一种将黑芝麻黑色素修饰为水溶性黑色素的方法与流程

本发明涉及黑色素溶解度修饰方法领域，特别是一种将黑芝麻黑色素修饰为水溶性黑色素的方法。

背景技术：

黑色素（melanin）普遍存在于生物界中，是目前已知生物色素中来源较广泛的色素之一，是一类结构复杂多样的酚类或吲哚类生物大分子色素的总称。根据结构上的差异，可分为真黑色素（eumelanins）、棕黑色素（phaeomelanins）以及异黑色素（allomelanins）三种类型。黑色素具有很多独特的功能特性，不仅能作为一类光保护剂、抗辐射剂、螯合剂、生物抗氧化剂和免疫促进剂，而且还可作为一类生物半导体材料。近年来的研究还发现，黑色素具有抗蛇毒、抗癌、抑制艾滋病毒复制、治疗帕金森症等作用，在医药、化妆品、食品、电子等领域有着广泛的应用前景。

但是大多黑色素不溶于水及大多有机溶剂，仅溶于碱性溶液，在酸性溶液中沉淀，这些特殊性质导致其在食品、医疗等领域的应用受到限制。将碱溶性黑色素修饰成水溶性黑色素，便于其开发及应用，充分发挥其生物学功能，对于扩展黑色素的应用领域和适用范围具有积极意义。目前，黑色素的市场主要以化学合成为主。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：如何解决现有技术中存在的不足，提供一种将黑芝麻黑色素修饰为水溶性黑色素的方法。

本发明所采用的技术方案是：一种将黑芝麻黑色素修饰为水溶性黑色素的方法，将氨基酸、水、黑芝麻黑色素混合后在惰性气氛氮气下进行修饰反应，然后分离，得到水溶性黑色素，其中，黑芝麻黑色素的质量、氨基酸的质量、水的体积比为1g：（0.5-3）g：（50-80）ml，所述氨基酸为l-精氨酸、dl-精氨酸或dl-组氨酸中的一种。

作为一种优选方式：所述修饰反应的条件为，在惰性气氛氮气下搅拌下进行，搅拌速度为200-800rpm，时间为5-20min，温度为25-37℃。

作为一种优选方式：所述分离的过程为，将修饰产物进行离心处理，得到上清液，其中，所述离心处理的条件为：转速：8000-12000r/min，时间：5-10min；将上清液进行透析处理后进行冷冻干燥，其中，透析处理的条件为，透析袋的分子截留量为1000-2000d，透析时间为36-48h，冷冻干燥的条件为，温度为零下40℃至零下45℃，压力为5-13pa。

作为一种优选方式：所述黑芝麻黑色素的制备步骤位：

a、将黑芝麻与碱液混合后进行超声处理，得到第一混合液；

b、将步骤a所得第一混合液进行过滤，得到滤液产物；

c、将步骤b所得滤液产物使用酸液调节ph值至1.0-3.0后进行离心处理，将离心所得沉淀进行真空冷冻干燥，得到黑芝麻黑色素粗品；

d、将步骤c所得黑芝麻黑色素粗品溶于碱液后采用酸液调节ph为1.0-3.0，然后进行离心处理，得到一次处理黑芝麻黑色素粗品；

e、将步骤d所得一次处理黑芝麻黑色素粗品采用酸液进行酸解处理，然后离心得到二次处理黑芝麻黑色素粗品；

f、将步骤e所得二次处理黑芝麻黑色素粗品采用有机溶剂进行洗涤和离心，得到三次处理黑芝麻黑色素粗品；

g、将步骤f所得三次处理黑芝麻黑色素进行水洗后真空冷冻干燥得到所需的黑芝麻黑色素纯品。

作为一种优选方式：步骤a中，所述碱液为1-3mol/l的naoh溶液，黑芝麻的质量与碱液体积的比例为1g：（1-5）ml，超声处理的条件为，频率为40-60hz，时间为40-180min；

步骤b中过滤的方式为抽滤；

步骤c中所述酸液为2-8mol/l盐酸，离心处理的转速为8000-12000r/min，离心处理的时间为5-10min，真空冷冻干燥的条件为：温度为零下60℃至零下80℃，压力为4-15pa；

步骤d中所述碱液为1-3mol/lnaoh溶液，黑芝麻黑色素粗品的质量与碱液的体积的比例为1g：（1-5）ml，酸液为2-8mol/l盐酸，离心处理的转速为8000-12000r/min，离心处理的时间为5-10min；

步骤e中所述酸液为2-8mol/l盐酸，一次处理黑芝麻黑色素粗品的质量与酸液的体积的比例为1g：（1-5）ml，酸解处理的条件为，温度为90-100℃，时间为60-180min；

步骤f中依次采用氯仿、乙酸乙酯和乙醇进行洗涤，二次处理黑芝麻黑色素粗品的质量与每种有机溶剂的体积的比例为1g:（5-40）ml，离心的条件为：转速为8000-12000r/min，时间为5-10min；

步骤g中真空干燥的条件为，温度为零下60℃至零下80℃，压力为4-15pa。

本发明的有益效果是：本发明能够有效地将黑芝麻黑色素修饰为水溶性黑色素，从而克服黑芝麻黑色素因不溶于水而不适用于制备口服制剂以及食品色素添加剂、染色剂、医药、保健品等的问题，对于拓展黑芝麻黑色素的应用范围具有积极的意义。

附图说明

图1为不同种类氨基酸对黑芝麻黑色素的修饰效果图；

图2为黑芝麻黑色素和l-精氨酸的质量比与修饰率的对应关系曲线图；

图3为黑芝麻黑色素和dl-精氨酸的质量比与修饰率的对应关系曲线图；

图4为黑芝麻黑色素和dl-组氨酸的质量比与修饰率的对应关系曲线图；

图5为黑芝麻黑色素的红外谱图；

图6为l-精氨酸/黑色素的红外谱图；

图7为dl-精氨酸/黑色素的红外谱图；

图8为dl-组氨酸/黑色素的红外谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

将氨基酸、水和黑芝麻黑色素混合后在惰性气氛氮气下进行反应，然后经分离，得到水溶性黑色素。其中，黑芝麻黑色素的质量、氨基酸的质量和水的体积比为1g：（0.5-3）g：（50-80）ml，所述氨基酸为l-精氨酸、dl-精氨酸或dl-组氨酸。

称取黑芝麻30g，溶于1-3mol/l（优选2mol/l）naoh溶液中，黑芝麻的质量与naoh溶液的体积比例为1g：（1-5）ml（优选1g：3ml），超声条件为40-60hz（优选60hz）、200-400w（优选200w），提取时间40-180min（优选120min），获得第一混合液。

将第一混合液抽滤获得滤液产物。

将所得滤液产物进行酸液调节ph值后进行离心处理，将所得沉淀进行真空冷冻干燥，得到冷冻干燥产物为黑芝麻黑色素粗品。所述酸液为2-8mol/l（优选6mol/l）盐酸溶液，所调节ph为1.0-3.0（优选2.0），静置待黑色素沉淀，使用高速离心机8000-12000r/min（优选9000r/min）、离心5-10min（优选5min）去除上清液，得沉淀。利用真空冷冻干燥机，在-60℃～-80℃、4-15pa压力条件下真空冷冻干燥后，即得黑芝麻黑色素粗品，可以将得到的黑芝麻黑色素粗品在4℃下保存。

将黑芝麻黑色素粗品溶于碱液后采用酸液调节ph，然后进行离心处理，黑芝麻黑色素粗品的质量与碱液的体积的比例为1g：（1-5）ml（优选1g：2ml），所述碱液为1-3mol/l（优选2mol/l）naoh溶液，也就是将黑芝麻黑色素的粗品重溶于1-3mol/lnaoh溶液中，酸液为2-8mol/l（优选6mol/l）盐酸，用2-8mol/l盐酸溶液调节ph值至1.0-3.0（优选2.0），8000-12000r/min离心（优选9000r/min），离心5-10min（优选5min）除去上清液，收集固体，该步骤重复3次以上（优选3次），得到一次处理黑芝麻黑色素粗品。

将一次处理黑芝麻黑色素粗品采用酸液进行酸解处理，然后水洗和离心，得到二次处理黑芝麻黑色素粗品。其中，所述酸液为2-8mol/l（优选6mol/l）hcl溶液，一次处理黑芝麻黑色素粗品的质量与酸液的体积的比例为1g：（1-5）ml（优选1g：3ml），加热到90-100℃（优选100℃）水浴中酸解60-180min（优选90min）以除去蛋白质、碳水化合物和脂质等杂质，除去盐酸，离心水洗黑色素沉淀，直到检测水洗液中不含有cl^-。

将二次处理黑芝麻黑色素粗品采用有机溶剂进行洗涤和离心，得到三次处理黑芝麻黑色素粗品。依次采用氯仿、乙酸乙酯和乙醇进行洗涤，该步骤重复3次以上（优选3次），二次处理黑芝麻黑色素粗品的质量与每种有机溶剂的体积的比例为1g:（5-40）ml（优选1g:10ml），离心的条件为：转速为8000-12000r/min（优选9000r/min），时间为5-10min（优选5min）。

将二次处理黑芝麻黑色素粗品的质量与氯仿的体积按照比例1g：10ml充分摇匀，以9000r/min的转速离心5min除去上清液，收集固体，重复该步骤3次，至上清液为无色；再将上一步骤得到的固体的质量与乙酸乙酯的体积按照比例1g：10ml充分摇匀，以9000r/min的转速离心5min除去上清液，收集固体，重复该步骤3次，至上清液为无色；最后将上一步骤得到的固体的质量与无水乙醇的体积按照比例1g：10ml充分摇匀，以9000r/min的转速离心5-10min除去上清液，收集固体，即为三次处理黑芝麻黑色素粗品，重复该步骤3次，至上清液为无色。

将三次处理黑芝麻黑色素粗品进行水洗后真空冷冻干燥，获得所需的黑芝麻黑色素纯品。可以进行多次水洗，用真空冷冻干燥机在-60～-80℃、4-15pa压力条件下真空冷冻干燥后，即得纯度较高的黑芝麻黑色素，可以在4℃下保存。通过以上步骤制备出纯度较高的黑芝麻黑色素。在接下来的黑芝麻黑色素的修饰过程中，黑芝麻黑色素与l-精氨酸的质量比可以为1:（0.5-3）；黑芝麻黑色素与dl-精氨酸的质量比可以为1:（0.5-3）；黑芝麻黑色素与dl-组氨酸的质量比可以为1:（0.5-3）。

所述修饰的条件为，在惰性气体氮气在搅拌下进行，搅拌速度为200-800rpm，时间为5-20min，温度为25-37℃。

所述分离的步骤为，修饰产物进行离心处理，得到上清液，其中，所述离心处理的条件为：转速为8000-12000r/min，时间为5-10min；将所述上清液进行透析处理后进行冷冻干燥，其中，所述透析处理的条件包括：透析袋的分子截留量为1000-2000d，透析时间为36-48h，所述冷冻干燥的条件包括：温度为零下40℃至零下45℃，压力为5-13pa。

通过上述技术方案，能够有效地将黑芝麻黑色素修饰为水溶性黑色素，从而克服黑芝麻黑色素因不溶于水而不适用于制备口服制剂以及食品色素添加剂、染色剂、医药、保健品等的问题，对于拓展黑芝麻黑色素的应用范围具有积极的意义。

实施例1

本实施例中：取l-精氨酸0.9g加入30ml蒸馏水进行溶解，再准确称取黑芝麻黑色素0.6g，分别投料于100ml三口反应器中，接通冷凝管及机械搅拌装置，温度为25℃，在惰性气体氮气氛围下，以200rpm的转速机械搅拌，混合5min之后取出，采用11000r/min离心5min，收集上清液。然后将上清液放入分子截留量为1000d的透析袋中透析48h后取出，用真空冷冻干燥机在-40～-45℃、5~13pa压力条件下干燥成品，即得到固体成品水溶性黑芝麻黑色素。

实施例2

本实施例中：取dl-精氨酸0.8g加入48ml蒸馏水进行溶解，再准确称取黑芝麻黑色素0.4g，分别投料于100ml三口反应器中，接通冷凝管及机械搅拌装置，温度25℃，在惰性气体氮气氛围下200rpm机械搅拌混合5min之后取出，采用11000r/min离心5min，收集上清液，然后将上清液放入分子截留量为1000d的透析袋中透析48h后取出，用真空冷冻干燥机在-40～-45℃、5~13pa压力条件下干燥成品，即得到固体成品水溶性黑芝麻黑色素。

实施例3

本实施例中：取dl-组氨酸1g加入80ml蒸馏水进行溶解，再准确称取黑芝麻黑色素0.4g，分别投料于100ml三口反应器中，接通冷凝管及机械搅拌装置，温度25℃，在惰性气体氮气氛围下200rpm机械搅拌混合6min之后取出，采用11000r/min离心5min，收集上清液。然后将上清液放入分子截留量为1000d的透析袋中透析48h后取出，用真空冷冻干燥机在-40～-45℃、5~13pa压力条件下干燥成品，即得到固体成品水溶性黑芝麻黑色素。

对比实验例

水溶性黑色素制备过程：取l-精氨酸、dl-精氨酸、dl-组氨酸、l-蛋氨酸、l-天冬酰胺各0.5g分别加入40ml蒸馏水进行溶解生成5份混合物，另外准备一份40ml蒸馏水作为对照不加入氨基酸，这样就生成6份，分别投料于6个100ml三口反应器中。再准确称取6份黑芝麻黑色素，每份0.5g，分别投料于上述6个100ml三口反应器中，接通冷凝管及机械搅拌装置，在惰性气体氮气氛围下500rpm机械搅拌混合8min，温度30℃。之后取出，采用10000r/min离心10min后收集上清液，稀释相同倍数后测其od500值，吸光值越高表明溶解效果越好。图1为不同种类氨基酸对黑芝麻黑色素的修饰效果图。如图1所示，其中以l-精氨酸、dl-精氨酸、dl-组氨酸修饰的黑色素吸光度最大，od500值分别为0.327、0.320、0.18；而以蛋氨酸、天冬酰胺修饰的黑色素od500值分别为0.099、0.094，其修饰效果次于以l-精氨酸、dl-精氨酸和dl-组氨酸修饰黑色素。

为获得黑芝麻黑色素修饰物成品，将上述步骤中离心后取得的上清液，放入1000d的透析袋中透析48h后取出，用真空冷冻干燥机在-40℃～-45℃、5~13pa压力条件下真空冷冻干燥后，即得到固体成品水溶性黑芝麻黑色素。对得到的固体成品水溶性黑芝麻黑色素进行溶解性实验，结果表明l-精氨酸/黑色素、dl-精氨酸/黑色素、dl-组氨酸/黑色素水溶性效果比l-蛋氨酸/黑色素、l-天冬酰胺/黑色素的水溶性效果更好。

为了进一步确定l-精氨酸、dl-精氨酸和dl-组氨酸修饰黑芝麻黑色素的质量比，以下进行试验，具体如下：

验证例1

取l-精氨酸0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9g分别加入6份50ml蒸馏水进行溶解，再准确称取6份黑芝麻黑色素，每份0.3g，分别投料于100ml三口反应器中（黑芝麻黑色素与l-精氨酸的质量比为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3），后续实验步骤同实施例1，将得到的6份固体成品水溶性黑芝麻黑色素稀释相同倍数后测其od500值。图2为一示例性实施例提供的黑芝麻黑色素和l-精氨酸的质量比与修饰率的对应关系曲线图。如图2所示，当l-精氨酸加入量增加时其修饰黑色素溶解量增大，且当质量比为1:2.5时，其修饰黑色素可完全溶解，od500值为0.600，达到最大，继续加大l-精氨酸量，则od500值不再增加，反而降低。可见，黑芝麻黑色素与l-精氨酸的质量比为1:2.5较佳。

验证例2

取dl-精氨酸0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9g分别加入6份50ml蒸馏水进行溶解，再准确称取6份黑芝麻黑色素，每份0.3g，分别投料于100ml三口反应器中（黑芝麻黑色素与dl-精氨酸的质量比为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3），后续实验步骤同实施例1，将得到的6份固体成品水溶性黑芝麻黑色素稀释相同倍数后测其od500值。图3为一示例性实施例提供的黑芝麻黑色素和dl-精氨酸的质量比与修饰率的对应关系曲线图。如图3所示，当dl-精氨酸加入量增加时其修饰黑色素溶解量增大，且当质量比为1:2时，其修饰黑色素可完全溶解，od500值为0.539，达到最大，继续加大dl-精氨酸量，则od500值不再增加，反而降低。可见，黑芝麻黑色素与dl-精氨酸的质量比为1:2较佳。

验证例3

取dl-组氨酸0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9g分别加入6份50ml蒸馏水进行溶解，再准确称取6份黑芝麻黑色素，每份0.3g，分别投料于100ml三口反应器中（黑芝麻黑色素与dl-组氨酸的质量比为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3），后续实验步骤同实施例1，将得到的6份固体成品水溶性黑芝麻黑色素稀释相同倍数后测其od500值。图4为一示例性实施例提供的黑芝麻黑色素和dl-组氨酸的质量比与修饰率的对应关系曲线图。如图4所示，当dl-组氨酸加入量增加时，其修饰黑色素溶解量增大，且当质量比为1:1.5时，黑色素可完全溶解，od500值为0.446，达到最大，继续加大dl-组氨酸量，则od500值不再增加，反而降低。可见，黑芝麻黑色素与dl-组氨酸的质量比为1:1.5较佳。

溶解度的测定

将修饰前后的黑芝麻黑色素分别溶于不同的溶液中，观察溶解性及溶液颜色。表1示出了黑芝麻黑色素、l-精氨酸/黑色素、dl-精氨酸/黑色素和dl-组氨酸/黑色素的溶解性结果。其中，加号越多表示溶解度越高，减号越多表示溶解度越低。如表1所示，未经修饰前，黑芝麻黑色素微溶于水（+--），仅溶于1mol/lnaoh碱性水溶液和二甲基亚砜（dmso）溶液（+++），在酸性溶液（1mol/lhcl）中沉淀（---）。经过氨基酸修饰后，l-精氨酸/黑色素、dl-精氨酸/黑色素、dl-组氨酸/黑色素均可溶于蒸馏水中（+++），均具有较好的水溶性。图5为一示例性实施例提供的黑芝麻-黑色素、l-精氨酸-黑色素、dl-组氨酸-黑色素的溶解性结果图。

表1

水溶性黑色素的表征

将修饰前与修饰后的2mg黑芝麻黑色素，分别与400mg干燥的kbr混匀压片，采用ft-ir6700傅立叶变换红外光谱仪于4000~400cm^-1区间进行红外光谱测定。

红外光谱可以表征黑色素结构中的主要功能性基团。图5为一示例性实施例提供的黑芝麻黑色素的红外谱图。如图5所示，黑芝麻黑色素和其他天然黑色素一样，其红外光谱是一系列宽而强的吸收峰，呈现出结构复杂的生物大分子化合物特征，并且每一宽峰都是由多种官能团振动相叠加的结果，缺乏特征性。黑芝麻色素的特征吸收主要有：(1)在3408cm^-1存在较强的共振吸收，是由-oh、-nh2，同时该区域也属于-cooh的伸缩振动。（2）在2940～吸收主要2900cm^-1附近（2923cm^-1）存在着相对较弱的吸收峰，反映烷烃结构的c-h伸缩振动。（3）在1618cm^-1左右有芳环骨架振动引起较强的吸收峰，为芳香环骨架c=c的振动吸收，说明黑芝麻黑色素分子结构中有苯环的存在。（4）1125～1000cm^-1处（1075.62cm^-1）的吸收峰，部分由c-ch3的弯和骨架振动吸收参与并形成。（5）在865～660cm^-1范围内的吸收较弱，表示芳环被取代，形成了共轭体系，芳氢含量较少。综上，黑芝麻黑色素可能具有的官能团有：-oh、-nh2、-cooh、c-h、c=c、c-ch3。

图6为一示例性实施例提供的l-精氨酸/黑色素的红外谱图。对比分析图5和图6可以看出，修饰前后的黑芝麻黑色素除具有大多黑色素普遍的特征吸收峰外，l-精氨酸/黑色素在3200cm^-1、1405.42cm^-1、1020cm^-1、622.87cm^-1处有l-精氨酸的特征吸收峰；与黑芝麻黑色素相比较，在1432.08cm^-1、1267.99cm^-1处l-精氨酸/黑色的峰强度减弱，这可能是由于l-精氨酸修饰后基团的振动发生了改变。这些结果表明l-精氨酸对黑芝麻黑色素有较好的修饰性作用。

图7为一示例性实施例提供的dl-精氨酸/黑色素的红外谱图。对比分析图5和图7可以看出，修饰前后的黑芝麻黑色素除具有大多黑色素普遍的特征吸收峰外，dl-精氨酸/黑色素在1020cm^-1处有dl-精氨酸的特征吸收峰；并且与黑芝麻黑色素相比较，黑芝麻黑色素的1432.08cm^-1.处的峰向右移动到1404.05cm^-1处，1269.67cm^-1处峰强度减弱，480cm^-1处峰消失，可能是由于dl-精氨酸修饰后基团的振动发生了改变。这些结果表明dl-精氨酸对黑芝麻黑色素有较好的修饰性作用。

图8为一示例性实施例提供的dl-组氨酸/黑色素的红外谱图，对比分析图5和图8可以看出，修饰前后的黑芝麻黑色素除具有大多黑色素普遍的特征吸收峰外，dl-组氨酸/黑色素在1020cm^-1、625.55cm^-1处有dl-组氨酸的特征吸收峰；并且与黑芝麻黑色素相比较，1432.08cm^-1处的峰向右移动到1405.14cm^-1处，可能是由于dl-组氨酸修饰后基团的振动发生了改变。这些结果表明dl-组氨酸对黑芝麻黑色素有较好的修饰性作用。