线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括盒体1、纸质衬垫2，所述的纸质衬垫2置于盒体1内，纸质衬垫2上设有4个容器孔并装有4个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR扩增正向引物的试剂管3和装有PCR扩增反向引物的试剂管4、装有Taq酶的试剂管5、装有PCR反应液的试剂管6，其中PCR正向引物和PCR扩增反向引物均可单独作为测序引物使用。该试剂盒可同时用于线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症相关基因热点突变位点A3243G、T3271C、C3093G、G3244A、A3252G、C3256T、T3258C、A3260G、T3291C单核苷酸多态性的测序检测，相较于现有试剂盒体积小，制造容易，操作简单，便于运输和使用。
【专利说明】
线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒
技术领域
[0001]本实用新型属于生物技术领域，涉及一种基因多态性测序检测试剂盒，具体涉及线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒。
【背景技术】
[0002]线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症(MELAS)是线粒体疾病最常见的表现形式，且发病率相对较高。MELAS导致大脑周期性卒中发作，常使患者发生偏头痛、呕吐及惊厥，有时造成大脑永久性损伤，主要发病期在童年和成年早期。这些事件的逐步累积效应往往导致患者出现运动技能丧失、感觉受损及精神障碍。乳酸通常积聚在血液或脑脊液中，或两者兼而有之。研究发现，大多数患者都具有mtDNA A3243G异质性突变，也有一些是由T3271C、C3093G、G3244A、A3252G、C3256T、T3258C、A3260G、T3291C 位点点突变引起。
[0003]因此，研发一种快速有效的线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症(MELAS)A3243G、T3271C、C3093G、G3244A、A3252G、C3256T、T3258C、A3260G、T3291C 位点基因型的测序检测试剂盒显得尤为重要。
【实用新型内容】
[0004]本实用新型提供一种采用Sanger法测序(一代测序)检测线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症(]\^1^5)相关基因厶32436、了3271(:、030936、63244厶、厶32526、032561'、T3258C、A3260G、T3291C位点基因型的试剂盒，本实用新型能较好的应用于MELAS的9个热点突变位点单核苷酸多态性检测，体积小，操作简单，便于运输携带和使用。
[0005]本实用新型提供的线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括盒体1、纸质衬垫2，所述的纸质衬垫2置于盒体I内，纸质衬垫2上设有4个容器孔并装有4个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR扩增正向引物的试剂管3和装有PCR扩增反向引物的试剂管4、装有Taq酶的试剂管5、装有PCR反应液的试剂管6。
[0006]进一步的，所述的容器孔较佳的为4个，容器孔在所述的纸质衬垫上分2排排列，且均为2ml试剂管。
[0007]上述的试剂管6中装有的PCR反应液主要成分包含dNTPs及MgCL2。
[0008]上述的TaqDNA聚合酶为本领域常规高保真Taq DNA聚合酶，生产厂商较佳的包括TAKARA或Τ0Υ0Β0(东洋纺)，所述的特异性引物的生产厂商较佳的为LIFE或TAKARA，所述的dNTPs、MgCL2 均为常规 dNTPs ^MgCL2。
[0009]所述的PCR扩增正向引物和PCR扩增反向引物所形成的扩增子包含A3243G、T3271C、C3093G、G3244A、A3252G、C3256T、T3258C、A3260G、T3291C 位点。
[0010]所述的PCR扩增正向
[0011 ]所述的PCR扩增反向引物为:5 ’-ATTTTTCGTTCGGTAAGCA-3 ’。
[0012]应用本实用新型的有益效果:
[0013]本实用新型提供的试剂盒通过有序的容器孔设置，在各容器孔分别为装有PCR扩增正向引物的试剂管3和装有PCR扩增反向引物的试剂管4、装有Taq酶的试剂管5、装有PCR反应液的试剂管6，方便使用者获取及测定完成后进行有序的放回相应位置，使用方便；
[0014]本实用新型提供的试剂盒将PCR扩增所需的Taq酶单独放置，保证了Taq酶的稳定性，将PCR扩增所需的PCR Buffer和MgCL2等组分混为PCR反应液，使得在使用时方便、快速，减少PCR扩增体系反应液的配制步骤；
[0015]本实用新型提供的试剂盒中PCR扩增正向引物和PCR扩增反向引物均以冻干粉的形式储存于试剂管中，便于保存和运输；
[0016]本实用新型提供的试剂盒中PCR扩增正向引物和PCR扩增反向引物均可同时作为PCR扩增用，也可作为测序引物使用。
【附图说明】
[0017]图1为本实用新型的线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒结构示意图，图中I为盒体、2为纸质衬垫，3为装有PCR扩增正向引物的试剂管、4为装有PCR扩增反向引物的试剂管、5为装有Taq酶的试剂管、6为装有PCR反应液的试剂管。
【具体实施方式】
[0018]为了能够更清楚地描述本实用新型的技术内容，下面通过【具体实施方式】并结合附图进行进一步的详细说明。
[0019]本实用新型提供的线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括盒体1、纸质衬垫2，所述的纸质衬垫2置于盒体I内，纸质衬垫2上设有4个容器孔并装有4个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR扩增正向引物的试剂管3和装有PCR扩增反向引物的试剂管4、装有Taq酶的试剂管5、装有PCR反应液的试剂管6，其中PCR扩增正向引物和PCR扩增反向引物均可单独作为测序引物使用，所述的引物均以冻干粉的形式储存于试剂管中，便于保存和运输。
[0020]进一步的，所述的容器孔为4个，容器孔在所述的纸质衬垫上分2排排列，每排2个，且均为2ml试剂管。
[0021 ]本实用新型所提供的试剂盒保存于-20°C，避免反复冻融。
[0022]线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒具体使用方法:
[0023](I)第一次使用时，打开试剂盒首先将PCR扩增正向引物和PCR扩增反向引物短暂离心，加入超纯水稀释至ΙΟμπιοΙ/L，建议分装至不同的离心管内保存避免反复冻融。
[0024](2)配制PCR扩增体系反应液:Taq酶lul(lu/uL)、PCR反应液34ul、PCR扩增正向引物和反向引物各1.5ul、模板0.2至lug，加入超纯水补齐至50ul，短暂离心进行扩增。
[0025](3)PCR扩增:98 0C 2分钟，98 °C 10#，56 °C 30秒，68 °C 22秒，步骤98 °C 10#，56 °C 30秒，68 0C 22秒共进行35个循环，最后68 °C 7分钟。
[0026](4)电泳:PCR结束后将PCR扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0027](5)测序:该试剂盒的PCR扩增正向引物和PCR扩增反向引物均可单独作为测序引物使用，实验操作者可根据自己的测序仪型号设置测序反应中的参数并进行测序。
[0028]以上实施例仅为本实用新型的优选实施例，但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
[0029]综上所述，本实用新型结构简单、制造容易、使用方便、设计合理、检测过程不易受污染，采用纸质衬垫的设计使得试剂管避免磕碰，该试剂盒在线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症相关基因热点突变位点A3243G、T3271C、C3093G、G3244A、A3252G、C3256T、T3258C、A3260G、T3291C的单核苷酸多态性测序检测时具有敏感性强、耗时短、特异性强、方便运输等优点。
【主权项】
1.一种线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括盒体(I)、纸质衬垫(2)，所述的纸质衬垫(2)置于盒体(I)内，纸质衬垫(2)上设有4个容器孔并装有4个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR扩增正向引物的试剂管(3)和装有PCR扩增反向引物的试剂管(4)、装有Taq酶的试剂管(5)、装有PCR反应液的试剂管(6)ο2.根据权利要求1所述的线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒，其特征在于，所述的纸质衬垫(2)置于盒体(I)内，纸质衬垫(2)上设有4个容器孔并装有4个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR扩增正向引物的试剂管(3)和装有PCR扩增反向引物的试剂管(4)、装有Taq酶的试剂管(5)、装有PCR反应液的试剂管(6)。3.根据权利要求2所述的线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和卒中样症基因测序试剂盒，其特征在于，所述的纸质衬垫⑵上的4个容器孔分为2排排列，每排2个。
【文档编号】C12Q1/68GK205528786SQ201620183292
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年3月10日
【发明人】卿志荣, 郑帮
【申请人】上海睿玻生物科技有限公司