真菌多糖包覆量子点的生物合成及其应用的制作方法

本发明属于纳米材料制备技术领域，涉及可用于多糖体外示踪、病原真菌检测、细胞成像、真菌多糖免疫机制研究、观赏鱼鸟花卉荧光着色、量子点敏化太阳能电池等方面的真菌多糖包覆量子点，具体涉及真菌多糖包覆量子点的生物合成及其应用。

背景技术：

量子点(Quantum dot,QD)是一类准零维纳米材料，粒径通常介于1-10nm之间。该类材料由Ⅱ-Ⅵ族(如：Cd，Pb与S，Se，Te)或Ⅲ～Ⅴ族(如：In，Ga与P，As)元素组成，常见的量子点材料包括CdS、CdSe、CdTe、GaAs、InAs等。量子点的电子和空穴被量子限域，其连续的能带结构被分割成具有分子特性的分立能级结构，因而该类材料受到光激发后可发生荧光。与传统的有机荧光染料相比，量子点荧光材料的激发光谱宽且连续分布，发射光的稳定性强，不易发生光漂白，并且通过控制量子点粒径可以获得从紫外至近红外范围内的任意发射光谱。鉴于在荧光特性上的诸多优点，量子点在生物荧光成像方面具有广泛的应用前景。不仅如此，量子点独特的光电学性能使其在光电子器件、太阳能电池、激光器等方面同样应用广泛。因此，量子点成为近年来材料科学的研究热点。

量子点的合成方法主要包括有机相合成法与水相合成法。在有机相合成法中，金属前体在配体和特定溶剂中分解成单体而形成核心，晶体成核后由于有机配体，如三辛基膦(TOPO)、十四烷基膦酸(TDPA)、己基膦酸等(HPA)等的包覆作用而被限制生长，所形成的量子点晶体得以稳定存在。该方法合成的量子点粒径均匀，分散性好，但合成过程中需要高温热解，合成设备苛刻，合成原料具有强毒性，操作复杂，合成过程不易控制。不仅如此，所合成的量子点为脂溶性，不能直接与生物分子相连，而需要先进行复杂的表面修饰才能应用。与此相比，水相合成法所制备的量子点不需要进行表面修饰即可与生物分子连接，使用便捷。该方法是采用含巯基的小分子化合物，如巯基丁酸(MCA)、巯基乙醇(MCH)、L-半胱氨酸(L-Cys)等对成核体系进行分散，在防止晶体聚合的同时对晶体表面进行功能修饰，并使晶体具备良好的水溶性。然而，该方法对设备要求高，合成过程中会产生H₂Te、H₂Se等剧毒气体，而且量子点与水相分离难度大。因此，探索高效、绿色的量子点水相合成方法势在必行。

近年来，随着生物技术的迅速发展，采用生物合成法制备纳米材料日益受到关注，这是因为该类方法具有反应条件温和、反应过程安全易控、成本低廉、产物生物相容性好等诸多优点，因而必将成为纳米材料合成领域的重要发展趋势。对于量子点生物合成而言，人们开始尝试采用大肠杆菌、酿酒酵母、蚯蚓等模式生物合成CdS、CdSe、CdTe等量子点材料。然而，迄今为止，采用生物合成方法制备量子点存在量子点产率低、分离过程繁琐等不足。因此，生物合成量子点的相关方法亟待改进与完善。

鉴于真菌感染及真菌污染在人类健康、食品安全、工业生产等诸多方面具有极为负面的影响，真菌检测具有非常重要的意义。然而，迄今该类检测基本仍采用传统的菌培方法。该方法不仅费时费力，而且对于不易培养的真菌易产生假阴性结果。因此，临床检测、食品检测等诸多领域亟需快捷、准确的真菌检测方法。与传统的菌培方法相比，免疫荧光方法因具有特异性强、操作时间短等优点，势必在真菌检测方面具有广阔的应用前景。但目前仍罕见有针对真菌的免疫荧光试剂的报道。

技术实现要素：

本发明目的是为了解决现有量子点合成过程中制备成本高、操作复杂、设备要求高、易产生有毒物质、分离过程繁琐等诸多问题，而提供一种采用丝状真菌合成多糖包覆的制备方法，以及所制备的量子点在多糖体内示踪、病原真菌检测、真菌多糖免疫机制研究、观赏鱼鸟花卉荧光着色、量子点敏化太阳能电池等方面的应用。

一类采用生物合成法制备的真菌多糖包覆量子点，是采用能产生胞外多糖的丝状真菌制备的多糖包被量子点，包括CdS，CdSe，CdTe，GaAs、InAs等，其粒径大小为1-10nm，激发光波长范围为200-700nm，发射光波长为400nm-800nm，发射荧光颜色为蓝色、绿色、黄色、橙色或红色。

一种真菌多糖包覆量子点的生物合成方法，是以能产生胞外多糖的丝状真菌作为合成菌株，往培养液中添加量子点合成前体，以硼氢化钠为还原剂，以巯基乙酸(或其他含巯基化合物)为稳定剂，通过改变培养温度(温度20-37℃)，制备不同粒径及不同荧光发射光谱的量子点，进而采用乙醇沉淀法分离得到目的产物。其步骤为：

(1)真菌液体培养

以能够产生胞外多糖的真菌，如糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、香菇(Lentinula edodes)、灵芝(Ganoderma lucidum)、木耳(Auricularia auricula)和猴头菇(Hericium erinaceus)等作为合成菌株，采用改良高氏培养基(蛋白胨0.25％，葡萄糖1.5％，酵母膏0.25％，KH₂PO₄0.005％，MgSO₄0.0025％)，在25-35℃下，摇床培养制备富含胞外多糖的菌丝体悬液。

(2)量子点合成

在富含真菌多糖的菌丝体悬液中，按0.15-0.2g/L的添加量添加亚碲酸钠(或其他非金属元素供体，如亚硒酸钠或亚硫酸钠)，按0.8g/L的添加量添加氯化镉(或其他金属元素供体，如其他Ⅱ族或Ⅲ族金属元素化合物)，充分混匀。随后按1.5-2g/L的添加量添加巯基乙酸(或其他含巯基化合物)作为稳定剂，按1-1.5g/L的添加量添加硼氢化钠作为还原剂，充分混匀。将混合体系置于摇床中，通过改变培养温度(20-37℃)与培养时间(4-8d)，得到不同粒径与不同荧光发射光谱的量子点。

(3)量子点分离

采用乙醇沉淀法，以反应液与乙醇比例为1：3的剂量，往步骤(2)反应液中添加无水乙醇或工业酒精，混匀后静置，使多糖包覆的量子点充分沉淀。弃上清，室温干燥或冷冻真空干燥，得到目的产物真菌多糖包覆量子点干粉。

本发明方法制备的量子点可用于生物检测、细胞成像、动植物活体荧光着色和量子点敏化太阳能电池中。

所述生物检测如病原真菌临床检测，具体方法如下：采用微孔滤膜过滤所使用的过滤装置为微型组装式正压滤器；即采用2ml医用注射器吸取待测患者尿液标本1.0ml，注射器乳头连接组装式正压滤器，过滤尿液，滤膜直径与滤器内径相同；在过滤尿液后，将滤膜取出，倒扣于载玻片，热固定包被后进行菌体-多糖包被量子点反应、水冲洗、荧光检测，此方法可有效避免检测结果的假阴性，检测浓度可达10²个菌/mL样品。

本发明的优点和有益效果：

本发明方法具有操作便捷、对设备要求低、反应条件温和、产物分离简单、回收率高、产物性质稳定等特点，能够有效降低量子点合成过程中的能耗及剧毒气体的污染，降低合成成本，从而产生良好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是香菇多糖包覆CdTe量子点制备的技术路线。

图2是真菌多糖包覆量子点的透射电镜表征图。

图3是真菌多糖包覆量子点的荧光光谱图。

图4是真菌多糖包覆量子点检测尿液真菌的荧光观察图。

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

具体实施方式

实施例一：真菌多糖包覆CdTe量子点的生物合成与应用

真菌多糖包覆量子点生物合成的技术路线见附图1。

下面以香菇菌株合成真菌多糖包覆CdTe量子点为例进行介绍：

(1)菌体培养

从斜面试管中挑取糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)菌株f1(南开大学菌种保藏中心)，接种于改良高氏培养基(蛋白胨0.25％，葡萄糖1.5％，酵母膏0.25％，KH₂PO₄0.005％，MgSO₄0.0025％)平板。将平板置于28℃培养箱中避光静置培养，5-7d后形成发育良好的菌丝体。

将活化的菌丝体转接至盛有改良高氏培养基的三角瓶。将平板置于恒温摇床中，在28℃、180rpm条件下避光培养，5-7d后形成均匀的菌丝发酵液，其中含有大量胞外多糖。

(2)CdTe量子点合成

从摇床中取出菌丝发酵液，添加0.2g/L的亚碲酸钠，0.8g/L的氯化镉，立即充分混匀。随后再加入1.5g/L的巯基乙酸(或其他含巯基化合物)，以及1g/L的硼氢化钠，立即充分混匀。将混合体系置于摇床中，设置摇床转速为180rpm，在一定培养温度下恒温摇床培养48h，分别得到一定粒径(一定荧光发射光谱)量子点的悬液：培养温度与粒径对应关系：25℃，1.0-1.6nm(蓝色)；30℃，1.5-2.0nm(绿色)；33℃，2.0-2.5nm(黄色)；37℃，3.5-4.0nm(红色)。

(3)CdTe量子点分离

将合成体系转移至200mL离心瓶中，在3000-5000rpm条件下离心，所得上清液转移至1L烧杯。按上清液与无水乙醇(或工业酒精)比例为1：3的剂量，往烧杯中加入无水乙醇(或工业酒精)，轻轻搅拌，使多糖包覆的CdTe量子点形成絮状物并充分沉淀。移去上清，所得沉淀于室温条件下自然干燥(或真空冷冻干燥)，得到真菌多糖包覆CdTe量子点成品。含乙醇的上清液可反复用于量子点的分离。

分离得到的量子点用蒸馏水溶解，供后续使用。不同培养温度条件下制备的CdTe量子点水溶液透射电镜表征结果见附图2，荧光光谱图及荧光发射照片见附图3。

(4)多糖包覆CdTe量子点在尿液真菌检测中的应用

经测定，所制备的多糖包覆CdTe量子点能够与多糖进行特异性结合。对于尿液、原料乳及其他不存在可溶性多糖的样品而言，所制备的多糖包覆量子点可用于这些样品的真菌检测。在尿液真菌检测过程中：

①用2ml注射器吸取1ml待测尿液样品，经直径1cm组装式滤器(内装有0.22微米滤膜一片)过滤。取出滤膜，倒扣于载玻片，使滤膜上的菌体充分粘附于载玻片表面，在酒精灯上快速烘烤(热固定)，使菌体固定在膜片上。

②加荧光免疫诊断试剂：在膜片上滴加100μl多糖包被CdTe量子点，37℃孵育10-30min。

③洗涤：用PBS洗涤载玻片3次，以洗去未结合的多余量子点。

④观察：将膜片置于荧光显微镜下，以相应激发波长观察荧光发光情况。真菌阴性、阳性尿液样品的检测结果见附图4。其中真菌多糖包覆QD为真菌多糖包覆CdTe量子点，Im-FAb为真菌特异性免疫荧光抗体的对照。也可应用荧光检测仪，以及可激发不同波长的便携式激发光源仪器，如紫外显示器等，对量子点染色后的样品进行检测。

⑤结论：结果证实，针对真菌菌培阴性的样品，真菌多糖包覆QD与Im-FAb均显示阴性；针对真菌菌培阳性的样品，真菌多糖包覆QD与Im-FAb均显示为阳性。三种检测方法结果一致，表明阳性样品为真菌感染阳性。

⑥临床检测结果见表1。表中样品真菌检测采用菌培、真菌多糖包覆QD及Im-FAb三种方法进行检测，检测结果表明三种检测结果基本一致，而真菌多糖包覆QD与Im-FAb检测结果完全一致，表明真菌多糖包覆QD能够代替真菌特异性免疫荧光抗体检测真菌。

表1

实施例二：真菌多糖包覆CdSe量子点的生物合成与应用

下面以平菇菌株合成真菌多糖包覆CdSe量子点为例进行介绍：

(1)菌体培养

从斜面试管中挑取灵芝(Ganoderma lucidum)菌株f6(南开大学菌种保藏中心)，接种于改良高氏培养基平板。将平板置于25℃培养箱中避光静置培养，7-10d后形成发育良好的菌丝体。

将活化的菌丝体转接至盛有改良高氏培养基的三角瓶。将平板置于恒温摇床中，在25℃、180rpm条件下避光培养，5-7d后形成均匀的菌丝发酵液，其中含有大量平菇胞外多糖。

(2)CdSe量子点合成

从摇床中取出菌丝发酵液，添加0.2g/L的亚硒酸钠，1g/L的氯化镉，立即充分混匀。随后再加入2g/L的巯基丁酸(或其他含巯基化合物)，以及1.5g/L的硼氢化钠，立即充分混匀。将混合体系置于摇床中，设置摇床转速为180rpm，在一定培养温度下恒温摇床培养48h，分别得到一定粒径量子点悬液：培养温度与粒径对应关系：25℃，1.0-2.0nm(蓝色)；30℃，2.0-3.0nm(黄色)；35℃，3.5-4.0nm(红色)。

(3)CdSe量子点分离

将合成体系用三层滤纸进行过滤，所得滤液转移至1L烧杯。按滤液与无水乙醇(或工业酒精)比例为1：3的剂量，往烧杯中加入无水乙醇(或工业酒精)，轻轻搅拌，使多糖包覆的CdSe量子点形成絮状物并充分沉淀。移去上清，所得沉淀于室温条件下自然干燥(或真空冷冻干燥)，得到真菌多糖包覆CdSe量子点成品。含乙醇的上清液可反复用于量子点的分离。分离得到的量子点用蒸馏水溶解，供后续使用。

(4)多糖包覆CdSe量子点在细胞成像中的应用

将多糖包覆CdSe量子点溶于生理盐水，得到1mg/ml CdSe量子点溶液。以1:1000比例加入巨噬细胞RAW264.7培养孔中。孵育3-6h后，采用荧光显微镜观察，可以观察到胞内有明显的荧光分布。表明多糖包覆CdSe量子点具有良好的生物相容性，能够有效穿透巨噬细胞，进行细胞成像。