血液回输通道7，止液夹8和流速控制器9。采集通道I为一个双向管道，其一端可进入液体，另一端以输液器连接三通的一个输入端，三通的另外一个输入端通过输液器连接抗凝通道2，三通的输出端通过输液皮条与控制阀3的输入端连接，该控制阀3的一个切换端与采血袋5的输入端连接，采血袋5放置在电子采血仪4上，在采血袋5的输出端设置有止液夹8，该端口依次连接循环肿瘤细胞采集过滤器6、流速控制器9和血液回输通道7，血液回输通道7的输出口与控制阀3的另一个切换端连接。
[0025]循环肿瘤细胞采集过滤器6含有自制加工的CTC富集滤膜。该过滤器由上下两部分组成，中间压入滤膜，可通过打开过滤器6的上下两部分来重装滤膜。该滤膜是一张孔径一致、并规则排布有微孔的滤膜，以紫外光刻技术和反应离子蚀刻技术制造，材质为派瑞林(聚对二甲苯)薄膜，膜面积为3.14cm2，膜厚度为10 μπι，滤膜孔径为8 μπι。
[0026]在血液采集阶段，使用止液夹8关闭采血袋5的输出口，以使得含有血液和抗凝剂的混合液体暂存于采血袋5中，切换控制阀3，使其与采血袋5输入端连接的那个切换端畅通，而其与血液回输通道7连接的另一切换端闭合。在抗凝通路滴速为162滴/分钟(10.8ml/分钟)时，来自采集通道I的血液与来自抗凝通道2的肝素抗凝剂(V
肝素生理盐水
=1:50)在三通处以V血'液:V抗凝剂=1:9的比例汇合，并流经控制阀3进入采血袋5。采血袋5放置在位于低于采集通道I入口处Im的电子采血仪4上。电子采血仪4通过震动使采血袋5中液体充分混匀，其震动频次为32±2次。设定液体采集总质量为200克，当达到200克时，采血仪4停止震动，该过程历时17分钟，此时血液和抗凝剂的总体积约200ml，其中采集血液约20ml。
[0027]在CTC采集以及血液回输阶段，切换控制阀3，使其连接采血袋5输入口的那个切换端闭合，暂停采血，并使其连接血液回输通道7的那个切换端畅通。将采血袋5放置在高于血液回输通道7入口约Im的输液架上，去除止液夹8，以使得采血袋5输出口畅通。在重力的作用下，已经充分混匀的液体从采血袋5中流出，并依次通过CTC采集过滤器6、流速控制器9和血液回输通道7，逐步回输体内，大约17分钟回输完毕。流速控制器的回输滴速为180滴/分钟(即12ml/分钟)。在此血液回输的过程中，CTC被采集富集在循环肿瘤细胞采集过滤器6中的CTC富集滤膜上。液体回输结束后用20ml生理盐水冲洗采血袋，继续回输至体内。
[0028]根据循环肿瘤细胞的后续检测方案需要，可以如此循环反复操作，从而在同一张滤膜上分离富集足够量的CTC，同时不损失液体。
[0029]图2是CTC免疫荧光图。其中，以CK8、CK18以及CK19荧光抗体标记上皮细胞、CD45荧光抗体标记白细胞、DAPI荧光染料将细胞核染色，然后采用荧光显微镜进行分析，将DAP1、CK阳性而CD45阴性的细胞定义为循环肿瘤细胞。图2中，CK荧光抗体标记上皮细胞(绿色)、⑶45荧光抗体标记白细胞(红色)、DAPI荧光染料标记细胞核(蓝色)，其中DAP1、CK阳性而⑶45阴性的细胞即为CTC(即循环肿瘤细胞)，DAP1、⑶45阳性而CK阴性的细胞即为WBC (即白细胞)。结果表明，本实用新型的单通道闭合环路装置可使CTC的富集率达到95-100%，通过多次循环可富集CTC数目达到20-100个。在一位晚期胃癌患者的20ml血液中，富集到的CTC数目为11个(11个/20ml)，与金标准Cellsearch的鉴定结果(4个/7.5ml) 一致，且优于普通体外滤膜法ISET装置所得结果(2个/5ml)。经过4-5次循环，可使富集CTC数目达到50余个，可顺利进行CTC培养、基因测序、基因突变、基因SNP、基因拷贝数分析和基因mRNA等定量分析，而不需要全基因组扩增，这将为临床提供更准确的用药信息和指导，为实时个体化药物治疗提供更准确的检测来源。
[0030]由上可见，本实用新型的装置可以在高效率富集CTC的同时不损失液体，为后续细胞表征鉴定、基因检测提供了技术保障。此方法操作方便，富集率高，可重复性强，成本低，具有广泛的临床应用前景。
[0031]以上显示和描述了本实用新型的基本原理、主要特征和本实用新型的优点。本行业的技术人员应该了解，本实用新型不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本实用新型的原理，在不脱离本实用新型精神和范围的前提下，本实用新型还会有各种变化和改进，本实用新型要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:包括采集通道、抗凝通道、控制阀、采血仪、采血袋、循环肿瘤细胞采集过滤器和血液回输通道，所述采集通道与抗凝通道分别或者共同连接在控制阀的输入端，控制阀的一个切换端与采血袋的输入端连接，采血袋在血液采集阶段放置于采血仪上，采血袋的输出端依次与循环肿瘤细胞采集过滤器和血液回输通道连接，该血液回输通道的输出端与控制阀的另一个切换端连接，该装置的血液采集/回输的循环过程依靠变换采血袋相对于采集通道/血液回输通道的位置来进行转换。2.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:所述采血袋相对于采集通道/血液回输通道的位置变换通过人工手动或者升降装置调-K-T O3.如权利要求1或者2所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:所述采血仪在采集血液过程中置于低于采集通道入口 0.5-1.5m的位置，震动频次为20-40次，采集液体总体积为20-500ml。4.如权利要求1或者2所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:回输通道在液体回输时，其位置低于采血袋0.5-1.5m。5.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:所述循环肿瘤细胞采集过滤器由上下两部分组成，中间设置有CTC富集滤膜，该上下两部分以可开合形式连接。6.如权利要求5所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:所述CTC富集滤膜的膜厚度为2-20 μ m，膜孔径在6-40 μ m，膜面积为0.2-20cm2，膜含有滤孔为 10000-1000000 个。7.如权利要求5或者6所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:所述CTC富集滤膜的材质为派瑞林薄膜，又称聚对二甲苯薄膜。8.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:还包括夹紧部件，在血液采集阶段从外部设置在采血袋输出端。9.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:该装置在循环肿瘤细胞采集过滤器与血液回输通道之间还设置了流速控制器。10.如权利要求1所述的一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞分离和富集装置，其特征在于:所述抗凝通道中含有肝素和生理盐水配合而成的抗凝剂，抗凝剂浓度为V肝素..、生理盐水=1:1 ?1:1OO0
【专利摘要】本实用新型提供了一种基于闭合环路的循环肿瘤细胞(CTC)分离和富集装置，其特征在于：包括采集通道、抗凝通道、控制阀、采血仪、采血袋、CTC采集过滤器和血液回输通道，采集通道与抗凝通道分别或共同连接在控制阀的输入端，控制阀的一个切换端与采血袋的输入端连接，采血袋在血液采集阶段放置于采血仪上，采血袋的输出端依次与CTC采集过滤器和血液回输通道连接，该血液回输通道的输出端与控制阀的另一个切换端连接，该装置的血液采集/回输的循环过程依靠变换采血袋相对于采集通道/血液回输通道的位置来进行转换。其优点在于该装置能够在实现了对循环肿瘤细胞最大可能的分离富集的基础上，成功将剩余液体回输、不造成液体损失，并能循环反复采集。
【IPC分类】C12M1/12, A61M1/38
【公开号】CN204824871
【申请号】CN201520519486
【发明人】刘宝瑞, 沈洁, 袁玲
【申请人】南京大学医学院附属鼓楼医院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月16日