一种耐贫氧的乳糖酶酵母菌株及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐低氧的乳糖酶酵母菌株，保藏编号为CCTCC NO:M2016252。本发明还公开了该菌株的构建方法：将透明颤菌血红蛋白胞内表达载体与乳糖酶分泌表达载体依次转入毕赤酵母，并筛选乳糖酶活性高的菌株而得到。本发明构建的菌株可用于高密度发酵制备重组乳糖酶蛋白，通过胞内合成血红蛋白（VHB）提高细胞对氧气的利用率，促进细胞在贫氧条件下的生长，从而提高胞外重组乳糖酶的表达产量。CCTCC NO：M201625220160506
【专利说明】
一种耐贫氧的乳糖酶酵母菌株及其构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种耐贫氧的乳糖酶酵母菌株及其构建方法，尤其涉及将透明颤菌血 红蛋白基因与乳糖酶基因同时转入毕赤酵母菌株，提高菌株的耐贫氧能力及乳糖酶产量， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳糖酶（Lactose)学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶（0-〇1&1&〇1:〇81(1〇-galatohydrolase，EC3.2.1.23)，既能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，又具有转糖苷作用。 在医药领域可用于治疗"乳糖不耐受症"，在食品领域可用于低乳糖牛奶及其它低乳糖乳制 品的制备，具有极尚的应用价值。
[0003] 自然界的乳糖酶大多源于微生物，如细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等。目前来自乳 酸克鲁维酵母及米曲霉的乳糖酶已实现商品化，但是前者为胞内酶，提取纯化困难;后者产 量低，诱变后的产量有所提高，从5U/ml提高到50U/ml(Berka et al，US Patent 5736384， 1998)，利用基因工程技术将乳糖酶基因克隆并转入米曲霉菌株，使乳糖酶发酵产量提高到 500U/ml，仍无法满足生产的要求。随着研究的深入，将克隆的乳糖酶基因转入表达宿主进 行异源表达可大幅度提高酶蛋白产量。陈卫等人将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的乳糖酶记忆 转入大肠杆菌表达系统，采用IPTG诱导成功表达出重组乳糖酶蛋白，产量为出发菌株的50 倍(陈卫等，生物技术(2002)，12:8-11);范云六、姚斌等人构建的产乳糖酶毕赤酵母基因 工程菌株，在3L发酵罐中发酵168小时，产乳糖酶6 mg/mL(范云六等，中国专利CN1233826C， 2005);本实验室构建的一株毕赤酵母基因工程菌株，采用50L发酵罐发酵96小时，产乳糖酶 达7mg/mL以上，为目前文献报道的最高产量（Zhao Q et al，Appl Biochem Biotechnol (2014) 172: 2787-2799)。由于毕赤酵母表达乳糖酶的优点，在2014年颁布的《中国食品添 加剂使用标准》中(GB2760-2014)，毕赤酵母成为新的乳糖酶蛋白制备菌株。
[0004] 为了进一步提高乳糖酶的产量，降低大规模制备的生产成本，研究人员对毕赤酵 母基因工程菌株高密度发酵条件进行优化，发现溶氧过低是阻碍乳糖酶产量的瓶颈因素。 随着酵母细胞的生长，发酵罐中的溶氧水平迅速降低，发酵初期溶氧为80%_100%，补料过程 开始后的几个小时则迅速降低为20%以下，这说明高密度发酵中后期对酵母细胞供氧严重 不足。毕赤酵母属于好氧微生物，贫氧的环境严重影响着菌体的生长，从而影响目的产物的 积累。在采取提高转速、增大通气量及改变搅拌方式等措施都不能有效改善这种弊端的情 况下，提高菌株自身的耐贫氧能力则成为解决溶氧过低，提高目的蛋白产量的一条重要途 径。产乳糖酶的酵母基因工程菌株的构建及应用虽已被报道，但是能耐贫氧的乳糖酶菌株 未见报道。
[0005] 透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin,VHb)是来源于透明颤菌的一种氧 调节蛋白，能特异性的结合氧气，并尚速释放，提尚细胞对氧气的利用率，维持细胞在贫氧 条件下的正常生长。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种耐贫氧的乳糖酶酵母菌株及其构建方法。
[0007] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 耐贫氧的乳糖酶酵母菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC N0: M2016252,保藏时间为2016年5月6日，地址为中国.武汉.武汉大学，分类命名为：巴斯德毕 赤酵母PP-vgb-gal(PicAia jOasiioris PP-vgb-gal)。
[0008] 耐贫氧的乳糖酶酵母菌株构建方法为:克隆透明颤菌血红蛋白vgb基因并插入质 粒PPIC9中BamHI和EcoRI位点之间（切去质粒自带信号肽α-factor序列)得到vgb胞内表达 载体，转化酵母宿主，得到vgb-重组酵母;将乳糖酶lac基因插入质粒pPICZaA中Xhol和Xbal 位点之间得到乳糖酶分泌表达载体，转化vgb-重组酵母，筛选乳糖酶活性高的菌株即为耐 贫氧的乳糖酶酵母菌株。
[0009] 上述构建方法中，所述的透明颤菌血红蛋白vgb基因具有如序列1所示的核苷酸序 列，乳糖酶lac基因来源于米曲霉，具有如序列2所示的核苷酸序列。所述的酵母菌株为毕赤 酵母菌株GS115重组菌株。
[0010] 序列 1 ATGTTAGACCAGCAAACCATTAACATCATCAAAGCCACTGTTCCTGTATTGAAGGAGCATGGCGTTACCATTA CCACGACTTTTTATAAAAACTTGTTTGCCAAACACCCTGAAGTACGTCCTTTGTTTGATATGGGTCGCCAAGAATCT TTGGAGCAGCCTAAGGCTTTGGCGATGACGGTATTGGCGGCAGCGCAAAACATTGAAAATTTGCCAGCTATTTTGCC TGCGGTCAAAAAAATTGCAGTCAAACATTGTCAAGCAGGCGTGGCAGCAGCGCATTATCCGATTGTCGGTCAAGAAT TGTTGGGTGCGATTAAAGAAGTATTGGGCGATGCCGCAACCGATGACATTTTGGACGCGTGGGGCAAGGCTTATGGC GTGATTGCAGATGTGTTTATTCAAGTGGAAGCAGATTTGTACGCTCAAGCGGTTGAATAA(SQE:ID:NO:1)〇
[0011] 序列2 ATGAAGCTCCTCTCTGTTGCTGCTGTTGCCTTGCTGGCGGCACAGGCAGCGGGTGCTTCCATCAAGCATCGTC TCAATGGCTTCACGATCCTGGAACATCCGGATCCGGCGAAAAGAGACTTGCTGCAAGACATTGTTACATGGGATGAC AAATCTCTGTTCATCAATGGAGAGAGGATTATGTTATTCAGCGGAGAAGTGCATCCTTTCAGATTGCCAGTACCTTC GCTTTGGCTTGATATCTTCCACAAGATCAGAGCTCTTGGTTTCAACTGTGTATCTTTCTATATTGATTGGGCTCTTC TGGAGGGAAAGCCTGGCGACTACAGAGCAGAAGGCATCTTTGCTCTGGAACCCTTCTTTGATGCAGCCAAGGAAGCA GGCATTTATCTGATCGCCCGCCCCGGTTCGTACATCAATGCCGAGGTCTCAGGCGGTGGCTTCCCTGGATGGTTGCA GAGGGTCAATGGCACTCTTCGCTCGTCTGATGAGCCATTCCTTAAAGCTACTGATAACTATATCGCCAATGCCGCTG CTGCCGTGGCGAAGGCTCAAATCACGAATGGAGGGCCAGTAATTCTCTACCAGCCCGAAAACGAATACAGCGGTGGC TGCTGCGGTGTCAAATACCCCGATGCAGACTACATGCAGTATGTTATGGATCAGGCCCGGAAGGCTGACATTGTTGT ACCTTTCATCAGCAACGATGCCTCACCTTCTGGGCACAATGCTCCTGGAAGTGGAACGAGCGCTGTTGATATTTATG GTCACGATAGCTATCCCCTCGGCTTTGATTGCGCAAACCCATCCGTATGGCCCGAGGGTAAACTGCCCGACAACTTC CGCACGCTCCATCTTGAGCAGAGCCCATCAACTCCGTATTCACTTCTTGAGTTCCAAGCGGGTGCTTTCGACCCATG GGGTGGACCCGGCTTTGAAAAATGCTATGCCCTCGTTAACCACGAATTCTCGAGAGTTTTCTATAGGAACGACTTGA GTTTCGGAGTTTCTACCTTTAACTTATACATGACTTTCGGCGGAACAAACTGGGGTAACCTCGGACATCCCGGTGGA TATACATCCTACGACTACGGATCGCCTATAACTGAAACGCGAAACGTTACGCGGGAGAAGTACAGCGACATAAAGCT CCTTGCCAACTTTGTCAAAGCATCGCCATCCTATCTCACCGCTACTCCCAGAAACCTGACTACTGGTGTTTACACAG ACACATCTGACCTGGCTGTCACCCCGTTAATTGGTGATAGTCCAGGCTCATTCTTCGTGGTCAGACATACGGACTAT TCCAGCCAAGAGTCAACCTCGTACAAACTTAAGCTTCCTACCAGTGCTGGTAACCTGACTATTCCCCAGCTGGAGGG CACTCTAAGTCTCAACGGACGTGACTCAAAAATTCATGTTGTTGATTATAATGTGTCTGGAACGAACATTATCTATT CGACAGCTGAAGTCTTCACCTGGAAGAAGTTTGACGGTAACAAGGTCCTGGTGTTATACGGCGGACCGAAGGAACAC CATGAATTGGCCATTGCCTCCAAGTCAAATGTGACCATCATCGAAGGTTCGGACTCTGGAATTGTCTCAACGAGGAA GGGCAGCTCTGTTATCATTGGCTGGGATGTCTCTTCTACTCGTCGCATCGTTCAAGTCGGTGACTTGAGAGTGTTCC TGCTTGATAGGAACTCTGCTTACAACTACTGGGTCCCCGAACTCCCCACAGAAGGTACTTCTCCCGGGTTCAGCACT TCGAAGACGACCGCCTCCTCCATTATTGTGAAGGCTGGCTACCTCCTCCGAGGCGCTCACCTTGATGGTGCTGATCT TCATCTTACTGCTGATTTCAATGCCACCACCCCGATTGAAGTGATCGGTGCTCCAACAGGCGCTAAGAATCTGTTCG TGAATGGTGAAAAGGCTAGCCACACAGTCGACAAGAACGGCATCTGGAGCAGTGAGGTCAAGTACGCGGCTCCAGAG ATCAAGCTCCCCGGTTTGAAGGATTTGGACTGGAAGTATCTGGACACGCTTCCCGAAATTAAGTCTTCCTATGATGA CTCGGCCTGGGTTTCGGCAGACCTTCCAAAGACAAAGAACACTCACCGTCCTCTTGACACACCAACATCGCTATACT CCTCTGACTATGGCTTCCACACTGGCTACCTGATCTACAGGGGTCACTTCGTTGCCAACGGCAAGGAAAGCGAATTT TTTATTCGCACACAAGGCGGTAGCGCATTCGGAAGTTCCGTATGGCTGAACGAGACGTATCTGGGCTCTTGGACTGG TGCCGATTATGCGATGGACGGTAACTCTACCTACAAGCTATCTCAGCTGGAGTCGGGCAAGAATTACGTCATCACTG TGGTTATTGATAACCTGGGTCTCGACGAGAATTGGACGGTCGGCGAGGAAACCATGAAGAATCCTCGTGGTATTCTT AGCTACAAGCTGAGCGGACAAGACGCCAGCGCAATCACCTGGAAGCTCACTGGTAACCTCGGAGGAGAAGACTACCA GGATAAGGTTAGAGGACCTCTCAACGAAGGTGGACTGTACGCAGAGCGCCAGGGCTTCCATCAGCCTCAGCCTCCAA GCGAATCCTGGGAGTCGGGCAGTCCCCTTGAAGGCCTGTCGAAGCCGGGTATCGGATTCTACACTGCCCAGTTCGAC CTTGACCTCCCGAAGGGCTGGGATGTGCCGCTGTACTTCAACTTTGGCAACAACACCCAGGCGGCTCGGGCCCAGCT CTACGTCAACGGTTACCAGTATGGCAAGTTCACTGGAAACGTTGGGCCACAGACCAGCTTCCCTGTTCCCGAAGGTA TCCTGAACTACCGCGGAACCAACTATGTGGCACTGAGTCTTTGGGCATTGGAGTCGGACGGTGCTAAGCTGGGTAGC TTCGAACTGTCCTACACCACCCCAGTGCTGACCGGATACGGGAATGTTGAGTCACCTGAGCAGCCCAAGTATGAGCA GCGGAAGGGAGCATAC(SQE: ID: NO:2)〇
[0012] 在上述构建方法中，利用AOX强启动子和终止子AOX TT控制vgb的转录和表达，比 传统的低氧诱导型启动子能更早的启动VHB蛋白的表达，更有利于重组菌株的生长;与已报 道的构建vgb和目的基因共转化质粒相比较，将vgb基因和lac目的基因分别转化毕赤酵母， 便于分别筛选单基因的高表达菌株，从而获得耐贫氧能力强且目的蛋白产量高的重组菌 株。
[0013] 耐贫氧的乳糖酶酵母菌株可用于重组乳糖酶制备过程，通过胞内合成血红蛋白 (VHB)提高细胞对氧气的利用率，促进细胞的生长，从而提高胞外重组乳糖酶的表达产量。 与现有的产乳糖酶酵母菌株相比，本发明构建的耐贫氧菌株更能适应发酵过程中的贫氧 (D0〈20%)环境，在摇瓶中表达的菌体量提高15%，乳糖酶产量提高30%。
【附图说明】
[0014] 图1 pPIC9-vgb重组载体构建图； 图2 pPICZaA-lac重组载体构建图； 图3 pPIC9-vgb转化大肠杆菌的PCR验证图 M: DNA 分子量标准从上到下依次为5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1 OOObp，750bp， 500bp，250bp; Lanel-9:重组质粒为模板的PCR扩增结果;LanelO: pPIC9空质粒为模板的PCR 扩增结果； 图4 pPICZaA-lac转化大肠杆菌的PCR验证图 M: DNA 分子量标准从上到下依次为 lOOOObp，8000bp，7000bp，6000bp，5000bp，4000bp， 3000bp，2000bp，lOOObp; Lane 1-12:重组质粒为模板的PCR扩增结果；Lane 13: pPICZaA空质 粒为模板的PCR扩增结果； 图5正常与低氧条件下的菌体生长； 图6正常与低氧条件下的酶活性。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0016] 实施例1耐贫氧的乳糖酶菌株构建 l)pPIC9-vgb重组载体的构建与酵母转化 根据已发表的vgb序列，设计上游扩增引物vgb-up: 5 ' -CGGGATCCAAACGATGTTAGACCAGCA AACCAT-3 ' 及下游扩增引物vgb-do: 5 ' -CGGAATTCTTATTCAACCGCTTGAGC-3 '，分别包含BamHI 及EcoRI限制性内切酶识别位点，以实验室包含vgb基因序列的重组质粒pSET152-vgb为模 板，按如下体系扩增vgb基因序列：10*PCR buffer with Mg2+ 5yl、10mM dNTP mix ΙμL、 pSET152-vgb template 0·5μ1、50mM vgb-up primer ΙμL、 50mM vgb-do primer lyl、PFU DNA Polymerase 0.5yl、dd water 41μ1，总体积为SOylePCR反应条件为：94°C变性30s，58 。(:复性 3〇8,72°(：延伸4〇8,30次循环，72°(：延伸1〇1^11。
[0017] PCR产物采用OMEGA Gel Extraction Kit(货号 D2500-02)回收，经过BamHI与 EcoRI内切酶消化后，与同样内切酶消化的pPIC9质粒在16°C连接（图1)，CaCl2法转化大肠 杆菌0耶€[感受态，挑取含311^1；[0;[11;[11(1001^/1111)的1^筛选平板上的单克隆，提取重组质粒 后，采用通用引物5'A0X Pimer和3'A0X TT Primer进行PCR扩增，以空pPIC9质粒为阴性对 照模板，阳性转化子能扩增出l000bp左右的条带(载体上500bp+vgb基因450bp)，阴性对照 扩增产物为500bp左右（图3)，验证正确的阳性转化子进行测序，确定插入序列的准确性。
[0018] 经过验证的重组载体采用StuI内切酶线性化，电击转化毕赤酵母GS115菌株，酵母 感受态制备及转化步骤参照说明书，在MD和MM筛选平板上筛选甲醇利用快型且转化子红色 较深的阳性转化子，提取重组酵母基因组，采用vgb-up和vgb-do进行PCR验证，插入序列正 确的转化子GS115-vgb可作为乳糖酶基因转化宿主。
[0019] 2)pPICZaA-lac重组载体的构建与酵母转化 根据NCBI发表的米曲霉乳糖酶基因序列，设计PCR扩增引物lac-up : 5 CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAG和lac-do: 5'- GCTCTAGATTAGTAAGCACCCTTTCTTTG -3'（分别 含XhoI和Xbal酶切位点），以米曲霉基因组为模板，进行PCR扩增，加样体系如下：10*PCR buffer with Mg2+ 5pK10mM dNTP mix ΙμΚ^. oryzae genome template 0.5yl、50mM lac-up primer lyl、50mM lac-do primer lyKPFU DNA Polymerase 0 · 5yl、dd water 41μ1，总体积为50μΚΡα?反应条件为:94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸3min，30次循 环，72°C 延伸 lOrnin。
[0020] PCR产物经凝胶回收试剂盒回收，采用Xhol和Xbal双酶切消化，与同样消化的 pPICZaA进行连接（图2)，转化大肠杆菌DH5a，挑取含Zeocin(25 μg/ml)的低盐LB平板上的 转化子单菌落，过夜培养后，提取重组质粒，以lac-up和lac-do引物进行PCR扩增，以空 pPICZaA质粒为阴性对照模板，阳性转化子能扩增出3000bp左右的目的条带（lac基因大 小），阴性对照无扩增产物条带（图4)及测序验证插入序列的正确性。
[0021] 验证正确的重组表达载体pPICZaA-lac经过SacI酶切线性化，电击转化GS115-vgb 重组菌株，在含Zeocin(100μg/ml-2mg/ml)的梯度筛选平板上，挑取抗zeocin浓度高的单菌 落进行PCR验证。
[0022] 3)重组酵母的筛选 挑取阳性单克隆，接种至l〇ml BMGY培养基中，30°C，250rpm振荡培养至0D=2-6，离心收 集菌体，接入20ml BMMY培养基中开始诱导表达，24小时后补加1%甲醇，48小时后停止表达， 测定培养基上清中的乳糖酶活性，单位酶活最高的一株即为耐低氧乳糖酶重组毕赤酵母工 程菌株，命名为GS115-vgb-lac 〇
[0023]实施例2摇瓶水平工程菌株耐低氧能力的测定 将工程菌株GS115-vgb_lac与实验室构建的不含vgb的乳糖酶重组酵母菌株GS115-lac 在摇瓶水平进行低氧耐受力的比较。两种菌均设两组摇瓶，一组为正常对照组，用6层纱布 封瓶口； 一组为低氧组，用PARAFILM膜封口。表达过程为:将-80°C保存的重组菌在YH)平板 上划线，30°C倒置培养2天，挑取单菌落至10 ml BMGY培养基中30°C，300 rpm培养至OD600= 2-6,离心，收集菌体，接入20ml BMMY培养基中，30°C，300 rpm进行诱导表达，每24小时添加 一次甲醇至初始浓度。96小时诱导结束，4°C离心去除菌体，测定上清中的乳糖酶活性。两株 菌的正常组菌体生长0D基本无差别，而低氧组中，整合了vgb基因的工程菌株生长明显好于 不整合的菌株（图5)，在96小时时，GS115-vgb-lac的0D600比GS115-lac提高了约15%，而酶 活提高了约30%(图6)，说明VHB蛋白的表达能促进菌体在低氧条件下的生长，提高细胞的产 酶能力，从而增加菌株的产酶量。相对于已发表文献报道的采用低氧诱导型启动子启动vgb 基因的表达，本发明采用的甲醇诱导型启动子A0X1能更早启动vgb基因的表达，从而获得更 高的目的蛋白产量。另外，与已发表文献报道的构建vgb和目的基因共转化质粒相比较，将 vgb基因和lac目的基因分别转化毕赤酵母，便于分别筛选单基因的高表达菌株，从而获得 耐贫氧能力强且目的蛋白产量高的重组菌株。
[0024]实施例3乳糖酶活性测定 1)标准曲线绘制 先配制0.2M NaAc-HAc buffer ρΗ5·2,0·2Μ NaAc-HAc buffer pH5.2,40umol/ml 邻 硝基苯β-D-半乳糖苷(o-NPG)，以及5% Na2C03溶液，按下表所示在试管中加样。
[0025]
[0026] 每个梯度做3管平行，以o-NP含量(umol)为横坐标，以A420为纵坐标，绘制标准曲 线。
[0027] 2)酶活测定 样品管:底物预热5min; 50ul适当稀释酶液+450ul预热底物，60°C反应lOmin;立即加 入500ul 5%Na2C03终止反应并显色；补加 2ml实验buffer至终体积3ml;测定A420。
[0028] 对照管:反应时不加酶液，在测定吸光度前补加酶液即可。
[0029]酶活单位定义：在60°C，pH5.2条件下，每分钟将邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（〇-NPG)水解产生lumol邻硝基酚(o-NP)所需的酶量，为一个酶活单位(1U)。
[0030] 酶活计算公式U/mL=x*稀释倍数/(0.05ml*10min)=x*2*稀释倍数。
【主权项】
1. 一种耐贫氧的乳糖酶酵母菌株，其特征是，所述菌株为毕赤酵母基因工程菌株，该菌 株保藏在武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M2016252,保藏时间为 2016年5月6日。2. -种权利要求1所述的耐贫氧的乳糖酶酵母菌株的构建方法，其特征是:克隆透明颤 菌血红蛋白vgb基因，并插入质粒pPIC9中BamHI和EcoRI位点之间，得到vgb胞内表达载体， 转化酵母宿主，得到vgb-重组酵母;将乳糖酶lac基因插入质粒pPICZaA中Xhol和Xbal位点 之间得到乳糖酶分泌表达载体，转化vgb-重组酵母，摇瓶中筛选贫氧条件下乳糖酶活性高 的重组菌株。
【文档编号】C12N15/81GK106085893SQ201610566211
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】刘飞, 钊倩倩, 张秀华, 朱希强, 侯重文, 袁超
【申请人】山东省药学科学院