一种生物打印墨水制备方法及打印方法和用途与流程

本发明渉及一种生物打印墨水制备方法及打印方法和用途，属于生物墨水
技术领域：
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背景技术：
在人体组织中，细胞按照一定的规则和顺序进行排列与分布，不同功能的组织，细胞排布也不同。因此，实现对细胞的精确排布是人工构建组织器官的关键。3d生物打印技术是近几年来兴起的一项技术，其已被尝试用于构建复杂的组织和器官。2010年organovo公司推出可以帮助用户制造生物组织用于研究和开发的3d生物打印机。生物墨水是可用于3d生物打印的墨水，理想的生物墨水需要特定的培养基来保证细胞的生存，其既能在打印过程中为细胞提供能量、保证细胞生存，又不能在打印过程中堵塞打印机。目前，研究者一直致力于获得有效的生物打印墨水。传统的生物3d打印方法一般先打印生物相容性好的高分子材料以提供支架，该打印过程较复杂、时间较长。因此，开发有效的生物打印墨水对生物打印技术的发展至关重要。技术实现要素：为了克服现有技术中存在的不足，本发明目的是提供一种生物打印墨水制备方法及打印方法和用途。其生物打印墨水与细胞混合后即可用于生物3d打印，所用材料价格便宜，容易制备，并且生物相容性很好，在培养液中稳定性较好并支持细胞增殖。为了实现上述发明目的，解决已有技术中所存在的问题，本发明采取的技术方案是：一种生物打印墨水，按质量百分比计包括以下组分：4-20％的明胶、1-8％的海藻酸钠、0.5-5％的羟乙基纤维素，其余为无菌生理盐水，所述明胶、海藻酸钠、羟乙基纤维素及无菌生理盐水质量百分比总和为100/100；一种生物打印墨水的制备方法，包括以下步骤：步骤1、将明胶、海藻酸钠、羟乙基纤维素按质量百分比依次加入到方形培养皿中，充分搅匀混合，紫外照射12-24小时；步骤2、将步骤1中照射后的明胶、海藻酸钠、羟乙基纤维素和无菌生理盐水加入蜀牛瓶中，并在70-90℃磁力搅拌加热1-3小时，使各组分全部溶解，形成混合物；步骤3、将步骤2中得到的混合物在常温下放置2-3小时，随后在70-90℃烘箱中放置1-2小时；步骤4、将步骤3重复3次，制得目标材料生物打印墨水。一种生物打印墨水的生物打印方法，包括以下步骤：步骤1、将细胞悬液与权利要求1步骤4得到的生物打印墨水按：1：1-15的体积比充分混合并置于生物打印机墨盒中，打印得到组织块，所述细胞悬液选自hepg2细胞悬液、lo2细胞悬液、mcf7细胞悬液、caco2细胞悬液、lx2细胞悬液、huvec细胞悬液、eahy926细胞悬液、c28/i2细胞悬液、t/gha-vsmc细胞悬液中的一种或两种，所述生物打印机选自挤压型3d生物打印机；步骤2、采用浓度为1-3％cacl2溶液对步骤1由生物打印机打印后得到的组织块进行交联，得到打印的组织；步骤3、将步骤2得到的打印的组织采用细胞培养液漂洗三次，并在35-40℃下孵育培养，所述细胞培养液选自杜氏改良伊格尔培养基-高糖即dmem高糖培养液、杜氏改良伊格尔培养基、营养混合物f-12即dmem/f12培养液或1640培养液中的一种或两种。制备的生物打印墨水在生物打印方面中的应用。本发明有益效果是：与已有技术相比，本发明制备的生物打印墨水与细胞混合后即可用于生物3d打印，所用材料价格便宜，容易制备，并且生物相容性很好，在培养液中稳定性较好并支持细胞增殖。附图说明图1是本发明实施例1制得的生物打印墨水的成品图片图。图2是本发明实施例4中hepg2细胞在不同浓度浸提液中增殖的条形统计图。图3是本发明实施例6中的mtt检测细胞增殖的结果示意图。图4是本发明实施例6中hoechst及pi进行染色检测凝胶中细胞活性过程的细胞图片图。图中：a为hoechst染色(200x)图，b为pi染色(200x)图，c为明场细胞(200x)图，d为hoechst染色细胞负载凝胶(4x)图，e为活死染色融合图；f为细胞明场图，箭头所指为分裂增殖细胞。图5是本发明实施例11中打印得到的人耳示意图。图6是本发明实施例12中打印过程中的实心管状结构组织示意图。图7是本发明实施例12中管状物的灌注示意图。图中：a为未灌注前管，b为灌注后管。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1生物打印墨水的制备称取明胶12g、海藻酸钠4.8g、羟乙基纤维素3g，在方形培养皿中充分搅匀混合，紫外照射18小时；将上述照射后的组分和60ml无菌生理盐水加入至蜀牛瓶中，80℃磁力搅拌加热2小时；待全部溶解后，常温放置2小时，然后置于80℃烘箱1小时，如此重复3次，获得无菌的生物打印墨水，如图1所示。实施例2生物打印墨水的制备称取明胶4g、海藻酸钠8g、羟乙基纤维素5g，在方形培养皿中充分搅匀混合，紫外照射18小时；将上述照射后的组分和83ml无菌生理盐水加入蜀牛瓶中，80℃磁力搅拌加热2小时；待全部溶解后，常温放置2小时，然后置于80℃烘箱1小时，如此重复3次，获得无菌的生物打印墨水。实施例3生物打印墨水的制备称取明胶20g、海藻酸钠1g、羟乙基纤维素0.5g，在方形培养皿中充分搅匀混合，紫外照射18小时；将上述照射后的组分和78.5ml无菌生理盐水加入蜀牛瓶中，80℃磁力搅拌加热2小时；待全部溶解后，常温放置2小时，然后置于80℃烘箱1小时，如此重复3次，获得无菌的生物打印墨水。实施例4生物相容性检测将实施例1制得的0.5g生物打印墨水浸没在添加了10％fbs(胎牛血清)的5ml杜氏改良伊格尔培养基-高糖(dmem高糖)培养液中48h，获得浸提液，将该浸提液浓度确定为100％，然后对该浸提液进行稀释分别获得浓度为50％、25％、10％、5％的浸提液。，将上述不同浓度的浸提液作用于肝肿瘤hepg2细胞，分别检测24h、48h及72h的细胞毒性。如图2所示，为hepg2细胞在不同浓度浸提液中增殖的条形统计图，其中各检测时间点对应的条形图各条形从左到右对应的浸提液浓度分别为：0％、5％、10％、25％、50％、100％。参见表1，为细胞相对增值率(rgr)和毒性分级(cts)。参见表2，为hepg2细胞在不同浓度浸提液的rgr及细胞毒性分级cts。表1.细胞相对增殖率(％)细胞毒性分级≥100075-99150-74225-4931-244＜15表2.表2的结果显示：hepg2细胞在不同浓度浸提液的细胞毒性分级cts均在1以下，完全符合国家医用生物材料细胞毒性要求。实施例5生物墨水在细胞培养液中的稳定性将生物打印墨水浸泡在添加了10％fbs的杜氏改良伊格尔培养基-高糖(dmem高糖)培养液中，在培养箱中连续培养96h，生物打印墨水在培养液中稳定性良好。随着时间变化形态并未坍塌，一直保持立体结构。实施例6肝细胞及肝癌细胞的打印将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5ml生物打印墨水与0.5ml的hepg2细胞悬液和0.5ml的lo2细胞悬液在10ml离心管中混合均匀，4000转/分钟，离心1分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，经浓度为1.5％氯化钙水溶液交联1分钟，得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(dmem高糖)培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养，分别在24、48和72小时用mtt法检测细胞增殖情况，并用hoechst及pi进行染色检测凝胶中细胞活性。参见图3，为mtt检测细胞增殖的结果示意图，其中3l和3h分别代表lo2细胞和hepg2细胞的增殖结果。图3的结果显示：经打印后的三维lo2细胞和hepg2细胞培养72小时后，相对吸光值明显增加，即细胞增殖情况良好。参见图4，为hoechst及pi进行染色检测凝胶中细胞活性过程的细胞图片图。其中a为hoechst染色(200x)图，b为pi染色(200x)图，c为明场细胞(200x)图，d为hoechst染色细胞负载凝胶(4x)图，e为活死染色融合图；f为细胞明场图，箭头所指为分裂增殖细胞。检测结果显示：细胞在本发明的生物打印墨水中生长状态良好，细胞活性高达90％，且增殖分裂。实施例7肝星状细胞的打印将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5ml生物打印墨水与0.8ml的lx2细胞悬液在10ml离心管中混合均匀，4000转/分钟，离心1分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，经浓度为1.5％氯化钙水溶液交联1分钟，得到打印的组织，采用商品化的1640培养液对打印的组织漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养。实施例8乳腺癌细胞的打印将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5ml生物打印墨水与0.5ml的mcf7细胞悬液在10ml离心管中混合均匀，4000转/分钟，离心1分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，经浓度为1.5％氯化钙水溶液交联1分钟，得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基和营养混合物f-12(dmem/f12)培养液漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养。实施例9结肠癌细胞的打印将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5ml生物打印墨水与0.5ml的caco2细胞悬液在10ml离心管中混合均匀，4000转/分钟，离心1分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，经浓度为1.5％氯化钙水溶液交联1分钟，得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(dmem高糖)培养液漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养。实施例10血管内皮细胞的打印将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5ml生物打印墨水与0.5ml的huvec或0.5ml的eahy926细胞悬液在10ml离心管中混合均匀，4000转/分钟，离心1分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，经浓度为1.5％氯化钙水溶液交联1分钟，得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基和营养混合物f-12(dmem/f12)培养液漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养。实施例11软骨细胞的打印将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5ml生物打印墨水与0.5ml的c28/i2细胞悬液在10ml离心管中混合均匀，4000转/分钟，离心1分钟取出放置在生物打印机墨盒中，打印得到组织块，经浓度为1.5％氯化钙水溶液交联3分钟，得到打印的组织，采用杜氏改良伊格尔培养基-高糖(dmem高糖)培养液漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养。参见图5，即为c28/i2细胞打印后的耳组织，结果显示其结构为立体结构。实施例12平滑肌细胞的打印将生物打印墨水在37℃培养箱预先温育1小时，然后取5ml生物打印墨水与0.5ml的t/gha-vsmc细胞悬液在10ml离心管中混合均匀，4000转/分钟，离心1分钟取出放置在生物打印机墨盒中，在浓度为3％的氯化钙溶液上方打印，打印完成30秒后，将打印物转移至含有无菌pbs的培养皿中，注射器针头插入实心管状打印物一端，注入37℃无菌pbs以脱除未交联生物墨水，随后注入浓度为3％的氯化钙溶液，最后排空，得到管状结构，采用杜氏改良伊格尔培养基和营养混合物f-12(dmem/f12)培养液漂洗3次，在37℃培养箱中孵育培养。参见图6为打印过程中形成的实心管状打印物，参见图7为含有罗丹明b的培养液灌注图，其中a为未灌注前管，b为灌注后管，结果显示此管状结构可正常灌注。当前第1页12