本发明涉及生物技术领域，尤其是3d生物打印技术领域，特别涉及一种表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水及3d打印方法。
背景技术：
3d打印可以快速高效的制造出个性化的产品，因而逐渐被引入到生物医疗行业，以期通过3d打印技术用于组织和器官移植。《生物3d打印的最新研究及应用》(粉末冶金工业，第25卷第4期，2015年8月，张洪宝等)中对3d生物打印技术的应用划分成不同层次进行了介绍，此处引用作为参考。较高层次的3d生物打印的基本方法是，将活细胞接种到生物相容的且最后可生物降解的支架中，然后在生物反应器中进行培养，使得细胞依托支架形成的空间成长生成所需组织。例如，cn106085949a公开了一种基于3d打印成型的重建尿道假体的方法；通过细胞诱导因子分化为类上皮细胞、类平滑肌细胞，然后转化成细胞液滴，该细胞液滴有细胞和培养液水凝胶混合而成，制成可供医用3d打印机使用的生物墨水；选择胶原与藻酸盐混合的水凝胶作为支架材料的支架墨水；通过电脑控制细胞或细胞聚集体，细胞与凝胶间的比例及喷嘴的喷射位置和力度，以电控升降平台控制喷头升降，3d打印机两个喷头逐层交替打印尿道切面。通过体外培养脂肪源性干细胞，诱导其分化成尿路上皮细胞和平滑肌细胞，然后转化成细胞液滴，结合3d打印，在体外重建尿道，然后再将重建的尿道移植到患者身上去。亦即，上述现有3d生物打印技术中用到的3d生物打印材料为两种：一种是包含细胞的生物墨水，一种是用作支架的支架材料。
现有技术关于3d打印的研究方向基本上就是寻找合适的生物墨水和支架材料，例如：cn104399119a公开了一种基于3d生物打印制备高力学性能软骨的方法，其通过蚕丝纤维和明胶溶液制备含软骨干细胞的生物墨水，以pcl材料形成支架(pcl是一种半结晶型聚合物，由ε-己内酯用钛催化剂、二羟基或三羟基引发剂开环聚合制得结构为[ch2-(ch2)4-coo]n的聚酯)。其中生物墨水中含有磷酸缓冲液、藻朊酸钠、明胶、甲基丙烯酸酐溶液、二水合硫酸钙、蚕丝纤维以及uv光引发剂，通过藻朊酸钠与钙离子形成离子键、明胶与甲基丙烯酸酐形成共价键提高凝胶的力学性能，打印完成之后通过uv光照射成型。再比如：cn105238132a中公开了一种用于3d打印的生物墨水，其组成成分包括具有交联功能的水溶性合成聚合物、具有交联功能的水溶性天然高分子、能自发形成特殊超微结构的生物活性组分、交联引发剂和溶剂，进一步还包括生物活性组分；墨水最后同样通过uv光照射固化成型。cn105885436a公开了一种用于3d打印的生物墨水材料及其制备方法和应用，该现有技术其实提供的是支架材料，该支架材料利用生物大分子、预交联剂、促凝剂作为支架墨水材料，打印出来后经过水洗、交联剂予以定型获得抗原性、排斥反应小且具有生物可降解性的软组织支架。
以上介绍的均为包含支架的3d生物打印技术的背景情况，cn103249567a中公开的用于制造组织的装置、系统和方法中，对于3d生物打印的各种材料的组分进行了详细的罗列，其中特别提及现有技术也有无支架3d生物打印技术的尝试，但是无支架技术存在很多限制，例如难以获得复杂的几何形状、难以形成提供组织生产所需养分的血管网络等。因此，该现有技术提供的均为包含支架的3d生物打印解决方案。
事实上正是由于上述原因，现有的3d生物打印技术只能打印很薄的一层组织，因为较厚组织里面没有血管等营养通道，内部的细胞难以获得营养物质，代谢产物无法排出，因而较厚的3d打印组织难以持续成长。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水及3d打印方法，以减少或避免前面所提到的问题。
具体来说，本发明提供了一种表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水及3d打印方法，针对3d生物打印支架体内降解过程中结构可控维持的需求，制备具有表面降解特性的可打印生物高分子材料，可以打印获得含有生物细胞的具备可控降解支架支撑的模型，并且还可以进一步获得多孔的模型，可以为细胞生产提供营养和代谢通道，有利于通过3d打印获得更大更厚的组织结构。
为解决上述技术问题，本发明提出了一种表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水，由一种凝胶墨水和一种支架墨水构成，所述凝胶墨水由水凝胶和生物细胞构成，其中，所述水凝胶由如下组分构成：质量分数10％～40％的plga-peg-plga三嵌段共聚物、质量分数0.001％～1％的细胞生长因子、质量分数0.05～0.3％的消炎止血药物、余量为去离子水；所述支架墨水由所述凝胶墨水的总质量的5％～50％的聚酯碳酸酯酸酐共聚物构成。
进一步地，本发明还提供了一种上述表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：将质量分数10％～40％的plga-peg-plga三嵌段共聚物、质量分数0.001％～1％的细胞生长因子、质量分数0.05～0.3％的消炎止血药物与余量的去离子水共混，搅拌30min，静置1～6小时制成所述水凝胶；将所述水凝胶与所述生物细胞均匀混合成所述3d打印生物墨水的凝胶墨水。
另外，本发明还提供了一种采用上述表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水的3d打印方法，包括如下步骤：
步骤a：采用上述表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水，所述凝胶墨水在低于相转变的温度条件下，加入大豆分离蛋白溶液搅拌均匀，然后加入硫酸钙溶液均匀混合成备用的3d打印凝胶墨水材料；
步骤b：控制3d生物打印机的凝胶墨水仓的温度低于相转变温度，打印台面温度为37摄氏度，采用具有两个同轴布置的喷头的3d打印机，通过所述3d打印机的内周侧喷头打印所述支架墨水形成支架，通过所述3d打印机的外周侧喷头将所述3d打印凝胶墨水材料围绕所述支架打印成模型。
优选地，所述步骤a中，所述生物细胞在制备所述3d打印生物墨水之前，对所述生物细胞进行保护处理：将所述生物细胞与浓度为10％的甘油以及浓度为10％的淀粉溶液均匀混合静置2-3小时。
优选地，上述方法还可以进一步包括如下步骤：
步骤c：将所述模型置于温控箱内，缓慢降低所述温控箱内的温度至0度以下，使所述模型中的水分完全结冰；
步骤d：快速升高所述温控箱内的温度至37摄氏度，使所述模型中的水凝胶完全固化，从而获得含有生物细胞的多孔的结构模型。
优选地，所述步骤c中，以每小时4-5度的速度缓慢降低所述温控箱内的温度至零下15至零下20度。
优选地，所述步骤d中，向所述温控箱内输送37度的干燥热风，使所述模型中的冰快速转换成气体从所述模型逸出，从而在所述模型上形成多孔结构。
优选地，所述方法进一步包括，在获得所述含有生物细胞的所述多孔的结构模型之后，在所述多孔结构中注入血管内皮细胞，使所述血管内皮细胞附着在结构孔隙骨架上，之后将所述模型置于营养溶液中进行培养，通过所述血管内皮细胞生长出血管，所述模型中原有的细胞生长成所需的组织，生长出的血管进一步为所需的组织提供养分和代谢通道。
优选地，所述方法进一步包括：在获得所述含有生物细胞的所述多孔的结构模型之后，将所述模型通过激光均匀打出贯通的平行通孔，用于将模型中的孔洞连通起来，然后在所述多孔结构中注入血管内皮细胞，使所述血管内皮细胞附着在结构孔隙骨架上，之后将所述模型置于营养溶液中进行培养，通过所述血管内皮细胞生长出血管，所述模型中原有的细胞生长成所需的组织，生长出的血管进一步为所需的组织提供养分和代谢通道。
本发明的表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水由凝胶墨水和支架墨水构成，其中凝胶墨水由水凝胶和生物细胞构成，所述水凝胶包括具有温度响应性的plga-peg-plga三嵌段共聚物，所述支架墨水为具有表面降解特性的聚酯碳酸酯酸酐共聚物。本发明利用上述3d打印生物墨水的温敏性以及可表面降解特性，针对3d生物打印支架体内降解过程中结构可控维持的需求，制备具有表面降解特性的可打印生物高分子材料，可以一次打印成型获得含有生物细胞的具备可控降解支架支撑的模型，并且可以获得多孔结构的营养和代谢通道，有利于通过3d打印获得更大更厚的组织结构。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现通过本发明的具体实施方式进行详细说明。
正如背景技术部分所述，现有3d生物打印技术无论选择怎样的生物墨水或者支架材料，均难以克服打印获得的组织缺乏营养和代谢通道的缺陷。因此，本发明提供了一种新的3d打印方法，其可以通过3d打印获得含有生物细胞的无支架支撑或一次成型有支架支撑的模型，并且还可以进一步获得多孔的模型，可以为细胞生产提供营养和代谢通道，有利于通过3d打印获得更大更厚的组织结构。
具体来说，本发明提供一种3d打印方法，包括如下步骤：
步骤a：提供一种由水凝胶和生物细胞构成的3d打印生物墨水，所述3d打印生物墨水为一种凝胶墨水，所述凝胶墨水在低于相转变温度的条件下，加入大豆分离蛋白溶液搅拌均匀，然后加入硫酸钙溶液均匀混合成备用的3d打印凝胶墨水材料。
其中，所述凝胶墨水可以是任何一种现有的由水凝胶和生物细胞构成的3d打印生物墨水，优选所述凝胶墨水为其性状适合于采用3d生物打印机进行打印的生物墨水。
特别优选，所述凝胶墨水为专用于本发明的3d打印方法的材料，其由水凝胶和生物细胞构成。
3d打印生物墨水示例1
本示例提供了一种专用于本发明的3d打印方法的3d打印生物墨水，所述3d打印生物墨水为一种凝胶墨水，所述凝胶墨水由水凝胶和生物细胞构成，其中所述水凝胶由如下组分构成：交联透明质酸、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(n，n-二乙基丙烯酰胺)(pdeaam)、聚(2-羧基-n-异丙基丙烯酰胺)(pcipaam)、聚甲基乙烯基醚、聚乙二醇-聚氧化乙烯(peg-peo)以及去离子水。
在一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数1％的交联透明质酸、质量分数3％的聚(n-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％的聚(n，n-二乙基丙烯酰胺)、质量分数1％的聚(2-羧基-n-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％的聚甲基乙烯基醚、质量分数3％的peg-peo与余量为质量分数86％的去离子水。
在另一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数5％的交联透明质酸、质量分数5％的聚(n-异丙基丙烯酰胺)、质量分数5％的聚(n，n-二乙基丙烯酰胺)、质量分数3％的聚(2-羧基-n-异丙基丙烯酰胺)、质量分数5％的聚甲基乙烯基醚、质量分数5％的peg-peo与余量为质量分数72％的去离子水。
在又一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数3％的交联透明质酸、质量分数4％的聚(n-异丙基丙烯酰胺)、质量分数4％的聚(n，n-二乙基丙烯酰胺)、质量分数2％的聚(2-羧基-n-异丙基丙烯酰胺)、质量分数4％的聚甲基乙烯基醚、质量分数4％的peg-peo与余量为质量分数79％的去离子水。
在还有一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数1％的交联透明质酸、质量分数4％的聚(n-异丙基丙烯酰胺)、质量分数4％的聚(n，n-二乙基丙烯酰胺)、质量分数2％的聚(2-羧基-n-异丙基丙烯酰胺)、质量分数4％的聚甲基乙烯基醚、质量分数5％的peg-peo与余量为质量分数80％的去离子水。
进一步地，本发明还提供了示例1所述3d打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：将质量分数1％-5％的交联透明质酸、质量分数3％-5％的聚(n-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％-5％的聚(n，n-二乙基丙烯酰胺)、质量分数3％-5％的聚甲基乙烯基醚、质量分数3％-5％的聚乙二醇-聚氧化乙烯(peg-peo)与余量的去离子水共混，搅拌30min，静置1～6小时制成所述水凝胶；将所述水凝胶与所述生物细胞均匀混合成所述3d打印生物墨水。
3d打印生物墨水示例2
前述示例1提供了一种适用于本发明的3d打印生物墨水，所述3d打印生物墨水为一种凝胶墨水，所述凝胶墨水由水凝胶和生物细胞构成，可以通过3d打印获得无支架支撑的模型。当然，本领域技术人员应当理解，采用类似的凝胶墨水，也可以与支架墨水配合打印含有支架的模型，与现有含有支架的模型不同的是，本发明的这种含有两种类型的3d打印生物墨水可以通过本发明的3d打印方法，获得多孔的模型，可以为细胞生产提供营养和代谢通道，有利于通过3d打印获得更大更厚的组织结构。
具体来说，本示例提供了另一种专用于本发明的3d打印方法的3d打印生物墨水，所述3d打印生物墨水为一种表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水，其由一种凝胶墨水和一种支架墨水构成，所述凝胶墨水由水凝胶和生物细胞构成，所述支架墨水由表面降解型材料聚酯碳酸酯酸酐共聚物(p(lla-tmc-sa)共聚物)构成；其中所述凝胶墨水的水凝胶由如下组分构成：质量分数10％～40％的plga-peg-plga三嵌段共聚物、质量分数0.001％～1％的细胞生长因子、质量分数0.05～0.3％的消炎止血药物、余量为去离子水；所述支架墨水由所述凝胶墨水的总质量的5％～50％的聚酯碳酸酯酸酐共聚物(p(lla-tmc-sa)共聚物)构成。
本实施例的3d打印生物墨水特别适用于本发明的3d打印方法，其可以通过3d打印一次成型获得含有生物细胞的有支架支撑的模型。即，本示例的3d打印生物墨水也可以应用本发明的3d打印方法同样的原理，其中本示例的凝胶墨水的制备和打印过程与前述示例1中的凝胶墨水相同，支架墨水采用多组分材料梯度打印方式以同轴管形式打印形成在凝胶墨水的内部。
更具体地说，本示例的3d打印生物墨水在利用本发明的3d方法打印的时候，利用两个同轴布置的喷头同时进行打印，其具体步骤与前述打印步骤相同的，不同的仅仅是喷头是同轴布置的两个，其中布置在同轴管内侧的喷头打印本示例的支架墨水，例如表面降解型材料聚酯碳酸酯酸酐共聚物(p(lla-tmc-sa)共聚物)，打印之后形成内部支架；布置在同轴管外侧的喷头打印本实施例的凝胶墨水，打印之后围绕支架形成管状的外层结构，从而利用多组分材料梯度打印技术，构建了类似“同轴管”的双层打印结构。
上述3d打印生物墨水主要采用了plga-peg-plga三嵌段共聚物和p(lla-tmc-sa)共聚物作为可生物降解材料。生物降解材料的降解过程在宏观上可表现为表面降解和本体降解两种基本形式，其中，本申请所采用的plga-peg-plga三嵌段共聚物的降解方式为本体降解，p(lla-tmc-sa)共聚物的降解方式为表面降解。本体降解方式的材料表面和内部同时发生分解、溶解或分子量降低，导致材料强度下降最终出现结构崩解，本体降解材料的特点是降解速度统一、降解时间短。表面降解则是材料在表面发生分解、溶解或分子量降低，材料逐层降解。表面降解方式可保证3d打印生物材料制品在人体内降解过程中功能结构的维持，如药物释放为载体降解速率控制，对生物3d打印制品有特殊价值，p(lla-tmc-sa)共聚物具有表面降解特性，可以与本申请采用的plga-peg-plga三嵌段共聚物配合，可精准控制3d打印生物材料制品的宏观和微观功能结构，调控材料的溶胀率、降解速率，有利于3d打印生物材料制品在体内降解过程中功能结构的维持。
其中，plga-peg-plga三嵌段共聚物可由聚乳酸乙醇酸(plga)与聚乙二醇(peg)聚合形成，在载药和缓释药物领域多有应用，例如，中国专利申请2015103092137中提出了一种plga-peg-plga三嵌段共聚物在载药和缓释药物中的用途及其制备方法，从该现有技术可获得可用于载药和缓释药物的plga-peg-plga三嵌段共聚物，该三嵌段共聚物的载药溶液可以随温度升高发生溶液-凝胶的相转变，相转变温度为35～39℃，且该共聚物还具有可生物降解特性。上述现有技术中提出的plga-peg-plga三嵌段共聚物制备的载药溶液，当温度低于相转变温度时，变为溶液态；当温度达到相转变温度则会变为凝胶态。因此载药溶液存储在低于人体温度条件下适于呈溶液态进行注射，注射到人体后，达到相转变温度则会变为凝胶态，适于在凝胶态进行降解释放药物。
因此，本发明利用plga-peg-plga三嵌段共聚物的温敏性以及可降解特性，特别提出了一种plga-peg-plga三嵌段共聚物的一种新的应用，利用该三嵌段共聚物制备获得可专用于本发明的3d打印生物墨水，该3d打印生物墨水由plga-peg-plga三嵌段共聚物的水凝胶和生物细胞构成。本领域技术人员应当理解，有关plga-peg-plga三嵌段共聚物的制备和特性可以参照上述现有技术或者其它现有的相关文献，也可以根据现有技术调整制备该三嵌段共聚物的方案，以获得合适的相转变温度，这些都不是本发明保护的范围，本发明关注的焦点是针对现有的plga-peg-plga三嵌段共聚物的温敏性以及可降解特性，提出了该三嵌段共聚物在3d打印生物墨水领域的应用。
聚酯碳酸酯酸酐共聚物(p(lla-tmc-sa)共聚物)是一类可降解高分子材料，由于其具有良好的表面溶蚀降解性、生物相容性、结构易改性、降解速度可调及易加工性等优异性能，已在医学前沿领域得到应用。由于p(lla-tmc-sa)共聚物具有独特的表面溶蚀性，其可避免材料在使用过程中，由于大量降解而导致力学性能的急剧下降；p(lla-tmc-sa)共聚物在质量损失达到60％时其力学强度仍可以保持70％～80％。本领域技术人员可按现有技术的制备方法获得本申请的p(lla-tmc-sa)共聚物。同样类似的，本发明关注的焦点是针对现有的p(lla-tmc-sa)共聚物的可表面降解特性，提出了将p(lla-tmc-sa)共聚物作为内部支架，前述三嵌段共聚物作为外部生长基质，从而可以获得一种温敏性、兼具本体和表面降解特性的3d打印生物墨水，并应用于3d打印领域。
例如，本领域技术人员可以参考任何一种现有技术文献，获得一种适用于本发明的p(lla-tmc-sa)共聚物的制备方法。或者，本发明也可以采用如下方法制备本发明的p(lla-tmc-sa)共聚物。
所述制备方法的基本思路是，将两种混酐共聚物缩合共聚制成具有表面降解性的聚酯碳酸酯酸酐共聚物(p(lla-tmc-sa))。
其具体步骤为：
首先，制备端羟基plla-ptmc共聚物
以丙交酯(l-la)和三亚甲基碳酸酯(tmc)为原料，乙二醇为引发剂，辛酸亚锡为催化剂，在氮气保护下，采用开环聚合法在160℃反应8h，得到端基为羟基的plla-ptmc共聚物。将产物用二氯甲烷溶解完全，加入无水甲醇进行沉淀，弃去上清液，反复3次得到白色粘稠状产物(即端羟基plla-ptmc共聚物)，50℃真空干燥至恒重。
其次，制备端羧基plla-ptmc共聚物
将端羟基的plla-ptmc共聚物溶解于经干燥处理过的1,4-二氧六环中，同时加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶(dmap)，在氮气保护下电磁搅拌过夜，合成26h，用旋转蒸发仪除去多余的溶剂，将浓缩液滴入过量的冷无水乙醚中，得到白色粘稠物。将白色粘稠物溶于二氯甲烷中，分别用体积分数为10％的盐酸和饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，将滤液滴入过量的冷无水乙醚中，得白色稠状产物(即端羧基plla-ptmc共聚物)，于40℃真空干燥至恒重。
然后，缩合共聚制备p(lla-tmc-sa)
将端羧基plla-ptmc共聚物与乙酸酐回流30分钟，冷却后，用50℃水浴减压蒸馏，除去过量的乙酸酐以及反应生成的杂酸；残余固体用无水二氯甲烷溶解、去水石油醚沉淀，抽滤，在室温下真空干燥至恒重，得到混酐预聚物1。按照同样的操作，制备癸二酸(sa)与乙酸酐的混酐预聚物2。
将混酐预聚物1和混酐预聚物2按一定比例混合后，在180℃的油浴中、高真空下熔融聚合3h，冷却至室温后，用无水二氯甲烷溶解、去水石油醚沉淀，抽滤，在室温下真空干燥至恒重，得到聚酯碳酸酯酸酐共聚物(p(lla-tmc-sa))。
当然，本领域技术人员应当理解，本领域技术人员也可以参考其它现有技术制备获得本发明所需的上述聚酯碳酸酯酸酐共聚物(p(lla-tmc-sa)共聚物)。本发明关注的重点是利用聚酯碳酸酯酸酐共聚物(p(lla-tmc-sa)共聚物)的表面降解特性，用以实现本发明的技术目的。
细胞生长因子是一种能促进各类细胞增殖的蛋白质分子，具有趋化，增殖和重建作用，在炎症期可诱导成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞等靶细胞向损伤部位移动，修复损伤部分；在增殖期生长因子可促进上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞增殖，促进纤维细胞重排；在重建期加速创伤愈合，减少瘢痕形成，对于骨、关节及神经损伤，细胞生长因子可促进皮肤、皮下组织、骨组织修复及血管、神经重建，促新生血管生成，神经细胞及骨组织再生，在损伤愈合方面起相当重要的作用。
细胞生长因子有碱性成纤细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、神经营养因子、转化生长因子、角质细胞生长因子、血小板衍生生长因子等。
碱性成纤维细胞生长因子促进细胞分裂增殖及促血管生成，是目前已知最强的促细胞生成因子。成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、软骨细胞，成骨细胞，平滑肌细胞、神经元、神经胶质细胞，晶状体上皮细胞，角膜上皮细胞，肾上腺皮质髓质细胞是碱性成纤维细胞生长因子的受体细胞。
表皮生长因子由单核细胞及外胚层细胞合成，刺激体内多种类型组织细胞分裂和增殖、增强细胞移动、分裂生长及细胞间质蛋白生成，如皮肤、角膜、肺、气管和肝再生等。
胰岛素样生长因子由胰岛素样生长因子1型和胰岛素样生长因子2型两个密切相关的小多肽组成的家族，具有促进肌肉蛋白合成，促进成肌细胞的增殖、分化，参与组织修复与再生，从而加速组织愈合。
神经营养因子存在于感觉神经元周围的微量可溶性物质，由神经元的靶细胞产生，特异地促进神经元生长和维持，促进组织损伤修复。
本发明将细胞生长因子引入水凝胶中，优点在于可以给后续配置的生物墨水中的细胞提供营养。运用3d打印技术打印出支架，在支架植入人体后，细胞因子可以促进水凝胶支架上的细胞分化、增值，加速组织重建。
磺胺类药物如磺胺吡啶银、磺胺米隆等；喹诺酮类药物如依诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星等具有抗菌消炎作用。止血药物如安络血、止血敏、止血环酸、路丁等具有加速凝血作用。
在一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数10％的plga-peg-plga三嵌段共聚物、质量分数0.01％的碱性成纤细胞生长因子、质量分数0.05％的磺胺吡啶银、余量为去离子水。
在另一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数15％的plga-peg-plga三嵌段共聚物、质量分数1％的表皮细胞生长因子、质量分数0.2％的诺氟沙星、余量为去离子水。
在又一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数20％的plga-peg-plga三嵌段共聚物、质量分数0.05％的角质细胞生长因子、质量分数0.25％的安络血、余量为去离子水。
在还有一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数25％的plga-peg-plga三嵌段共聚物、质量分数0.5％的胰岛素样生长因子、质量分数0.3％的磺胺米隆和止血敏、余量为去离子水。
在还有一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数40％的plga-peg-plga三嵌段共聚物、质量分数0.001％的神经营养生长因子、质量分数0.15％的氧氟沙星和路丁、余量为去离子水。
进一步地，本发明还提供了示例2所述表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：将质量分数10％～40％的plga-peg-plga三嵌段共聚物、质量分数0.001％～1％的细胞生长因子、质量分数0.05～0.3％的消炎止血药物与余量的去离子水共混，搅拌30min，静置1～6小时制成所述水凝胶；将所述水凝胶与所述生物细胞均匀混合成所述表面降解型聚酯碳酸酯酸酐3d打印生物墨水的凝胶墨水。
特别的，本发明的打印方法中，3d打印凝胶墨水材料在进行3d打印之前，控制温度低于相转变温度，此时凝胶墨水溶液是处于一种低粘稠度的溶胶状态，近似胶体，通过加入大豆分离蛋白溶液搅拌，然后加入少许硫酸钙溶液，例如添加原液(凝胶墨水)体积10％的浓度为5％的大豆分离蛋白溶液，加入原液体积1％-2％的浓度为5-8％的硫酸钙溶液，通过硫酸钙离子中和胶体吸附的电荷使胶体引发凝聚。需要强调的是，此过程需要在打印之前15-30分钟之内配置，以防止胶体凝聚固化难以打印。
需要特别强调的是，本发明的步骤a的3d打印凝胶墨水材料优选在打印之前15-30分钟之内配置完成，并在随后的15-30分钟通过打印喷头打印完成，否则配置的生物墨水容易凝聚固化堵塞喷头。
另外，适用于本发明的生物细胞可以是任何一种脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人的细胞或其组合，其类型取决于所生产的细胞构建体、组织或器官的类型。例如所述细胞可以包括并不限于为收缩性细胞或肌肉细胞、结缔组织细胞、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、胃肠道细胞、肝细胞、胰腺细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、生殖细胞、脂肪细胞、间皮细胞、间质细胞、内胚层源细胞、中胚层源细胞、外胚层源细胞及其组合。在一个优选实施例中，所述细胞为干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导性多能干细胞等。其中生物细胞的添加量根据不同组织、生长速度的不同进行添加。
应当说明的是，本发明特别优选的水凝胶具有温度响应性，其相转变温度范围为20-33摄氏度，当低于相转变温度时，溶液处于低粘稠近似胶体状态。在高于相变温度时，比如34-37摄氏度，甚至到40摄氏度，水凝胶会发生相变，逐渐凝聚固化。加入大豆蛋白溶液和硫酸钙溶液时，必须保持温度在相变温度范围内进行。由于水凝胶具有温度响应性，后续混合而成的生物墨水亦具有温度响应性。优选相转变温度为25-32摄氏度。更优选为28-31摄氏度。
本发明的3d打印方法的步骤a中形成了含有凝胶墨水的备用的3d打印凝胶墨水材料，之后可以按照步骤b进行进一步的操作。
步骤b：控制3d生物打印机的凝胶墨水仓的温度低于相转变温度，打印台面控制温度为37摄氏度，利用凝胶墨水的温度响应性，通过3d打印喷头将所述3d打印凝胶墨水材料打印成模型。
本步骤中，3d打印机可以采用现有任何一种适合于生物体3d打印的打印机，其中前述备用的3d打印凝胶墨水材料置于凝胶墨水仓中，温度保持低于相转变温度，使3d打印凝胶墨水材料的性状稳定便于打印且不易堵塞喷头，而打印机的3d打印喷头可以设置位于温控箱内，并在温控箱内的打印台面上打印形成模型。此时，控制温控箱内的温度为37摄氏度，使得模型能够固化定型。
如果是针对前述示例2中的3d打印生物墨水，所采用的3d打印机可以采用现有的适合于生物体3d打印的具有两个同轴布置的喷头的3d打印机，该3d打印机具有一个凝胶墨水仓和一个支架墨水仓，打印步骤与前述步骤b的原理基本相同，即：控制3d生物打印机的凝胶墨水仓的温度低于相转变温度，打印台面温度为37摄氏度，采用具有两个同轴布置的喷头的3d打印机，通过所述3d打印机的内周侧喷头打印所述支架墨水形成支架，通过所述3d打印机的外周侧喷头将所述3d打印凝胶墨水材料围绕所述支架打印成模型。当然，打印过程中，凝胶墨水是通过3d打印机的布置在同轴管外侧的喷头打印的，支架墨水是通过3d打印机的布置在同轴管内侧的喷头打印的。
应当说明的是，本发明特别优选的凝胶墨水在前述步骤中添加了大豆分离蛋白溶液和硫酸钙溶液进行了预凝聚，打印成模型后凝聚固化。温度的变化和时间的调控使生物墨水具备两种凝聚过程，通过打印喷头打印到温控箱打印台面上时，每次打印的小液滴很容易形成固定的结构，因而本发明的上述特别优选的凝胶墨水可以无需打印一层之后覆盖一层支架材料进行支撑，提供了一种无支架3d生物打印技术。也就是通过本发明的上述3d打印方法的步骤a和步骤b，可以在水凝胶基础上直接获得无需支架支撑的3d打印模型，可以省掉支架的打印时间，无需更换打印头，可以节约打印时间和成本。
当然，本发明并不排除可以通过现有的3d打印机逐层交替打印生物墨水和支架材料形成模型的技术方案，即，为了形成复杂的模型结构，在一个优选实施例中，本步骤进一步包括在温控箱内通过3d打印喷头将所述生物墨水和支架材料逐层交替打印成所述模型，用以通过支架材料对生物墨水提供支撑。其中，所述支架材料可以选自任何一种现有的适用于3d打印的支架材料，包括并不限于纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖及其组合。
或者，如前述示例2所述，本发明的凝胶墨水也可以通过同轴布置的喷头的3d打印机获得与支架墨水配合的内周侧为支架、外周侧为凝胶生长基质的结构模型。
其中，外周侧的凝胶墨水的制备和打印条件与无支架结构模型的打印过程相同，内周侧的支架墨水的熔融温度，例如聚酯碳酸酯酸酐共聚物(p(lla-tmc-sa)共聚物)的熔融温度为100摄氏度以上，因此，支架墨水仓在打印的时候需要保持高温状态，打印之后通过低温固化形成支架。本发明的示例2采用的凝胶墨水和支架墨水具备截然相反的两种相转变过程，凝胶墨水需要在低温状态下以液态打印，通过37摄氏度的台面温度进行固化；而支架墨水需要在100摄氏度以上的高温状态下形成可打印的流体状，同时在37摄氏度的台面温度进行固化。而本发明所采用的同轴管梯度打印方式，可以在两个喷头工作的时候，利用内侧的高温支架墨水加速外侧的低温凝胶墨水固化，同时利用外侧的低温凝胶墨水加速内侧的高温支架墨水的固化。因而，本发明的示例2的3d打印墨水可以大大降低台面温度的控制精度，固化速度更快，打印效率也更高。
进一步地，本发明还可以通过如下的额外步骤，在上述步骤a和步骤b的基础上，对模型进行后续处理，以生成一种多孔的模型结构。
步骤c：将所述模型置于温控箱内(如果模型直接打印在温控箱内，则可以省略将模型置入温控箱的步骤)，缓慢降低所述温控箱内的温度至0度以下，使所述模型中的水分完全结冰。本步骤的作用是通过降温使模型中的水结成冰，从最大密度的水体积膨胀10％，将凝聚的凝胶模型内部撑大形成含冰的孔洞。应当特别提及的是，降温的过程需要十分缓慢，确保模型内的水由液态缓慢凝结，模型结构中的水均匀分散凝结成冰，尽量保持模型的内部结构，否则降温过快会使得模型整体结构破坏，冰融化之后难以保持组织形态。优选在本步骤中，以每小时4-5度的速度缓慢降低所述温控箱内的温度至零下15至零下20度。
需要特别说明的是，当温度降低至零度以下，如果不做保护处理，生物细胞内含有的水分也会结冰，形成的冰晶会损伤细胞的基本结构导致生物细胞丧失活性。因此，要进行步骤c的冷冻过程，需要在前述的步骤a中，在将生物细胞制备成3d打印生物墨水之前，对生物细胞进行保护处理：将生物细胞与浓度为10％的甘油以及浓度为10％的淀粉溶液均匀混合静置2-3小时。本步骤的作用是利用淀粉溶液的胶体将生物细胞包裹起来，利用甘油降低生物细胞内的水分的冰点，在步骤c的缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤，保证生物细胞存活。在一个具体实施例中，浓度10％的甘油和浓度为10％的淀粉溶液的添加量可以分别为生物细胞质量的1-1.5倍和0.5-0.8倍。
另外，本发明的降温过程也不会造成模型坍塌。本发明生物墨水具有两种凝聚过程，一种是3d打印凝胶墨水材料的温度响应性凝聚、一种是加入大豆蛋白和硫酸钙后的时间调控性凝聚。3d生物材料在降温过程中，水分结冰之前可以很好的攀附在大豆蛋白和硫酸钙凝聚形成的骨架上，不至于坍塌。
步骤d：快速升高所述温控箱内的温度至37摄氏度，使所述模型中的水凝胶完全固化，从而获得含有生物细胞的多孔的结构模型。本步骤中，模型缓慢降温至零下15至零下20度之后，在模型体积通常不大的情况下，模型中的水已经全部凝结，此时可以通过快速升温至生物体活性温度的37度，使模型中的水凝胶再次固化，同时模型中的冰融化，在凝胶固化的过程中水分脱出，固化的凝胶结构中含冰的孔洞会保留下来，从而形成了含有生物细胞的多孔结构。
特别的，本步骤中的升温过程与前述的降温过程不同，需要尽快提升模型温度使得结构尽快固化，避免固化缓慢导致孔洞消失。在一个优选实施例中，本步骤中，可以向所述温控箱内输送37度的干燥热风，使所述模型中的冰快速转换成气体从所述模型逸出，从而在所述模型上形成多孔结构。干燥热风可以很快提升温控箱内的温度至37度，同时干燥热风排出了温控箱内的水分，降低了水汽分压，进一步加快了水分转换成气体的速度，因而本实施例可以达到使模型尽快固化形成多孔结构的效果。
在模型上获得的含有生物细胞的多孔结构之后，可以将模型置于营养溶液中进行培养，由于多孔结构为生物细胞提供了获得营养和代谢的通道，因而模型内部的细胞同外部细胞一样均可以获得足够的营养生长，可以通过本发明的这种3d打印方法获得更大更厚的组织结构。
为了避免组织结构生长闭合之后，内部细胞容易缺失养分、代谢不畅而死亡，在另一个优选实施例中，在获得含有生物细胞的多孔的结构模型之后，在所述多孔结构中注入血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在结构孔隙骨架上，之后将模型置于营养溶液中进行培养，通过血管内皮细胞生长出血管，模型中原有的细胞生长成所需的组织，生长出的血管进一步为所需的组织提供养分和代谢通道。进一步地，为了避免多孔结构内部的孔隙不连通，导致生长的血管难以贯通的缺陷，在又一个优选实施例中，可以在获得含有生物细胞的多孔的结构模型之后，将所述模型通过激光均匀打出贯通的平行通孔，用于将模型中的孔洞连通起来。激光打孔获得的通孔直径有限，仅适合于将孔洞连通便于血管内皮细胞以及营养液进入内部孔洞，其后依照上述方式操作，在多孔结构中注入血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在结构孔隙骨架上，之后将模型置于营养溶液中进行培养，通过血管内皮细胞生长出血管。随着血管和组织的生长，激光打孔获得的这些贯通的通孔会被撑大一些，当然，要获得足够厚度和体积的组织，还是主要需要倚靠前述实施例中获得的多孔的结构模型。
本领域技术人员应当理解，虽然本发明是按照多个实施例的方式进行描述的，但是并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案。说明书中如此叙述仅仅是为了清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体加以理解，并将各实施例中所涉及的技术方案看作是可以相互组合成不同实施例的方式来理解本发明的保护范围。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、修改与结合，均应属于本发明保护的范围。