱峰收集分离物；该分离物依次经浓缩、干燥至恒重后，分别得到 3.3mg诃子酸，4.5mg诃黎勒酸和2.3mg縣花酸；
[0034] 其中：溶剂系统中的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比（L/L)为0.5:5:0.3:1。 [0035] 高速逆流色谱仪(HSCCC)的分离条件是指流速0.5mL/min，主机转速700rpm，分离 温度15 °C，进样量为50mg，固定相的保留率为62 %。
[0036]本发明所述诃子酸，诃黎勒酸和鞣花酸三种化合物的HSCCC分离图谱见图1。
[0037]纯度检测：将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别利用高效液相色谱 (HPLC)检测纯度，纯度都在95%以上。其中：高效液相色谱(HPLC)检测条件是指采用长度为 250mm、直径为4.6mm且填料粒径为5μπι的C 18色谱柱，柱温25 °C，流动相为甲醇-水的混合溶 剂，流速为lmL/min，检测波长为280nm;梯度洗脱程序:Omin，10 %甲醇;60min，80 %甲醇。诃 子酸，诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的纯度分析图谱见图2-4;
[0038] 结构鉴定：将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别通过1H-匪R和13C-NMR 进行鉴定。诃子酸，诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的1H NMR和13C NMR图谱见图5-10。 [0039] 实施例2
[0040] 诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备方法，包括以下步 骤：
[0041] (1)提取:将诃子药材干燥果实粉碎至200目后，取500g，用质量浓度为95 %的乙醇 15L在400W下进行超声提取，提取次数为3次，提取时间60min，得到提取液;提取液在60 °C， 0.04MPa条件下减压浓缩干燥得提取物干燥粉末。
[0042] 其中：诃子药材干燥果实是指使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)的 干燥果实。
[0043] (2)分离纯化:分离纯化：以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，下相作为流动 相，将所述目标成分的粗提物溶于下相溶液中，并注入高速逆流色谱仪进行分离，待流动相 流出色谱柱时，根据色谱峰收集分离物；该分离物依次经浓缩、干燥至恒重后，分别得到 6.3mg诃子酸，9.7mg诃黎勒酸和5. Omg縣花酸；
[0044] 其中：溶剂系统中的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比(L/L)为1.5:9:0.7:5。高 速逆流色谱仪(HSCCC)的分离条件是指流速3.5mL/min，主机转速900rpm，分离温度35°C，进 样量为10〇11^，固定相的保留率为54%。
[0045]将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别利用高效液相色谱(HPLC)检测纯 度，纯度都在95%以上。
[0046]其中：高效液相色谱(HPLC)检测条件同实施例1。
[0047] 将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别通过1H-NMR和13C_NMR进行鉴定。
[0048] 实施例3
[0049] 诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备方法，包括以下步 骤：
[0050] (1)提取:将诃子药材干燥果实粉碎至80目后，取500g，用质量浓度为70%的乙醇 5L在350W下进行超声提取，提取次数为3次，提取时间40min，得到提取液；提取液在60°C， 0.04MPa条件下减压浓缩干燥得提取物干燥粉末。
[0051] 其中：诃子药材干燥果实是指使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)的 干燥果实。
[0052] (2)分离纯化:分离纯化：以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，下相作为流动 相，将所述目标成分的粗提物溶于下相溶液中，并注入高速逆流色谱仪进行分离，待流动相 流出色谱柱时，根据色谱峰收集分离物；该分离物依次经浓缩、干燥至恒重后，分别得到 13mg诃子酸，18mg诃黎勒酸和9mg縣花酸；
[0053]其中：溶剂系统中的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比（L/L)为1:8:0.5: 4。高速 逆流色谱仪(HSCCC)的分离条件是指流速1.5mL/min，主机转速900rpm，分离温度30°C，进样 量为20〇11^，固定相的保留率为65%。
[0054]将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别利用高效液相色谱(HPLC)检测纯 度，纯度都在95%以上。
[0055] 其中：高效液相色谱(HPLC)检测条件同实施例1。
[0056] 将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别通过1H-NMR和13C-NMR进行鉴定。
[0057] 实施例4
[0058]诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备方法，包括以下步 骤：
[0059] (1)提取:将诃子药材干燥果实粉碎至100目后，取500g，用质量浓度为50%的乙醇 7.5L在300W下进行超声提取，提取次数为3次，提取时间40min，得到提取液;提取液在70°C， 0.064MPa条件下减压浓缩干燥得提取物干燥粉末。
[0000] 其中：诃子药材干燥果实是指使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)的 干燥果实。
[0061] (2)分离纯化:分离纯化：以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，下相作为流动 相，将所述目标成分的粗提物溶于下相溶液中，并注入高速逆流色谱仪进行分离，待流动相 流出色谱柱时，根据色谱峰收集分离物；该分离物依次经浓缩、干燥至恒重后，分别得到 6.3mg诃子酸，9.7mg诃黎勒酸和5. Omg縣花酸；
[0062]其中：溶剂系统中的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比（L/L)为1:7:0.5:3。高速 逆流色谱仪(HSCCC)的分离条件是指流速2mL/min，主机转速800rpm，分离温度30°C，进样量 为1〇〇11^，固定相的保留率为62%。
[0063]将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别利用高效液相色谱(HPLC)检测纯 度，纯度都在95%以上。
[0064] 其中：高效液相色谱(HPLC)检测条件同实施例1。
[0065] 将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别通过1H-NMR和13C-NMR进行鉴定。
[0066] 实施例5
[0067]诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备方法，包括以下步 骤：
[0068] (1)提取:将诃子药材干燥果实粉碎至160目后，取500g，用质量浓度为60 %的乙醇 10L在250W下进行超声提取，提取次数为2次，提取时间40min，得到提取液;提取液在70 °C， 0.064MPa条件下减压浓缩干燥得提取物干燥粉末。
[0069] 其中：诃子药材干燥果实是指使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)的 干燥果实。
[0070] (2)分离纯化:分离纯化：以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，下相作为流动 相，将所述目标成分的粗提物溶于下相溶液中，并注入高速逆流色谱仪进行分离，待流动相 流出色谱柱时，根据色谱峰收集分离物；该分离物依次经浓缩、干燥至恒重后，分别得到 6.6mg诃子酸，9.2mg诃黎勒酸和4.8mg縣花酸；
[0071] 其中：溶剂系统中的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比（L/L)为1:7:0.5:3。高速 逆流色谱仪(HSCCC)的分离条件是指流速2mL/min，主机转速800rpm，分离温度25°C，进样量 为1〇〇11^，固定相的保留率为61%。
[0072]将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别利用高效液相色谱(HPLC)检测纯 度，纯度都在95%以上。
[0073]其中：高效液相色谱(HPLC)检测条件同实施例1。
[0074] 将高速逆流色谱仪(HSCCC)分离得到的单体分别通过1H-NMR和13C_NMR进行鉴定。
[0075] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备方法，其特征在于，包 括以下步骤： (1) 提取:将诃子药材干燥果实粉碎至40~200目后，以Ig: 5mL~30mL的比例用体积浓 度为10~95%的乙醇在200~400W下进行超声提取，提取次数为1~3次，每次30~60min，合 并得到提取液;所述提取液经减压浓缩干燥得粗提取物干燥粉末； (2) 分离纯化：以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂系统，下相作为流动相，将所述目标 成分的粗提物溶于下相溶液中，并注入高速逆流色谱仪进行分离，待流动相流出色谱柱时， 根据色谱峰收集分离物;该分离物依次经浓缩、干燥至恒重后，分别得到诃子酸，诃黎勒酸 和鞣花酸。2. 如权利要求1所述的诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备 方法，其特征在于:所述步骤⑴中诃子药材干燥果实是指使君子科植物诃子的干燥果实。3. 如权利要求1所述的诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备 方法，其特征在于:所述步骤(2)溶剂系统中的正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为0.5~ 1·5:5~9:0·3~0·7:1~5〇4. 如权利要求1所述的诃子药材中诃子酸、诃黎勒酸和鞣花酸三种化学对照品的制备 方法，其特征在于:所述步骤(2)中高速逆流色谱仪的分离条件是指流速0.5~3.5mL/min， 主机转速700~900rpm，分离温度15~35°C，进样量为50~200mg，固定相的保留率为50~ 71%。
【文档编号】C07H13/08GK105949252SQ201610063688
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年1月29日
【发明人】李玉林, 邹登朗, 陈涛
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所