一种肺癌早期诊断fish试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及肺癌早期诊断FISH试剂盒，包含盒体和位于盒体内的海绵垫，海绵垫上开设有多个容器孔，所述容器孔内放置EP管，所述EP管包含探针管和试剂管，所述探针管包含NSE探针组母液管和ProGRP探针组母液管，所述试剂管包含探针稀释液管、DAPI管、蛋白酶K母液管、Solution A管和Solution B管。本实用新型通过FISH定量分析，量化NSE及ProGRP联合表达水平与肺癌之间的关系，不仅有助于了解NSE及ProGRP联合在肺癌病情变化过程的变化规律及相应功能，同时量化NSE及ProGRP联合有助于指导临床肺癌的前期诊断和治疗，指导临床医师作出正确的治疗方案，提高肺癌治愈率。
【专利说明】
一种肺癌早期诊断FISH试剂盒
技术领域
[0001]本实用新型涉及生物诊断技术领域，具体涉及一种肺癌早期诊断FISH试剂盒。
【背景技术】
[0002]肺癌是呼吸系统中最常见的肺部原发性恶性肿瘤，为世界各地最常见的危害人类健康的疾病之一。因此，提高肺癌的早期诊断水平和治疗是至关重要的。
[0003]目前临床上肺癌的检测方法主要有影像学检查、电子支气管镜检查、生物化学检查、组织细胞病理学检查等(Watanabe R.,Takichi Y.,Kuriyama T.Serum tumor markerfor primary lung carcinoma[J].Nippon Rinsho，2010，58:1070-1073.)。影像学包括X线片、CT、MR1、SPETCT、PET及PET/CT等，使用影像学检查发现肺癌时，患者已经有了病发灶，部分都已经到中晚期。生物化学检查是一种辅助检查手段，不适宜单一用于早期诊断。组织细胞病理学检查和支气管镜检查是主要的活检方式，诊断结果明确，但却是一种侵入性检查，对机体功能有一定的影响。国内外研究者在临床应用中已观察到电子支气管镜检查可引起出血、气胸等并发症，会对机体产生损伤。
[0004]肿瘤标志物(Tumor Makers，TMs)是机体对肿瘤细胞反应产生的一类物质，是肿瘤在发生及增殖过程当中，由肿瘤细胞本身合成、分泌的一种肽类物质，这类物质可反映肿瘤细胞恶变各阶段表型及基因特征性，它们存在于癌组织或宿主的血液、细胞、组织或体液中，健康人的血清中没有或浓度很低(白晓雪，张妍蓓.肺癌肿瘤标志物检测的研究现状[J].临床肺科杂志，2011，16(2): 259-260.)。肺癌血清肿瘤标志物检测对于肿瘤的普查、早期诊断、疗效的评价及预后的判断有非常大的临床价值。
[0005]肺癌血清肿瘤标志物检测意义重大:①肿瘤标志物的升高可先于顽固性咳嗽、痰中带血、癌性胸水等临床症状出现，因此可通过检测血清异常增高的肿瘤标志物以确定肿瘤疾病的发生，实现早期诊断;②通过认识增高的血清肿瘤标志物种类以初步判断疾病的分期。另外，利用并联试验原理诊断肺癌，随着抗原种类的增多，诊断的灵敏度随之增加，敏感度均在70%以上。众多研究表明:NSE(神经元特异性烯醇化酶)单独检测肺癌的敏感度为55.3%左右，ProGRP(胃泌素释放肽前体)单独检测的敏感度为60.5%左右，联合检测NSE及ProGRP对非小细胞肺癌的敏感度和特异度较高，分别为82.70 %和81.2 % (张宝秋，丁湘或，王雪玉等.肺癌标志物联合检测在肺癌诊断中的应用价值[J].国际检验医学杂志，2012，4
(33):388-390.)ο
[0006]FISH(fluorescence in situ hybridizat1n)技术是一种重要的焚光原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或基因切片上的靶基因与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶基因与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与焚光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测基因进行定性、定量或相对定位分析。目前，FISH技术在生命科学及医学领域得到了广泛的应用，如乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌等肿瘤的临床检测。但迄今为止还没有使用FISH技术联合检测NSE及ProGRP来诊断肺癌的报道。
【实用新型内容】
[0007]有鉴于此，有必要针对现有技术中检测肺癌的不足，提供一种肺癌早期诊断FISH试剂盒。
[0008]一种肺癌早期诊断FISH试剂盒，包含盒体和位于盒体内的海绵垫，海绵垫上开设有多个容器孔，所述容器孔内放置EP管，所述EP管包含探针管和试剂管，所述探针管包含NSE探针组母液管和ProGRP探针组母液管，所述试剂管包含探针稀释液管、DAPI (4 ’，6-diamidino-2-phenylindole，4’，6-二脉基-2-苯基卩引噪)管、蛋白酶K母液管、Solut1n A管和Solut1n B管。
[0009]优选地，所述NSE探针组母液管中含有3条检测NSE mRNA的探针。
[0010]优选地，所述ProGRP探针组母液管中含有3条检测ProGRP mRNA的探针。
[0011 ] 优选地，NSE探针组母液管中的探针为红色荧光标记的探针，ProGRP探针组母液管中的探针为绿色荧光标记的探针。
[0012]优选地，所述探针稀释液管有2个。
[0013]优选地，NSE探针组母液管、ProGRP探针组母液管、探针稀释液管和DAPI管的EP管为棕色EP管，采用棕色EP管可以防止荧光试剂受光粹灭。
[0014]优选地，蛋白酶K母液管、Solut1n A管和Solut1n B管的EP管为白色EP管。
[0015]优选地，所述海绵垫为黑色海绵垫，进一步防止荧光试剂受光猝灭。
[0016]优选地，所述试剂盒含还有盖子，所述盖子可开合的盖在所述盒体上。
[0017]优选地，试剂盒检测的样本为血液或唾液。
[0018]与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果:
[0019](I)本实用新型试剂盒采用FISH技术联合检测肿瘤标志物NSE及ProGRP基因的表达，从而实现肺癌的早期筛查和诊断。本实用新型通过FISH定量分析，量化NSE及ProGRP联合表达水平与肺癌之间的关系，不仅有助于了解NSE及ProGRP联合在肺癌病情变化过程的变化规律及相应功能，同时有助于指导临床肺癌的前期诊断和治疗，指导临床医师作出正确的治疗方案，提高肺癌治愈率。
[0020](2)本实用新型试剂盒可以对唾液或血液等样本进行检测。相比临床其他检测手段如组织切片等，本实用新型试剂盒的样本获材更加方便，不用损伤机体组织器官尤其针对早期肺癌的前期诊断有其重要的临床意义。本实用新型试剂盒主要应用于临床肺癌的检测，这种无创式检测方法的建立和突破必能为肺癌患者早期诊断及预防带来福音。
【附图说明】
[0021]图1为本实用新型肺癌早期诊断FISH试剂盒。
[0022]附图标记如下:
[0023]盒体I，盖子5，海绵垫2，容器孔3，EP管4，探针管41，NSE探针组母液管411，ProGRP探针组母液管412，试剂管42，探针稀释液管421，DAPI管422，蛋白酶K母液管423，Solut1nA管424，Solut1n B管425。
【具体实施方式】
[0024]为了更好的理解本发明，下面结合附图和具体实施例作进一步说明。
[0025]实施例1
[0026]一种肺癌早期诊断FISH试剂盒，包含盒体1、盖子5和位于盒体I内的海绵垫2，所述盖子5可开合的盖在所述盒体I上，海绵垫2上开设有多个容器孔3，所述容器孔内放置EP管4，所述EP管4根据其内所盛放的物质不同分为探针管41和试剂管42。
[0027]所述探针管41包含NSE探针组母液管411和ProGRP探针组母液管412。所述NSE探针组母液管411中含有3条检测NSE mRNA的红色荧光标记的探针的母液，所述ProGRP探针组母液管412中含有3条检测ProGRP mRNA的绿色荧光标记的探针的母液，经探针稀释液稀释后使用时。本实用新型中的探针是分别针对NSE和ProGRP的多个位点设计的，特异性更强。
[0028]所述试剂管42包含探针稀释液管421、0々?1管422、蛋白酶1(母液管423、301此丨011 A管424和Solut1n B管425。所述探针稀释液管421有两个，其内盛放有探针稀释液;所述蛋白酶K母液管423内盛放有蛋白酶K母液;所述Solut1n A管424内盛放有Solut1n A，所述Solut1n A的成分为:IM Tris-HCl ρΗ8.0;所述Solut1n B管425内盛放有Solut1n B，所述Solut1n B的成分为:0.5M EDTA pH8.0。所述蛋白酶K稀释为工作液后使用，具体方法为:向400yL 0.1%DEPC水中分别加入50μL Solut1n A和50yL Solut1n B，混匀，加入IyL浓度为lOyg/yL的蛋白酶K母液，混匀，蛋白酶K工作液的浓度为20yg/mL。
[0029]所述蛋白酶K母液管423、Solut1n A管424和Solut1n B管425的EP管为白色EP管。所述NSE探针组母液管411、ProGRP探针组母液管412、探针稀释液管421和DAPI管422的EP管为棕色EP管，采用棕色EP管可以防止荧光试剂受光猝灭。所述海绵垫2为黑色海绵垫，进一步防止荧光试剂受光猝灭。
[0030]优选地，试剂盒检测的样本为血液或唾液。
[0031 ]使用本实用新型试剂盒进行样本检测的方法如下:
[0032]I)溶液的配置
[0033]①2X SSC
[0034]将17.53g NaCl、8.82g柠檬酸三钠加水溶解，定容至1L，用10mol/L NaOH调pH至7.0，高压灭菌，室温保存。
[0035]②50%甲酰胺/2 X SSC
[0036]将甲酰胺和2 X SSC按体积比1:1混合均匀即可。
[0037]@0.1%NP_40/2XSSC
[0038]取适量NP-40(Nonidet P 40，乙基苯基聚乙二醇)溶解到2 X SSC中，至NP-40终浓度为0.1%。
[0039]④PBS
[0040]取8.5gNaCl、2.8g Na2HPO4和0.4g NaH2PO4,用水配制定容至 1L，调pH至7.2_7.6，高压灭菌，室温保存。
[0041 ] ⑤4%多聚甲醛
[0042]取多聚甲醛40g、NaCl 8g、Na2HP04 1.44g、KH2P04 0.24g和KCl 0.2g^P800mL
0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水(60°C加热)溶解，定容至1L。
[0043]⑥丨％多聚甲醛
[0044]取多聚甲醛10g、NaCl 8g、Na2HP04 1.44g、KH2P04 0.24g和KCl 0.2g^P800mL
0.1% DEPC水(60 °C加热)溶解，定容至IL。
[0045]2)FISH实验操作
[0046]①探针组的杂交
[0047]用4%多聚甲醛室温固定使用常规方法制得的(唾液或血液)细胞滴片样本20min，
0.1 %DEPC水洗涤2次，每次洗涤5min。用蛋白酶K工作液(20yg/mL)37°C消化5-1 Omin JBS洗涤I次，每次洗涤5min。用I %多聚甲醛再次室温固定样本1min，PBS洗涤2次，每次洗涤5min。之后，用体积浓度为70 %、85 %和100 %酒精分别依次脱水，每次脱水各5min，空气中干燥。使用探针稀释液稀释探针组母液，得到探针组工作液，探针稀释液组成如下:去离子甲酰胺50mL，50 X Denhardt ’ s液1mL，50 X SSC 1mL ,10% SDS 5mL，变形鲑鱼精DNAlOOyg/mL，硫酸葡聚糖5g，0.1%DEPC水定容至100mL。将10ngAxL NSE探针组工作溶液和lOOng/yLProGRP探针组工作溶液按照体积比1:1混合，得到探针组杂交混合液，滴加探针组杂交混合液于样本上，用封片胶沿盖玻片周围进行封片，73°C共变性3min，再置于37°C湿润黑暗环境中杂交过夜(12-16h)。
[0048]②杂交后洗涤剂DAPI复染
[0049]洗涤前30分钟，将杂交洗涤液50 %甲酰胺/2 X SSC放入53 °C恒温水浴锅中，0.1 %NP-40/2 X SSC放入37 °C的恒温水浴锅中。将样本玻片取出，轻轻撕去封片胶，移去盖玻片，将玻片放入预热的洗涤液50%甲酰胺/2 X SSC中浸洗5min，再在0.1 %NP-40/2 X SSC洗液中浸洗5min，取出玻片，在黑暗处晾干。室温下滴加1yL DAPI复染剂至干燥的样本上，复染1min，PBS洗涤I次，每次洗涤5min，取出玻片，黑暗处晾干，用抗荧光衰减封片液进行封片。
[0050]③观察拍照
[0051]选择合适的滤镜在显微镜下寻找目的区域进行拍照。如果不能及时拍照，样本可置于盒子中在-20°C条件下保存。
[0052]以上所述实施例仅表达了本实用新型的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.一种肺癌早期诊断FISH试剂盒，其特征在于:包含盒体和位于盒体内的海绵垫，海绵垫上开设有多个容器孔，所述容器孔内放置EP管，所述EP管包含探针管和试剂管，所述探针管包含NSE探针组母液管和ProGRP探针组母液管，所述试剂管包含探针稀释液管、DAPI管、蛋白酶K母液管、Solut1n A管和Solut1n B管。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述NSE探针组母液管中含有3条检测NSE mRNA的探针。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述ProGRP探针组母液管中含有3条检测ProGRP mRNA的探针。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:NSE探针组母液管中的探针为红色荧光标记的探针，ProGRP探针组母液管中的探针为绿色荧光标记的探针。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述探针稀释液管有2个。6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于:NSE探针组母液管、ProGRP探针组母液管、探针稀释液管和DAPI管的EP管为棕色EP管。7.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于:蛋白酶K母液管、Solut1nA管和Solut1n B管的EP管为白色EP管。8.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述海绵垫为黑色海绵垫。9.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含还有盖子，所述盖子可开合的盖在所述盒体上。10.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于:试剂盒检测的样本为血液或唾液。
【文档编号】C12M1/00GK205528788SQ201620244478
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年3月25日
【发明人】王晓香, 董先辉, 冀力, 曾健, 周剑
【申请人】广州伯诚生物科技有限公司