一种水解乳蛋白及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供一种水解乳蛋白的制备方法，在酪蛋白水溶液中加入胰酶，在100～150MPa、40～50℃下酶解4～24h后，终止酶解反应，再将酶解产物进行后处理，得到水解乳蛋白。本发明还提供应用该方法制备得到的水解乳蛋白及其应用。应用本发明的方法所得产物的分子量小于10 kDa，并富含氨基酸和多肽，具有生物活性，适用于细胞培养，能够作为低血清或无血清培养基的添加剂，广泛应用于食品营养、制药、保健食品和细胞培养领域中。
【专利说明】
一种水解乳蛋白及其制备方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种水解乳蛋白及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 水解乳蛋白是一种重要的蛋白水解物，是乳蛋白经蛋白酶或肽酶水解的产物，含 有丰富的氨基酸和多肽，可为细胞生长提供多种营养成分、贴壁因子及生长因子类似物等， 广泛用于生物制药、疫苗、食品等行业。Eagle等20世纪50年代将水解乳蛋白用于细胞 和微生物培养基，随后Mam 〇rU，Ami〇t等分别将水解乳蛋白用于皮肤、器官等多种细胞的培 养。我国学者张尔贤于1986年从原料、酶制剂及产品检测等多个角度探讨了细胞培养用水 解乳蛋白的研制过程。目前国内水解乳蛋白主要以美国Hyclone和Gibco产品为主，开发 水解乳蛋白在国内具有广阔的市场前景。国外只有美国Gibco和Hyclone两家公司利用牛乳 生产水解乳蛋白，产品远销欧、美、亚等国家。国内水解乳蛋白的生产为空白，几乎所有科研 与生产用户都依赖进口产品，进口产品价格昂贵，大大增加了运营成本。
[0003] 酪蛋白，是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的凝乳，是牛奶中的主要蛋白 质，占总蛋白的80%。根据其一级结构和翻译后修饰的程度和类型不同，其酪蛋白的组成也 有所不同。主要由asl-、asl-、i3-和K-四种类型的酪蛋白组成，这四种酪蛋白的分子量分别 是asl-分子量为23KD, asl-分子量为25KD, β-酪蛋白的分子量为24KD，k-酪蛋白的分子量 为19KD。酪蛋白在乳体系中的主要生理作用是新生牛生长所需氨基酸的主要来源。因此，酪 蛋白成为一种重要的蛋白水解物的前体。根据其氨基酸序列大小的不同，其在生物体内或 体外具有免疫调节、抑制细菌和病毒、抗癌、抗氧化和清除自由基、改善元素吸收等生理功 能和作用。从而作为酪蛋白磷酸肽(〇386；[11卩110 8。11(^6。1^(168，0??8)、血管紧张素转化酶 (Angiotensin converting enzyme, ACE)抑制肽、抗氧化肽（antioxidant peptide)和水 解乳蛋白（Lactoalbumin hydrolysate, LH)等生物活性肽的原材料。Cruz-Huerta E等采 用胰蛋白酶水解酪蛋白分离了CPPs; Solieri L等采用乳酸菌发酵法从酪蛋白中分离了ACE 抑制肽;Xie NN等采用碱性蛋白酶水解酪蛋白分离了抗氧化肽。
[0004] 目前，水解乳蛋白的制备方法主要有酸水解法，碱水解法和酶水解法。在生物技术 领域中蛋白质的水解方法主要以酶解法为主。
[0005] 酸水解法:Braconnot在1820年第一次报道。该方法主要是用在食品领域中，主要 是增加和改善食品的风味。在生物技术领域中只占一小部分。这是因为酸水解最常用的是 硫酸水解或盐酸水解，在蛋白质水解过程中，有一些必需氨基酸被破坏，例如色氨酸，蛋氨 酸，胱氨酸、半胱氨酸等，谷氨酰胺和天冬酰胺进一步的被转化为谷氨酸和天冬氨酸。更显 著的是酸水解破坏了蛋白质中的特有氨基酸或者短时间内破坏了大量的小分子肽。除此之 外，酸水解过程中盐含量显著的增加，脱盐等疑难问题在下游技术中需要解决。通常酸水解 的酪蛋白和大豆蛋白用于诊断和发酵培养基中。
[0006] 碱水解法:在生物技术领域中碱水解法使用很少，但在食品领域中，碱水解蛋白质 的方法被广泛使用，在水解过程中有些蛋白质被破坏。如丝氨酸和苏氨酸，但色氨酸是完整 的。
[0007] 酶水解法：目前有大量的动物、植物和微生物蛋白质可用多种酶进行酶解，并使用 于生物技术领域中，近几年，发酵产生的蛋白酶水解蛋白质技术被大量学者研究。酶解蛋白 质的主要优势是水解条件温和，制造商能够精确控制蛋白质水解物的水解度，从而满足不 同的用户。蛋白质水解常用的蛋白酶有动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物发酵的蛋白酶。动 物蛋白酶主要有胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等，植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶和菠萝蛋白 酶，还有细菌和真菌性蛋白酶属于微生物酶。蛋白质的水解可以用单酶来完成，也可以采用 多种酶连续水解的方法来完成。酶的选择经常依赖于蛋白质的来源和最终用户的要求。例 如，蛋白质中含有较高浓度的疏水性的氨基酸，在酶的选择是就要选择能够特异性水解疏 水性氨基酸的酶。但酶水解法由于酶的专一性，其水解效果差，水解不彻底。
【发明内容】
[0008] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种水解乳蛋白的制备方法，是 利用高压酶解酪蛋白制备得到的，所得到的水解乳蛋白适用于动物细胞培养，能够作为低 血清或无血清培养基的添加剂。
[0009] 本发明的第一个目的是提供一种水解乳蛋白的制备方法，在酪蛋白水溶液中加入 胰酶，在100~150MPa、40~50 °C下酶解4~24h后，终止酶解反应，再将酶解产物进行后处 理，得到水解乳蛋白。
[0010] 作为优选，所述酪蛋白水溶液中酪蛋白的质量百分含量为10%-15%; 作为优选，所述酪蛋白与胰酶的质量比为5:1。
[0011] 作为优选，所述胰酶为多酶复合物，主要成分是胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。
[0012] 作为优选，所述终止酶解反应是将酶解产物沸水浴15min。
[0013] 作为优选，所述将酶解产物进行后处理是将酶解产物离心、过滤、干燥(冷冻干燥 或喷雾干燥）;作为优选，所述干燥为喷雾干燥。
[0014] 作为优选，所述喷雾干燥是将滤液在进风温度160~180°C，出风温度为80~90°C 的条件下喷雾干燥，水分小于5%。
[0015] 本发明的第二个目的是提供应用上述的方法制备得到的水解乳蛋白。
[0016] 本发明的第三个目的是提供水解乳蛋白在细胞培养中的应用。
[0017] 作为优选，所述细胞为BHK-21。
[0018] 作为优选，所述应用的具体方法为： 将水解乳蛋白加入到培养细胞的培养基中，使水解乳蛋白的质量百分比浓度为〇.2%_ 0.5% 〇
[0019] 比如，将水解乳蛋白补充到|^^01^1^12、1^頂1640及欧氏液等构成的基础培养 基中，使水解乳蛋白的质量百分比浓度为〇.2%-〇. 5%，用于培养细胞，根据需要，可补充1-10%FBS〇
[0020] 本发明的第四个目的是提供一种细胞的培养方法，将水解乳蛋白加入到培养细胞 的培养基中，使水解乳蛋白的质量百分比浓度为〇. 2%-0.5%，对细胞按常规培养方法进行贴 壁或悬浮培养。
[0021] 比如，在MEM、DMEM基础培养基中添加0.2-0.5%的酪蛋白水解产物，根据需要可补 充1-10%FBS和部分生长因子，进行细胞的贴壁或悬浮培养。
[0022]应用本发明的方法所得产物的分子量小于10 kDa，并富含氨基酸和多肽，具有生 物活性，适用于细胞培养，能够作为低血清或无血清培养基的添加剂，广泛应用于食品营 养、制药、保健食品和细胞培养领域中。
[0023]本发明的水解乳蛋白的方法用时短，在酶解同时采用了超高压处理技术，超高压 技术是在超高压系统和一定的压力下通过改变蛋白质的结构从而改变了蛋白质本身的功 能。使用超高压协同酶解水解较酸、碱水解反应条件温和，水解彻底，水解率高。且本方法只 需要一步水解反应，不需要使用其它酶再次水解。本发明的主要目的是对现有牛乳和干酪 素产品进行科技创新，产业升级，酶解后所获得的生物活性肽不仅附加值高，安全性好，工 艺简单，而且容易进行产业化。
【附图说明】
[0024]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为本发明的水解乳蛋白的游离氨基酸检测结果； 图2为应用本发明的水解乳蛋白培养BHK-21细胞的培养结果； 图3为应用本发明的水解乳蛋白培养BHK-21细胞的细胞存活率。
【具体实施方式】
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0026] 本发明的一种酶解酪蛋白制备水解乳蛋白的方法为： 1、底物溶液的配制:按10-15%(质量百分比浓度)称取酪蛋白干粉置IOL反应器中，同时 加入纯化水形成料液，将料液的pH调节至弱碱性(7.0~8.0)。
[0027] 2、超高压酶解:在步骤1的料液中按照酪蛋白干粉:胰酶(E:S)=1: 5比例加入相应 量的胰酶搅拌均匀，调pH在7.5左右后，置超高压生物反应器中，在一定的压力（100~ 150MPa)和温度(40~50°C)下超高压酶解一定的时间（4~24h)。
[0028] 其中，胰酶为多酶复合酶，主要成分是胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶，还有羧肽 酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶和核糖核酸酶等，购自重庆奥力生物制药有限公司。
[0029] 胰酶是一种多酶复合物，其与氨基酸的结合位点具有专一性。胰蛋白酶水解阳离 子氨基酸结合位点(Arg、Lys)，糜蛋白酶能够水解芳香族和支链氨基酸的结合位点（Tyr， Phe, Trp, Leu)，羧肽酶A除了不能水解Asp, Glu, Arg, Lys四种氨基酸的结合位点以外， 其余各种氨基酸的结合位点都能被水解，弹性蛋白酶能够水解Ala的结合位点。因此，本发 明所使用的胰酶能够水解多个氨基酸位点。
[0030] 3、灭活:将步骤2的酶解产物沸水浴10-20min，使没有反应完全的酶失去活性。再 将其温度立即冷却至室温。
[0031] 4、离心：将灭活后的酶解产物3000-4000rpm离心20-40min，去除未水解的蛋白和 变性的酶。收集上清液。
[0032] 5、板框压滤:将步骤4所得的水解液采用滤布过滤。
[0033] 6、超滤:采用IOKD的超滤膜去除大分子蛋白和残留的水解用酶。收集滤液，即为蛋 白水解液。
[0034] 6、干燥:将步骤5中蛋白水解液在进风温度160~180 °C，出风温度为80~90 °C的条 件下喷雾干燥，水分小于5%，得水解乳蛋白干粉。
[0035] 7、检测:使用氨基酸分析仪测定各氨基酸含量，采用甲醛滴定法检测氨基氮含量， 采用凯氏定氮法检测总氮含量，最后计算水解度。对分子量进行检测。同时与Hyclone水解 乳蛋白进行对比。如果其值与Hyclone水解乳蛋白差异不显著，即为合格。 「〇〇361 每其氣会葛· 6氣会葛· 7k細瘡給》1娃里余m丰1
游离氨基酸检测结果参见图1和表2,其中，图A为Hyclone水解乳蛋白氨基酸检测图 谱，图B为本发明的水解乳蛋白氨基酸检测图谱；1为磷酸丝氨酸（P-Ser) ; 2为天冬氨酸 (Asp); 3为苏氨酸(Thr) ; 4为丝氨酸（Ser) ; 5为天冬酰胺(AspNH2); 6为谷氨酸(Glu); 7为谷 氨酰胺(GluNH2) ; 8为甘氨酸(Gly) ; 9为丙氨酸(Ala) ; 10为缬氨酸(Val) ; 11为胱氨酸(Cys); 12为蛋氨酸(Met) ; 13为异亮氨酸（lie) ; 14为亮氨酸(Leu) ; 15为酪氨酸(Tyr) ; 16为苯丙氨 酸(Phe) ; 17为氨(NH3) ; 18为赖氨酸(Lys) ; 19为组氨酸(His) ; 20为精氨酸(Arg)。
由表2和图1可以看出，Hyclone水解乳蛋白和本发明的水解乳蛋白中的氨基酸含量有 明显的差异(P〈〇.05)，其氨基酸总量分别为24.04±0.768 %和46.202±2.263 %。本发明的 水解乳蛋白氨基酸总含量高于Hyclone水解乳蛋白的氨基酸总含量。
[0039]应用本发明方法所得产物的分子量小于10 kDa。
[0040]以下为本发明的水解乳蛋白的制备实施例。
[0041 ] 实施例1 一种超高压酶解酪蛋白制备水解乳蛋白方法，包括如下步骤： 1、底物溶液的配制:称取1500g酪蛋白干粉置IOL反应器中，同时加入纯化水至IOL搅拌 均匀形成料液，将料液的pH调节至7.5。
[0042] 2、超高压酶解:在步骤1的料液中按照E: S=I: 5比例加入胰酶300g搅拌均匀，调pH 在7.5后，置超高压生物反应器中，在压力150MPa、温度45 °C下超高压酶解4h。
[0043] 3、灭活:将步骤2的酶解产物沸水浴15min，使反应没有完全的酶失去活性。再将其 温度立即冷却至室温。
[0044] 4、离心:酶解产物经灭活后3800rpm离心30min，去除未水解的蛋白和变性的酶。收 集上清液。
[0045] 5、板框压滤:将步骤4所得的水解液采用滤布过滤。收集滤液，即为蛋白水解液。
[0046] 6、超滤:采用IOKD的超滤膜去除大分子蛋白和残留的水解用酶。
[0047] 7、干燥:将步骤5中浓缩液在进风温度180°C，出风温度为90°C的条件下喷雾干燥， 水分小于5%，得水解乳蛋白干粉760.22g。
[0048] 8、检测:使用氨基酸分析仪测定各氨基酸含量，采用甲醛滴定法检测氨基氮含量， 采用凯氏定氮法检测总氮含量，最后计算水解度。同时与Hyclone水解乳蛋白进行对比。经 检测，各项数值均在表1、表2和图1所示范围内。
[0049] 实施例2 一种超高压酶解酪蛋白制备水解乳蛋白方法，包括如下步骤： 1、底物溶液的配制:称取1000 g酪蛋白干粉置IOL反应器中，同时加入纯化水至IOL搅拌 均匀形成料液，将料液的PH调节至7.0。
[0050] 2、超高压酶解:在步骤1的料液中按照E: S=I: 5比例加入胰酶300g搅拌均匀，调pH 在7.6后，置超高压生物反应器中，在压力10010^、温度50°(：下超高压酶解1011。
[0051] 3、灭活:将步骤2的酶解产物沸水浴lOmin，使反应没有完全的酶失去活性。再将其 温度立即冷却至室温。
[0052] 4、离心:酶解产物经灭活后3000rpm离心40min，去除未水解的蛋白和变性的酶。收 集上清液。
[0053] 5、板框压滤:将步骤4所得的水解液采用滤布过滤。收集滤液，即为蛋白水解液。
[0054] 6、超滤:去除大分子蛋白和残留的水解用酶。
[0055] 6、干燥:将步骤5中浓缩液在进风温度170°C，出风温度为85°C下喷雾干燥，水分小 于5%，得水解乳蛋白干粉608 · 35g。
[0056] 7、检测:使用氨基酸分析仪测定各氨基酸含量，采用甲醛滴定法检测氨基氮含量， 采用凯氏定氮法检测总氮含量，最后计算水解度。同时与Hyclone水解乳蛋白进行对比。经 检测，各项数值均在表1、表2和图1所示范围内。
[0057] 实施例3 一种超高压酶解酪蛋白制备水解乳蛋白方法，包括如下步骤： 1、底物溶液的配制:称取1200g酪蛋白干粉置IOL反应器中，同时加入纯化水至IOL搅拌 均匀形成料液，将料液的pH调节至8.0。
[0058] 2、超高压酶解:在步骤1的料液中按照E: S=I: 5比例加入胰酶300g搅拌均匀，调pH 在7.4后，置超高压生物反应器中，在压力120MPa、温度40 °C下超高压酶解一定的时间24h。
[0059] 3、灭活:将步骤2的酶解产物沸水浴20min，使反应没有完全的酶失去活性。再将其 温度立即冷却至室温。
[0060] 4、离心:酶解产物经灭活后4000rpm离心20min，去除未水解的蛋白和变性的酶。收 集上清液。
[0061 ] 5、板框压滤:将步骤4所得的水解液采用滤布过滤。收集滤液，即为蛋白水解液。
[0062] 6、超滤:去除大分子蛋白和残留的水解用酶。
[0063] 6、干燥:将步骤5中浓缩液在进风温度160°C，出风温度为80°C下喷雾干燥，水分小 于5%，得水解乳蛋白干粉591.95g。
[0064] 7、检测:使用氨基酸分析仪测定各氨基酸含量，采用甲醛滴定法检测氨基氮含量， 采用凯氏定氮法检测总氮含量，最后计算水解度。同时与Hyclone水解乳蛋白进行对比。如 果其值与Hyclone水解乳蛋白差异不显著，即为合格。经检测，各项数值均在表1、表2和图1 所示范围内。
[0065] 实施例4 应用本发明的水解乳蛋白对细胞的培养试验 一、应用本发明的水解乳蛋白培养BHK-21细胞。
[0066]细胞贴壁培养方法： 用含有0.25%实施例1制备得到的水解乳蛋白的基础培养基(45%MEM，45%欧氏液，10% FBS)培养M1K-21细胞。同时以MEM培养基为空白组，含有0.25%Hyclone水解乳蛋白的基础培 养基为对照组。
[0067]细胞活力和毒性检测 细胞活力米用3-(4，5-dimehyl-thiazol-2-yl) 2，5-diphenyltetrazoium bromide (MTT)法进行分析，具体步骤为:将BHK-21细胞消化后制成细胞悬液，按照I X IO5个/mL的浓 度接种100μΙ与96孔板中37°C培养24h后，将细胞培养液更换为含有0.25%和0.5%水解乳蛋 白的维持液(48.5%MEM，48.5%欧氏液，3%FBS)37 °C培养48h，每孔加入25μ1ΜΤΤ溶液(5mg/ml， 艮P 0.5%MTT)，继续培养4h。小心吸去孔内培养液终止培养。每孔加入125μ1二甲基亚砜 (DMSO)，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔 的吸光值。同时以MEM培养基为空白组。含有0.25%Hyc lone水解乳蛋白的基础培养基为对照 组。
[0068] 培养结果参见图2。在图2中，A为空白组，B为试验组，C为对照组。由图2可以看出， BHK-21细胞培养24h时，空白组、试验组和对照组的细胞均能生长至50%以上;在48h均生长 成致密单层，细胞生长正常，形态良好。但在48h试验组和对照组的细胞密度明显高于空白 组。这说明Hyclone水解乳蛋白和本发明的水解乳蛋白对BHK-21细胞均有促生长作用。 [0069] 细胞存活率结果参见图3。在图3中，MEM为空白组，0.25H为对照组，0.25ZZ和0.5ZZ 为试验组。由图3可以看出，用含有Hyclone水解乳蛋白或本发明的水解乳蛋白的MEM培养基 处理48h的BHK-21细胞与空白组比较均有较高的存活率，并具有明显差异(P〈0.05)。其中对 照组、试验组(0.25%zz)和试验组(0.5%zz)的细胞存活率分别为1.281%，1.373%和1.618%。 因此，MTT分析证实，本发明的水解乳蛋白对BHK-21细胞没有细胞毒性，反而具有促生长作 用，这与BHK-21细胞贴壁培养的结果相符合。
[0070] 二、应用本发明的水解乳蛋白培养Vero、CHO、ST、Marc-l 45或MDCK细胞。
[0071] 经试验，在培养Vero、CHO、ST、Marc-145或MDCK细胞时，将本发明的水解乳蛋白加 入到培养对应细胞的常用培养基中，使水解乳蛋白的质量百分比浓度为〇. 2%-0.5%，对细胞 按常规培养方法进行贴壁或悬浮培养即可，就能很好的对Vero、CH0、ST、Marc-145SMDCI^H 胞进行培养，且细胞密度和存活率均高于使用不加入水解乳蛋白的培养基的培养结果。 [0072]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种水解乳蛋白的制备方法，其特征在于：在酪蛋白水溶液中加入胰酶，在100~ 150MPa、40~50°C下酶解4~24h后，终止酶解反应，再将酶解产物进行后处理，得到水解乳 蛋白。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述酪蛋白水溶液中酪蛋白的质量百分含 量为5%-15%;作为优选，所述酪蛋白与胰酶的质量比为5:1。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述胰酶为多酶复合物，主要成分是胰蛋 白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述终止酶解反应是将酶解产物沸水浴 10_15min〇5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述将酶解产物进行后处理是将酶解产物 离心、过滤、干燥(冷冻干燥或喷雾干燥）;作为优选，所述干燥为喷雾干燥。6. 应用权利要求1-5任一所述的方法制备得到的水解乳蛋白。7. 权利要求6所述的水解乳蛋白在细胞培养中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述细胞为冊1(-21、￥6仰、〇10、31'、1^(3-145、]\?0(;优选的细胞为^?-21。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述应用的具体方法为:将水解乳蛋白加 入到培养细胞的培养基中，使水解乳蛋白的质量百分比浓度为〇. 2%-0.5%。10. -种细胞的培养方法，其特征在于:将水解乳蛋白加入到培养细胞的培养基中，使 水解乳蛋白的质量百分比浓度为0.2%-0.5%，对细胞按常规培养方法进行贴壁或悬浮培养。
【文档编号】C07K1/34GK106086136SQ201610508119
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】李明生, 冯玉萍, 马忠仁, 靳冬武
【申请人】西北民族大学