阴沟肠杆菌及其用图
【专利摘要】本发明提出了一种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)及其用途，并于2016年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC12206。该阴沟肠杆菌是发明人首次在海洋中分离和发现的，在治理赤潮、处理含有赤潮藻的水样以及抑制赤潮藻生长中具有显著的作用。CGMCC No.1220620160311
【专利说明】
阴沟肠杆菌及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及阴沟肠杆菌、阴沟肠杆菌的用途及治理 赤潮的方法、水处理方法和抑制赤潮藻生长的方法。
【背景技术】
[0002] 赤潮是指海洋中浮游生物(尤指藻类)在短时间内爆发性增殖或高度聚集、引起水 色异常的生态现象（多呈红色或褐色），被称之为"藻华"或喻为"红色幽灵"。近海环境的日 益污染和海洋资源的不合理开发，给生态环境带来了巨大的承载压力，导致局域赤潮的频 繁发生，造成海洋环境的生态灾难。该生态灾害造成了水源的污染、能源的消耗、以及水体 中溶氧的降低，对生物的生存环境构成严重威胁。部分赤潮生物还伴有毒素产生，直接毒杀 水生生物，给海岸经济和养殖业带来巨大损失。
[0003] 我国是一个赤潮多发国，且有害赤潮的发生呈逐年上升趋势。据国家海洋局统计， 从20世纪70年代以来，我国赤潮发生频率以每10年3倍的速度增长，2000伊始，年均有超过 30次左右的较大规模赤潮。据《2014年中国海洋灾害公报》显示，2014全海域共发现赤潮56 次，累计面积7290平方公里，直接经济损失逾亿元。在引发赤潮的原因种中，优势藻类共13 种，东海原甲藻爆发次数最多，为23次;其次是夜光藻，引发赤潮次数为9次;米氏凯伦藻和 红色赤潮藻各4次，赤潮异弯藻和多纹膝沟藻各3次，海洋卡盾藻、中肋骨条藻和球型棕囊藻 各2次，抑食金球藻、海链藻、锥状斯氏藻和条纹环沟藻各1次。
[0004] 基于近年来赤潮灾害发生次数日益增多、范围日益扩大、危害日益加剧的趋势，对 赤潮(或赤潮藻)的发生进行有效防控是保护海洋环境的首要前提。
【发明内容】
[0005] 本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：
[0006] 藻类的生消与共生微生物有着密不可分的关系，共生微生物中存在的溶藻或抑藻 个体，可以通过直接或间接的作用抑制藻类的生长。基于此，本发明提出了一种利用赤潮藻 共生微生物有效治理赤潮的方法。
[0007] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种阴沟肠杆菌，于2016年3月11日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12206。本发明所提 出的阴沟肠杆菌是发明人首次从海洋中分离和发现的。根据本发明的实施例，本发明所提 出的阴沟肠杆菌具有胞外产群体感应信号的特性，具有群体感应能力（quorum sensing, QS)，并且本发明所提出的阴沟肠杆菌为赤潮藻的共生微升物，在治理赤潮、处理含有赤潮 藻的水样以及抑制赤潮藻生长中具有显著的作用。
[0008] 在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的阴沟肠杆菌在下列至少之一中的 用途:治理赤潮;处理含有赤潮藻的水样；以及抑制赤潮藻生长。本发明所提出的阴沟肠杆 菌在上述治理赤潮、处理含有赤潮藻的水样以及抑制赤潮藻生长中具有极其显著的效果。
[0009] 根据本发明的实施例，上述阴沟肠杆菌的用途还可以进一步具有如下附加技术特 征至少之一：
[0010]根据本发明的实施例，所述治理赤潮、处理含有赤潮藻的水样以及抑制赤潮藻生 长是通过包括降低赤潮藻细胞密度、降低赤潮藻的叶绿素含量和降低赤潮藻的光合效率的 至少之一实现的。本发明实施例的阴沟肠杆菌可显著降低赤潮藻的密度、叶绿素含量或光 合效率，进而显著抑制赤潮藻的生长，本发明实施例的阴沟肠杆菌用于治理赤潮、处理含有 赤潮藻的水样以及抑制赤潮藻生长，效果显著提高。
[0011]在本发明的第三方面，本发明提出了一种治理赤潮的方法。根据本发明的实施例， 所述方法包括：向生长有赤潮藻的海洋中投放前面所述的阴沟肠杆菌。相比现有的治理赤 潮的技术，如物理方法中的黄泥浆絮凝法需要较大的剂量才能起到抑制的效果，这在一定 程度上增加了操作的难度和成本的投入，如化学方法中的杀藻剂，在杀灭藻类的同时，也给 其他生物带来了直接或间接的危害，不能体现环境友好型特性，如生物学方法中的投放摄 食藻类的大型生物(鱼类），存在打破食物网结构，破坏生物网稳定的生态风险。本发明实施 例提出的治理赤潮的方法成本低、操作简单，利用藻类与微生物的共生关系，在杀灭藻类的 同时，不会给其它生物带来危害，不破坏生态稳定，是一种环境友好型的有效治理赤潮的方 法。
[0012] 根据本发明的实施例，上述治理赤潮的方法还可以进一步包括如下附加技术特征 至少之一：
[0013] 根据本发明的实施例，所述赤潮藻为条纹悬沟藻。本发明实施例提出的方法用于 对条纹悬沟藻形成的赤潮的治理效果显著提高。
[0014] 在本发明的第四方面，本发明提出了一种水处理方法。根据本发明的实施例，所述 方法包括：向含有赤潮藻的水样中添加前面所述的阴沟肠杆菌。本发明实施例提出的水处 理的方法成本低、操作简单，利用赤潮藻类与微生物的共生关系，在杀灭藻类的同时，不会 给其他生物带来危害，不破会生态稳定，是一种环境友好型的有效水处理的方法。
[0015] 在本发明的第五方面，本发明提出了一种抑制赤潮藻生长的方法。根据本发明的 实施例，在所述赤潮藻生长的环境中，添加前面所述的阴沟肠杆菌。本发明实施例提出的抑 制赤潮藻生长的方法操作简单，利用赤潮藻类与微生物的共生关系，在抑制赤潮藻生长的 同时，不会给其他生物带来危害，不破会生态稳定，是一种环境友好型的有效抑制赤潮藻生 长的方法。
[0016] 在本发明的第六方面，本发明提出了一种抑制赤潮藻生长的试剂盒。根据本发明 的实施例，所述试剂盒包括:含有前面所述的阴沟肠杆菌。本发明实施例提出的试剂盒使用 方面、操作简单，利用赤潮藻类与微生物的共生关系，在抑制赤潮藻生长的同时，不会给其 他生物带来危害，不破会生态稳定，是一种环境友好型的有效抑制赤潮藻生长的试剂盒。
[0017] 在本发明的第七方面，本发明提出了一种制备群体感应信号提取物的方法。根据 本发明的实施例，所述方法包括:对前面所述的阴沟肠杆菌进行发酵处理，并收集上清液； 对所述上清液进行乙酸乙酯萃取处理，并收集有机相；以及对所述有机相进行旋转蒸发处 理，以便获得所述群体感应信号提取物。本发明实施例提出的制备群体感应信号提取物的 方法可有效提取阴沟肠杆菌分泌的群体感应信号分子，操作简便，准确性高。
[0018] 根据本发明的实施例，上述制备群体感应信号提取物的方法还可以进一步包括如 下附加技术特征至少之一：
[0019] 根据本发明的实施例，所述发酵处理是在30°C下进行48小时，在所述萃取处理中， 所述上清液与所述乙酸乙酯的体积比为1:1，并且所述萃取处理进行3小时。在上述发酵条 件以及萃取条件下，所得群体感应信号提取物的产量和纯度进一步提高。
[0020] 根据本发明的实施例，对所述上清液进行乙酸乙酯萃取处理之前进一步包括:对 所述上清液进行过滤处理。具体地，根据本发明的实施例，过滤处理采用的是孔径为0.22微 米的滤膜进行过滤。本发明实施例的过滤处理可将上清液中残留的阴沟肠杆菌细胞等杂质 去除，避免了残留的阴沟肠杆菌细胞等杂质对后续萃取处理的干扰，进一步提高了后续的 上清液乙酸乙酯萃取处理效率，进而进一步提高了群体感应信号提取物的产量和纯度。
【附图说明】
[0021] 图1是根据本发明实施例的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae.ST3的形态图；
[0022] 图2是根据本发明实施例的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae. ST3的16SrRNA的 编码基因的PCR电泳图；
[0023]图3是根据本发明实施例的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae.ST3的QS的检测结 果图；
[0024]图4是根据本发明实施例的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae.ST3的提取物的薄 层色谱(TLC)分析结果图；以及
[0025]图5是根据本发明实施例的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae.ST3所产QS化合物 的UPLC质谱鉴定结果图。
【具体实施方式】
[0026] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。
[0027] 阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae .ST3
[0028] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种阴沟肠杆菌。根据本发明的实施例，该阴 沟肠杆菌是发明人首次从海洋中分离和发现的，为细菌界（Bacteria)，变形杆菌门 (Proteobacteria)，γ -变形杆菌纲（Gammaproteobacterium)，肠杆菌目 (Enterobac ter ial es )，肠杆菌科(Enterobacter )，肠杆菌属(Enterobacter)菌株，于2016 年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其分类命名为阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae， 保藏编号为CGMCC No. 12206。在本发明中，该阴沟肠杆菌被命名为阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae. ST3,该阴沟肠杆菌具有产QS(群体感应信号）的能力，经检测该QS 是一种高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactone，AHL)，QS是细菌间存在独特的语言通 讯方式，这种信号可实现种内传递（inter-transfer)和种间传递（intra-transfer )，在微 生物之间，QS可引发微生物一系列的生理生化反映，表现出群体的生态行为，进而阴沟肠杆 菌可通过QS语言通讯，达到一定的生物量以抵抗赤潮藻的生长，且菌自身具有抑藻的功能， 可以用来抑制赤潮。根据本发明的实施例，该细菌具有的优点总结如下：1)发明人筛选的该 抑藻细菌来自赤潮发生的海域，利于重新投放到自然环境中使用;2)该菌具有产QS能力，具 有群体感应能力，是一种环境适应性较强的菌;3)应用该藻类治理赤潮、处理含有赤潮藻的 水样以及抑制赤潮藻生长遵循了生物"生物相生相克"的原理，不会产生二次污染，是一种 环境友好型的有效方法。
[0029] 阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae .ST3的用途
[0030] 在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的阴沟肠杆菌在下列至少之一中的 用途:治理赤潮;处理含有赤潮藻的水样；以及抑制赤潮藻生长。本发明所提出的阴沟肠杆 菌具有群体感应能力，能调节自身密度形成竞争优势，进而在上述治理赤潮、处理含有赤潮 藻的水样以及抑制赤潮藻生长中具有极其显著的效果。
[0031] 根据本发明的实施例，所述治理赤潮、处理含有赤潮藻的水样以及抑制赤潮藻生 长是通过包括降低赤潮藻密度、降低赤潮藻的叶绿素含量和降低赤潮藻的光合效率的至少 之一实现的。根据本发明的实施例，阴沟肠杆菌的存在使藻产生了应激压力，藻类自身的能 量被用于应对环境胁迫，从而降低了其对光能捕获的能力，从而本发明实施例的阴沟肠杆 菌可显著降低赤潮藻的密度、叶绿素含量或光合效率，进而显著抑制赤潮藻的生长，本发明 实施例的阴沟肠杆菌用于治理赤潮、处理含有赤潮藻的水样以及抑制赤潮藻生长，效果显 著提高。
[0032] 治理赤潮的方法
[0033]在本发明的第三方面，本发明提出了一种治理赤潮的方法。根据本发明的实施例， 所述方法包括：向生长有赤潮藻的海洋中投放前面所述的阴沟肠杆菌，由于前面所述的阴 沟肠杆菌具有密度感知能力，能调节自身生物量，在共生环境中形成竞争优势，进而向生长 有赤潮藻的海洋中投放前面所述的阴沟肠杆菌，能有效抑制赤潮藻的生长，是一种有效治 理赤潮的方法。根据本发明的具体实施例，发明人做了阴沟肠杆菌抑制赤潮藻生长的一系 列平行实验，发现阴沟肠杆菌在1. 〇 X 1〇3细胞/mL-1.0 X 105细胞/mL的条件下对藻细胞的杀 灭作用呈现剂量关系，随着浓度的提高杀灭效果更显著，第六天杀灭率达80%以上，抑藻效 果达到峰值，进而发明人根据阴沟肠杆菌对藻细胞杀灭作用的剂量依赖关系，确定在具体 地治理赤潮过程中，阴沟肠杆菌的有效投放量。相比现有的质治理赤潮的技术，如物理方法 中的黄泥浆絮凝法需要较大的剂量才能起到抑制的效果，这在一定程度上增加了操作的难 度和成本的投入，如化学方法中的杀藻剂，在杀灭藻类的同时，也给其他生物带来了直接或 间接的危害，不能体现环境友好型特性，如生物学方法中的投放摄食藻类的大型生物(鱼 类），存在打破食物网结构，破坏生物网稳定的生态风险。本发明实施例提出的治理赤潮的 方法成本低、操作简单，利用藻类与微生物的共生关系，在杀灭藻类的同时，不会给其他生 物带来危害，不破会生态稳定，是一种环境友好型的有效治理赤潮的方法。
[0034]根据本发明的具体实施例，所述赤潮藻为条纹悬沟藻。本发明实施例提出的方法 用于对条纹悬沟藻形成的赤潮的治理效果显著提高。
[0035] 水处理方法
[0036]在本发明的第四方面，本发明提出了一种水处理方法。根据本发明的实施例，所述 方法包括:向含有赤潮藻的水样中添加前面所述的阴沟肠杆菌。根据本发明的具体实施例， 阴沟肠杆菌的浓度在1 .〇 X 1〇3细胞/mL-1.0 X 105细胞/mL的条件下，可显著抑制水样中的赤 潮藻。本发明实施例提出的水处理的方法成本低、操作简单，利用赤潮藻类与微生物的共生 关系，在杀灭藻类的同时，不会给其他生物带来危害，不破会生态稳定，是一种环境友好型 的有效水处理的方法。
[0037] 抑制赤潮藻生长
[0038] 在本发明的第五方面，本发明提出了一种抑制赤潮藻生长的方法。根据本发明的 实施例，在所述赤潮藻生长的环境中，添加前面所述的阴沟肠杆菌。根据本发明的具体实施 例，本发明实施例的赤潮藻的生长环境为人工培育体系，本发明实施例的人工培育体系的 培养液为f/2培养液，f/2培养液具体配方如下(每升海水中含无机盐质量）：NaN0 3 37.5mg， NaH2P〇4 2.5mg，Fe-EDTA 2.5mg(FeCl3 1.6g+EDTA 0.9g)，盐酸硫铵素5yg,Biotin VH 0.025yg,VB12 0.025yg，CuS〇4.5H20 0.0098yg，ZnS〇4.7H20 0.022yg，CaCl2.6H20 O.Olyg, MgCl2.4H2〇 0.180yg, Na2Mo〇4 ·2Η2〇 0.0063yg，添加的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae. ST3)在上述人工培育体系中的终浓度具体为1.0 X 103细胞/mL-1.0 X 105细胞/mL， 阴沟肠杆菌在上述浓度下，对藻类的生长具有显著抑制作用。本发明实施例提出的抑制赤 潮藻生长的方法操作简单，利用赤潮藻类与微生物的共生关系，在抑制赤潮藻生长的同时， 不会给其他生物带来危害，不破会生态稳定，是一种环境友好型的有效抑制赤潮藻生长的 方法。
[0039]抑制赤潮藻生长的试剂盒
[0040] 在本发明的第六方面，本发明提出了一种抑制赤潮藻生长的试剂盒。根据本发明 的实施例，所述试剂盒包括:含有前面所述的阴沟肠杆菌。本发明实施例提出的试剂盒使用 方面、操作简单，利用赤潮藻类与微生物的共生关系，在抑制赤潮藻生长的同时，不会给其 他生物带来危害，不破会生态稳定，是一种环境友好型的有效抑制赤潮藻生长的试剂盒。
[0041] 制备群体感应信号提取物的方法
[0042] 在本发明的第七方面，本发明提出了一种制备群体感应信号提取物的方法。根据 本发明的实施例，所述方法包括:对前面所述的阴沟肠杆菌进行发酵处理，并收集上清液； 对所述上清液进行乙酸乙酯萃取处理，并收集有机相；以及对所述有机相进行旋转蒸发处 理，以便获得所述群体感应信号提取物。本发明实施例提出的制备群体感应信号提取物的 方法可有效提取阴沟肠杆菌分泌的群体感应信号分子，操作简便、提取效率高、准确性好。 [0043]根据本发明的实施例，上述的发酵是在2216E海水液体培养基中进行的，2216E海 水液体培养基的配方是：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，陈海水1000mL，调pH至 7.8，并且所述发酵处理是在30°C下进行48小时，上述收集上清液是通过离心进行的，所述 离心的转速为1〇〇〇〇1'/111；[11，离心的时间为101]1；[11，离心半径为13.50]1 ;在所述萃取处理中，所 述上清液与所述乙酸乙酯的的体积比为1:1，并且所述萃取处理进行3小时。在上述发酵条 件以及萃取条件下，所得群体感应信号提取物的产量和纯度进一步提高。
[0044]根据本发明的实施例，对所述上清液进行乙酸乙酯萃取处理之前进一步包括:对 所述上清液进行过滤处理。具体地，根据本发明的实施例，过滤处理采用的是孔径为0.22微 米的滤膜进行过滤。本发明实施例的过滤处理可将上清液中残留的阴沟肠杆菌细胞等杂质 去除，避免了残留的阴沟肠杆菌细胞等杂质对后续萃取处理的干扰，进一步提高了后续的 上清液乙酸乙酯萃取处理效率，进而进一步提高了群体感应信号提取物的产量和纯度。 [0045]根据本发明的实施例，对所述有机相进行旋转蒸发处理去除乙酸乙酯后，所得群 体感应信号提取物溶解在甲醇中。所得群体感应信号提取物的纯度进一步提高，群体感应 信号提取物溶解在甲醇中稳定性高。
[0046]下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0047]在以下实施例中，f/2培养液具体配方如下（每升海水中含无机盐的质量）：NaN03 37.5mg，NaH2P〇4 2.5mg，Fe_EDTA 2.5mg(FeCl3 1.6g+EDTA 0.9g)，盐酸硫钱素5yg,Biotin VH 0.025yg,VB12 0.025yg,CuS〇4.5H20 0.0098yg,ZnS〇4.7H20 0.022yg,CaCl2.6H20 Ο.ΟΙμ g，MgCl2.4H2〇 0· 180yg，Na2Mo〇4.2H2〇,0.0063yg。
[0048] 条纹悬沟藻(Gyrodinium instriatum)(由赤潮水样中分离）。
[0049] 实施例1菌株的筛选、鉴定及特性
[0050] 一、菌株的筛选
[0051] 2015年8月21日，南中国海近岸发生局域赤潮（深圳盐田港，表层海水区），此次赤 潮的原因藻为混合藻类，优势物种包括条纹悬沟藻(Gyrodinium instriatum)，米氏凯伦藻 (1^代]11&11111<:;[1]1〇1:〇；0和维状斯氏藻（3(31^口口81611&1：1'〇(311〇1(16&)。从该区域取回水样，水 样带回实验室后经纱布过滤，除掉水中杂质和大型颗粒物;随后经100μπι金属网格过滤，除 掉水中碎肩;最后经?ομπι滤膜过滤除去藻细胞，滤液进行涂布和筛菌。
[0052] 将上述准备好的滤液进行倍比稀释，分别取20yL涂布于2216Ε海水固体培养基上 (配方:蛋白胨5 · 0g，酵母膏1 · 0g，磷酸铁0 · 01g，陈海水1000mL，琼脂20g，调pH至7 · 8)，过夜 培养，直至长出清晰的单克隆。共挑选出300株可培养细菌。
[0053]随后挑取单克隆在2216E液体培养基中（lmL)，摇床上30°C培养12小时，备用。将挑 选的单克隆菌株以1 X 1〇3个/mL至1 X 105个/mL的量加入条纹悬沟藻培养液(将条纹悬沟藻 在f / 2培养液中培养得到的培养液）中作为实验组，连续监测两周内对藻类生长的抑制情 况，以不加入单克隆菌株为对照组，在双筒显微镜下计数(4X10倍)检测藻密度，每个样品 计数3次，结果取平均值。实验结果显示（以IX 105个/mL组为例），添加菌液48小时后即能抑 制藻类的生长，96小时后实验组的藻细胞密度下降为对照组的43.47%，至144小时实验组 的藻类基本停止生长，80%以上的藻类生长被抑制，藻类生物量与对照组相比显示极显著 差异(Ρ〈0·01)。
[0054]因此，认为初步筛选得到菌株(ST3)。
[0055] 二、菌株(ST3)的鉴定
[0056] 1、形态特征
[0057]采用2216Ε固体培养基，将纯化后的菌株(ST3)的单克隆菌株于30°C下培养24h，并 进行革兰氏染色及菌体形态的电镜观察（放大倍数20000-60000倍）。染色方法参照《微生 物学检验实验指导》的方法进行(作者:桂芳，出版社：中国医药科技出版社，出版时间：2009 年8月，ISBN: 9787506742238)。实验结果如图1所示，结果显示菌株为革兰氏阴性菌;形态为 两端钝圆的棒状菌，周身分布纤毛，菌体中间有一处浅的凹陷，菌体大小为(0.3~0.4) X (1 · 5~2·0)ym〇
[0058] 2、分子鉴定
[0059] 提取菌株(ST3)的DNA，利用细菌16SrRNA通用引物(正向引物如SEQ ID Ν0:1所示， 反向引物如SEQ ID NO:2所示）。
[0060] AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID N0：l)〇
[0061] CTGAGCCAGGATCAAACTCT(SEQ ID N0：2)〇
[0062] 扩增出PCR产物即为16SrRNA的编码基因，将PCR产物进行电泳检测，结果如图2所 示，将得到条带大小为1500bp的产物送去测序，测序结果显示PCR产物（16SrRNA的编码基 因）具有SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
[0063] CAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGA TAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCG GATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGA TGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG CAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGA TAAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATC CCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAG CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCT TGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAA TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACA TCCAGAGAACTTAGCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT GTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCA AAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCT TACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAA AGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATG CCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGTTAG CTTAACCTTCGGGAGGGCGCTACCAT(SEQ ID N0：3)〇
[0064] 经序列比对后发现，菌株（S T 3 )的1 6 S r R N A的编码基因与变形杆菌门 (Proteobacteria) ; γ -变形杆菌纲（Gammaproteobacterium)，肠杆菌目 (Enterobacteriales)，肠杆菌科（Enterobacter)，阴沟肠杆菌属（Enterobacter cloacae.)的16SrRNA的编码基因有99%的相似性(GenBank:WP_017692678.1)。因此上述菌 株(ST3)为变形杆菌门（Proteobacteria)，γ -变形杆菌纲(Gammaproteobacterium)，交替 单胞菌目（Alteromonadales)，肠杆菌目（Enterobacteriales)，肠杆菌科(Enterobacter)， 阴沟肠杆菌属(Enterobacter cloacae.)
[0065] 实施例2菌株产QS能力的检测
[0066] 1.阴沟肠杆菌菌株的制备。将鉴定的阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae . ST3在 1 · 5毫升的eppendof管中的培养6~8小时，eppendof管装液量为0 · 5毫升，培养基为LB液体 培养基(培养基配方为:胰蛋白胨l〇g，酵母提取物5g，NaCl 10g，调pH至7.0。用去离子水定 容至1L。在15psi高压下蒸汽灭菌20min)。培养好的菌液经可见光分光光度计检测其浓度， 其浓度值大约为〇D 6QQ = 0.3。该制备的菌液置于4 °C冰箱备用。
[0067] 2.检测菌株的制备及检测。用特异性检测QS的报告菌株（根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens，A136)对阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae · ST3所产的QS进 行检测。检测方法如下：先将A136菌株加入LB半固体培养基(培养基配方为:胰蛋白胨10g， 酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂0.5克，调pH至7.0。用去离子水定容至1L)制成终浓度为IX 106个/mL的平板;随后将直径为4毫米的白色滤纸片置于平板上;再将2μ1 20mg/mL的X-gal (5-溴-4-氯-3-Π 引噪-β-D-半乳糖苷）点加到滤纸片上；最后在滤纸片上点上阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae · ST3)(点样量为2μ1)，于30°C培养12小时以上。根据滤纸片上有无 蓝色圈存在判断阴沟肠杆菌菌株Enterobacter cloacae.ST3是否具有QS生产能力。实验结 果如图3所示，图中箭头A所示为空白对照，箭头C为阴性对照，箭头B为阳性对照（菌株 ATCC31532)，其余箭头为待检菌株，其中带红圈的为菌株Enterobacter cloacae.ST3。根据 实验显色结果来看，结果显示为阳性，从而判断阴沟肠杆菌菌株Enterobacter cloacae · ST3具有QS的生产能力。
[0068] 3.产物的鉴定。用色谱技术(TLC薄层色谱和超高效液相色谱UPLC)进行QS产物的 鉴定。TLC薄层色谱检测方法如下所述:将AHL标准品(C4，C6和C8)2~3μ1点样于C18反相薄 层板上，以甲醇/水(60:40，v/v)作为流动相充分展开后，挥干溶剂，用冷却到45°C左右的 100mL半固体培养基与6mL A136菌株混合，轻轻摇勾后铺板，制备成厚度约为3-4mm的薄层 培养基，于室温冷却凝固。随后，用灭菌硬质胶板托起整张凝固好的薄层培养基，一端轻轻 接触TLC板，缓慢覆盖，以类似手机贴膜的方式向前平铺，直至整张培养基完好贴合于TLC板 上方，操作过程注意排除气泡。最后，待贴合过程完成后，用1〇〇μ1浓度为2〇yg/yl的x-gal均 匀涂步于培养基上方(使用微生物涂布棒）。待x-gal液体风干后，置于28 °C培养箱，24~48h 后观察结果。不同侧链的AHLs经薄层层析展开后，在有AHLs存在的区域，上层的报告菌感应 到，并在X-gal存在的情况下呈现蓝色斑点。根据斑点的大小、位置、迀移率和颜色深浅可以 定性AHLs的相对含量及其类别。鉴定结果如图4所示，其中，泳道1为QS化合物标准品，泳道2 为阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae. ST3的提取物（点样2μ1 )，从图中可看出，阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae.ST3的提取物显示为蓝色，最接近的为C8类分子。
[0069]另外，UPLC方法如下所述:在UPLC仪器(购自Waters，美国）上进行进样分析，检测 参数为:流速〇. 3mL/min，检测波长201nm，检测温度30度，检测时间10分钟。检测结果如图5 所示，提取物中C8峰在出峰时间（l.Ominute)有很好的吻合，显示阴沟肠杆菌菌株 Enterobacter cloacae · ST3的提取物为C8类AHL信号。
[0070] 实施例3阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae·ST3在抑藻中的应用
[0071] -、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae .ST3抑藻的方法
[0072] 1、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae.ST3的高密度培养
[0073] 将由实施例1得到的阴沟肠杆菌菌株Enterobacter cloacae · ST3在50mL三角瓶中 进行一级培养（2216E液体培养基，配方：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，陈海水 1000mL，调pH至7.8)，培养条件为30 °C，转速200r/min，时间6h，待菌株密度接近0D6QQ = 0.5 时，转入250mL三角瓶中进行二级培养。继续培养18小时，至菌株密度达到1 X 109个/mL浓度 时，备用。
[0074] 2、实验用藻细胞的培养
[0075]实验所用藻种为条纹悬沟藻(Gyrodinium instriatum)。取实验室传代培养的藻 种(初始密度为0.2 X 103个/mL)，分装于15个250mL的三角瓶中（每瓶装液100mL)，分装后培 养并连续监测，待藻处于对数生长期前期时，即藻密度在Ο . 5 X 103个/mL(藻在藻培养液中 的密度)时，进行如下分组试验，试验设五个实验组，每组3个平行。
[0076] 藻的培养条件如下:温度为20°C，光照时间L:D = 12h: 12h，光照强度3000LX。
[0077] 五个实验组分别如下：
[0078] 空白组(不含阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae · ST3菌液、不含用于菌株培养的 培养基），继续培养；
[0079] 对照组(含用于菌株培养的培养基，不含阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae. ST3 菌液），培养液的终浓度为0.05% (v/v)，继续培养；
[0080] 菌密度1.0X103个/mL组：向三角瓶中加上述1得到的细菌培养液，使细菌密度的 终浓度为1. 〇 X 1〇3个/mL，继续培养；
[0081] 菌密度1.0X104个/mL组：向三角瓶中加上述1得到的细菌培养液，使细菌密度的 终浓度为1. 〇 X 1〇4个/mL，继续培养；
[0082]菌密度1.0X105个/mL组：向三角瓶中加上述1得到的细菌培养液，使细菌密度的 终浓度为1. 〇 X 1〇5个/mL，继续培养。
[0083]将上述各组加入各种物质，记作继续培养的第0天。（将各种物质加好后，进入培养 程序的时间设定为第0天）。
[0084]二、检测
[0085] 1、细菌的添加对藻的抑制效果
[0086]将上述5组培养产物在双筒显微镜下(4X10倍)进行藻细胞计数，每个样品计数3 次，结果取平均值。
[0087] 结果发现在空白组和对照组中，藻细胞均匀分布，藻培养液较为清澈;而当有高浓 度阴沟肠杆菌菌株Enterobacter cloacae. ST3加入时，培养到4~6天时，藻细胞培养液开 始呈现混浊状、部分藻细胞溶解、沉底。
[0088] 表1为不同剂量细菌对藻密度影响的统计数据。
[0089] 表1
[0090]
[0091] 备注表示差异显著(P〈0.05);#表示差异极显著(P〈0.01)。
[0092] 由表1可以看出，从0天显微镜检开始，阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae · ST3对 藻细胞的杀灭作用呈现剂量关系，随着浓度的提高杀灭效果更显著，第六天杀灭率达80% 以上，抑藻效果达到峰值。
[0093] 2、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae .ST3对亚历山大藻叶绿素和光合效率的影 响
[0094] 检测上述5组继续培养的藻的叶绿素、光合效率，各组赤潮藻的叶绿素和光合效率 测量采用浮游植物分类荧光仪(PHYTO-ΡΑΜ)进行。具体操作如下所述，取3ml藻液(连续培养 的培养产物)装入测量杯置于暗盒内，对藻体进行20min暗适应，打开Phyto-PAM调制脉冲荧 光仪，调至波长为520nm强度为0. lymol/(m2 · s)的绿色检测光。测量过程由Phytowin软件 控制，开启测量光（ML)，待光信号稳定后打开饱和脉冲键，记下Fv/Fm值，即为光合效率 yield值。叶绿素水平的(Chi)测定也使用该仪器进行。
[0095] 阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae. ST3对条纹悬沟藻叶绿素含量的影响如表2所 不。
[0096] 表 2
[0097]
[0098] 备注:*表示差异显著(P〈0.05);#表示差异极显著(P〈0.01)。
[0099] 由表2可以看出，高剂量菌浓(菌密度1.0X105个/ml组)相比于对照组，从第4天开 始，其叶绿素水平明显低于对照组，其值只有对照组的15.5~33.6% (P〈0.05)。
[0100] 阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae . ST3对条纹悬沟藻光合效率的影响如表3所 不。
[0101]表3
[0102]
[0104] 备注:*表不差异显著(P〈0 · 05);林表不差异极显著(P〈0 · 01)。
[0105] 由表3结果可以看出，外源添加高剂量的细菌（105个/ml)，藻细胞光合效率水平较 低，而对照组则有一个明显的上升过程。
[0106] 综上阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae. ST3对赤潮藻叶绿素含量和光合效率的 影响的结果，表明：阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae.ST3的存在使藻的生理产生了应激 压力，藻类自身的能量被用于应对环境胁迫，从而降低了其对光能捕获的能力。
[0107] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。
[0108] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，于2016年3月11日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC12206。2. 权利要求1所述的阴沟肠杆菌在下列至少之一中的用途： 治理赤潮； 处理含有赤潮藻的水样；以及 抑制赤潮藻生长。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述治理赤潮、处理含有赤潮藻的水样以 及抑制赤潮藻生长是通过包括降低赤潮藻密度、降低赤潮藻的叶绿素含量和降低赤潮藻的 光合效率的至少之一实现的。4. 一种治理赤潮的方法，其特征在于，包括： 向生长有赤潮藻的海洋中投放权利要求1所述的阴沟肠杆菌。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述赤潮藻为条纹悬沟藻。6. -种抑制赤潮藻生长的方法，其特征在于，在所述赤潮藻生长的环境中，添加权利要 求1所述的阴沟肠杆菌。7. -种抑制赤潮藻生长的试剂盒，其特征在于，包括： 含有权利要求1所述的阴沟肠杆菌。8. -种制备群体感应信号提取物的方法，其特征在于，包括： 对权利要求1所述的阴沟肠杆菌进行发酵处理，并收集上清液； 对所述上清液进行乙酸乙酯萃取处理，并收集有机相；以及 对所述有机相进行旋转蒸发处理，以便获得所述群体感应信号提取物。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵处理是在30°C下进行48小时， 在所述萃取处理中，所述上清液与所述乙酸乙酯的体积比为1:1，并且所述萃取处理进 行3小时， 任选地，对所述上清液进行乙酸乙酯萃取处理之前进一步包括:对所述上清液进行过 滤处理。
【文档编号】C02F3/34GK106085896SQ201610308236
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】周进
【申请人】清华大学深圳研究生院