发光体、发光体的制造方法和生物体物质标记剂与流程

1.本发明涉及发光体、发光体的制造方法和生物体物质标记剂，更详细而言，涉及适于构成生物体的生物体物质的标记(生物标志物)的发光体和其制造方法以及具备该发光体的生物体物质标记剂。


背景技术：

2.近年来，在生物医学领域中，对生物体物质赋予荧光性而以高灵敏度且多种颜色对图像进行动态解析，在再生医疗、癌症治疗等中确认给药效果、细胞状态的生物成像技术受到关注。在该生物成像技术中，使由超微粒化的半导体纳米粒子构成的发光体吸附于生物体组织，对该发光体照射光而使发光体发光，检测生物体信息。因此，仅对生物体内的发光体照射光就能够确认生物体物质的状态，所以与pet(positron emission tomography；正电子放射断层造影)、ct(computed tomography；计算机断层扫描)相比，可期待实现简便且安全的诊查。
3.这种生物成像技术一直以来认为优选使用波长在700～1700nm的近红外区域产生荧光现象的发光体。即，在波长比近红外区域短的从400nm到小于700nm的可见光区域中，血红蛋白等生物构成物质的吸收大。另外，如果波长变长超过1700nm，则水分的吸收变大，光难以以高效率在生物体内透过。与此相对，认为波长700～1700nm的近红外区域、特别是波长700～1000nm的区域在生物体内的透光性高，适于生物成像技术。
4.另一方面，对于半导体纳米粒子，一直以来在各种技术领域中积极地进行研究
·
开发，其中，由i－iii－vi族元素构成的黄铜矿型晶体结构的化合物半导体为通过光的吸收使电子与空穴复合而进行发光的直接迁移型半导体，不含有cd等有害元素，低毒性且环境负荷低，因此有望作为新型功能性材料。
5.例如，在专利文献1中提出了一种由含有ag成分、in成分和se成分的化合物半导体所构成的纳米粒子形成、发光强度的峰值波长在700nm～1400nm的范围且上述峰值波长的半峰宽δh为100nm以下的发光体。
6.在该专利文献1中，使用1－十二烷硫醇、油胺等溶剂，使由aginse系化合物半导体构成的纳米粒子分散于氯仿等非极性溶剂。根据专利文献1的实施例，能够将发光强度的峰值波长控制在700～1000nm的范围，峰值波长的半峰宽δh也为100nm以下，较小，能够得到良好的发光特性。进而，作为发光效率的指标的发光量子产率在ag与in的配合比率、即ag/in比为1/2时达到最大，得到12％的发光量子产率。
7.另外，非专利文献1报告了形成用于生物成像和细胞靶向化的双层封装量子点(dl－qdots)。
8.在非专利文献1中，首先，使用1－十二烷硫醇、十八碳烯等溶剂，合成表面由来自上述溶剂的有机配体被覆的agins2/zns量子点(纳米粒子)，使该agins2/zns量子点分散于作为非极性溶剂的己烷，由此制作分散溶液。然后，在该分散溶液中加入月桂酸(十二烷酸)溶液，制作相分离为己烷相和水相的相分离溶液后，照射超声波，由此用来自上述溶剂的有
机配体和来自月桂酸的烷基－封端配体来被覆agins2/zns量子点的表面，得到赋予有亲水性的量子点(非专利文献1，方案1)。
9.在该非专利文献1中记载了在超声波的照射前后，发光强度的峰值波长均为550nm，半峰宽δh也没有大的变动(非专利文献1，图3)。另外，发光量子产率在超声波照射前为78％，在超声波照射后使用月桂酸形成烷基－封端配体时降低到27.7％。另外，报告了在使用除月桂酸以外的脂肪酸形成烷基－封端配体的情况下，发光量子产率与亲水化前相比也大幅降低(非专利文献1，图4)。
10.另外，还开发了一种发光材料使用硅纳米粒子并使其在近红外区域发光的发光体。
11.例如，在专利文献2中提出了一种硅纳米粒子，设有具有金刚石结构的一种或多种硅纳米晶体、覆盖上述硅纳米晶体各表面的烃膜、覆盖上述表面由烃膜覆盖的一种或多种硅纳米晶体的嵌段共聚物，且为水溶性，通过照射激发光而在近红外区域发光。
12.在该专利文献2中，通过调整硅纳米晶体的粒径，得到在700～1000nm的近红外区域中半峰宽δh为150～300nm、发光量子产率为30％以上的水溶性硅纳米粒子。
13.现有技术文献
14.专利文献
15.专利文献1：国际公开第2017/126164号(权利要求1、7，段落[0066]～[0073]、[0090]～[0100]、[0107]～[0112]，表1等)
[0016]
专利文献2：日本特开2016－176039号公报(权利要求1，图5等)
[0017]
非专利文献
[0018]
非专利文献1：m.z.fahmi et al.，“forming double layer
‑
encapsulated quantum dots for bio
‑
imaging and cell targeting”，nanoscale，2013，5，pp.1517
‑
1528


技术实现要素：

[0019]
然而，专利文献1虽然在近红外区域得到半峰宽δh为100nm以下的良好的发光光谱，但存在如下所述的问题。
[0020]
即，在生物成像领域中，如上所述使由纳米粒子构成的发光体吸附于生物体组织，使发光体发光来检测生物体信息，但专利文献1中使纳米粒子分散于非极性的有机溶剂中。因此，对细胞有害的非极性的有机溶剂会吸附于生物体构成物质，存在不适于将细胞靶向化的生物成像用的发光体这样的问题。
[0021]
另外，非专利文献1虽然得到通过超声波照射而赋予有亲水性的agins2/zns量子点，但发光强度的峰值波长为550nm，在可见光区域进行发光。认为其理由如下。
[0022]
即，agins2与专利文献1这样的aginse2不同，块状状态下的带隙能量为1.87ev(以波长换算计为660nm)，较大，该带隙能量在纳米粒子化时通过量子尺寸效应而进一步变大，因此容易在可见光区域发光。而且，非专利文献1中将带隙能量较大为3.91ev(以波长换算计为317nm)的zns注入到aginse系量子点中。该zns虽然有助于表面钝化，但如上所述带隙能量大，因此发光波长向更短波长侧偏移，因此认为在550nm的可见光区域进行发光。
[0023]
如此，非专利文献1由于在可见光区域进行发光，因此血红蛋白等生物体构成物质
的吸收变大，无法对图像高精度地进行解析，难以得到期望的生物体信息。而且，对于agins2/zns量子点，超声波照射后的发光量子产率与超声波照射前相比大幅降低，导致发光效率的降低。
[0024]
另外，专利文献2虽然得到了具有30％以上的发光量子产率的在近红外区域进行发光的发光体，但峰值波长的半峰宽δh为150～300nm，较大，因此分辨率差，有可能得不到期望的高精度的生物体信息。
[0025]
本发明是鉴于这样的情况而完成的，其目的在于提供发光效率良好且在近红外区域发光较强、能够检测许多生物体信息、低毒性且适于生物成像的发光体和发光体的制造方法以及具备该发光体的生物体物质标记剂。
[0026]
如上所述，aginse系化合物半导体与cd系相比为低毒性，能够通过纳米粒子化而得到在期望的近红外区域具有半峰宽δh小的峰值波长的发光体。
[0027]
然而，如上所述，在专利文献1中，由于使纳米粒子分散于氯仿等非极性有机溶剂，因此在该状态下用于生物体物质标记剂时，对细胞有害的有机溶剂会吸附于生物体组织，作为生物成像用的发光体并不理想。
[0028]
因此，本发明人等进行了深入研究，使1－十二烷硫醇等烷基硫醇配位于由aginse系化合物半导体构成的纳米粒子的表面后，将含有多个烷基的油酸等脂肪酸水溶液与纳米粒子分散于非极性的有机溶剂的分散溶液混合，制作相分离溶液，对该相分离溶液进行超声波照射，在纳米粒子的表面形成赋予有亲水性的被膜。然后，测定该纳米粒子的发光光谱和发光量子产率，结果得到如下见解：发光强度的峰值波长、半峰宽保持在超声波照射前，并且能够使发光量子产率为10％以上、优选30％以上，由此能够在不损害发光光谱特性的情况下提高发光效率提高。而且，由于对被膜赋予有亲水性，因此能够以使发光光谱特性和发光效率良好的发光体分散于水中的状态使用，能够实现低毒性且适于生物成像的发光体。
[0029]
本发明是基于这样的见解而完成的，本发明的发光体的特征在于，是含有由至少包含ag成分、in成分和se成分的化合物半导体构成的纳米粒子的发光体，形成赋予有亲水性的被膜在上述纳米粒子的表面并分散在水中，发光量子产率为10％以上。
[0030]
另外，本发明的发光体优选上述发光量子产率为50％以下。
[0031]
进而，本发明的发光体优选发光强度的峰值波长在650nm～1000nm的范围，且上述峰值波长的半峰宽为100nm以下。
[0032]
由此，近红外区域的分辨率高，能够在不损害发光光谱特性的情况下得到发光效率良好的赋予有亲水性的发光体。
[0033]
另外，本发明的发光体的特征在于，是含有由至少包含ag成分、in成分和se成分的化合物半导体构成的纳米粒子的发光体，赋予有亲水性的被膜在上述纳米粒子的表面形成并分散在水中，发光强度的峰值波长在650nm～1000nm的范围，且上述峰值波长的半峰宽为100nm以下。
[0034]
由此，即便在对纳米粒子的表面赋予亲水性的情况下，也能够得到在近红外区域具有良好的半峰宽、分辨率高的具有良好的发光光谱特性且适于生物成像的发光体。
[0035]
另外，本发明的发光体优选发光量子产率为10％～50％。
[0036]
由此，能够得到兼具发光光谱特性和发光效率的赋予有亲水性的高性能的发光
体。
[0037]
另外，认为本发明的发光体如上所述使烷基硫醇配位于纳米粒子的表面后，将该纳米粒子分散于非极性溶剂中的分散溶液与脂肪酸水溶液混合，制作相分离溶液，对该相分离溶液进行超声波照射，因此上述被膜通过超声波照射而赋予有亲水性，并且在结构上具有由含有烷基硫醇的第1有机分子膜和以脂肪酸为主成分的第2有机分子膜构成的双重结构，并以高密度形成于纳米粒子的表面。
[0038]
即，本发明的发光体优选上述被膜为具有至少含有烷基硫醇的第1有机分子膜和以含有多个烷基的脂肪酸为主成分的第2有机分子膜的双重结构，并且通过超声波照射而赋予有上述亲水性。
[0039]
由此，认为由于被膜以高密度形成，因此能够有效地封盖纳米粒子的表面缺陷。而且，由于通过超声波照射而赋予有亲水性，因此与利用配体置换反应赋予亲水性的情况不同，能够抑制新的表面缺陷的形成。由此，能够得到具有发光量子产率10％以上的良好的发光效率、兼具亲水性赋予和发光效率且适于生物成像的发光体。
[0040]
另外，对于本发明的发光体，上述烷基硫醇优选为1－十二烷硫醇，上述脂肪酸优选为油酸。
[0041]
进而，本发明的发光体优选上述脂肪酸中含有的烷基的链长比上述烷基硫醇中含有的烷基的链长长。
[0042]
通过如此调整烷基的链长，能够得到更良好的发光效率。
[0043]
另外，本发明的发光体还优选上述第1有机分子膜包含含有巯基乙酸正辛酯或1－十二烷硫醇的表面保护剂。
[0044]
通过如此根据需要选择保护纳米粒子表面的期望的表面保护剂，能够在650～1000nm的近红外区域调整发光强度的峰值波长。
[0045]
另外，上述本发明的发光体优选具有发光量子效率为30％以上的发光效率。
[0046]
进而，本发明的发光体优选上述纳米粒子含有ga成分，上述峰值波长根据上述ga成分的含量进行控制。
[0047]
通过如此使纳米粒子含有ga成分，且使其含量不同，也能够在不损害半峰宽、发光效率的情况下控制发光强度的峰值波长。
[0048]
另外，本发明的发光体优选透过率在1000～1100nm的波长范围为90％以上。
[0049]
通过如此在1000～1100nm的波长范围使透过率为90％以上，纳米粒子在水中不凝聚而以超微粒的状态分散。
[0050]
另外，本发明的发光体优选上述in成分比化学计量组成多地含有。
[0051]
认为通过如此使组成为富in来抑制吸收－发光过程中的非辐射失活过程，因此能够得到更良好的发光特性。
[0052]
进而，本发明人等进行了深入研究，对将上述的纳米粒子作为发光源的发光体在生物体物质标记剂中的实用性进行了研究，结果发现通过用以具有阳离子性的八聚精氨酸(以下，称为“r8”。)等膜透过性肽为主成分的表面修饰剂被覆上述被膜，能够将上述发光体高效地导入到生物体物质内。
[0053]
因此，在本发明的发光体中，上述被膜优选用由主成分具有阳离子性的膜透过性肽形成的表面修饰剂被覆。
[0054]
由此，发光体由于表面修饰剂带正电荷，因此发光体会被带负电荷的细胞膜吸引而移动到生物体物质表面。然后，可以经过所谓内吞过程将发光体容易地导入到生物体物质内，由此能够通过仅对发光体照射光就高效地检测生物体信息。
[0055]
进而，本发明的发光体优选上述膜透过性肽为r8。
[0056]
另外，认为本发光体由于作为发光源的纳米粒子如上所述由aginse系的化合物半导体形成，因此与含有cd的化合物半导体相比为低毒性，在导入到生物体物质内的情况下能够有助于细胞存活率的提高。
[0057]
因此，本发明人等使用近年来在再生医疗等中受到关注的来自脂肪组织的干细胞(adipose
‑
derived stem cells，以下，称为“ascs”)进一步进行深入研究，结果可知即便将以摩尔浓度换算计为160nmol/l的发光体导入到ascs中也能够确保80％以上的细胞存活率。
[0058]
即，本发明的发光体优选在以摩尔浓度换算计为160nmol/l导入到ascs中时，细胞存活率为80％以上。
[0059]
由此，即便将以摩尔浓度换算计为160nmol/l的高浓度的发光体导入到ascs中，也能够抑制细胞死亡而良好地维持细胞存活率，能够获得更多的生物体信息。
[0060]
另外，本发明的发光体的制造方法的特征在于，包括：制作使由至少包含ag成分、in成分和se成分的化合物半导体构成的纳米粒子分散于非极性溶剂的分散有纳米粒子的非极性溶液的工序，将至少包含烷基硫醇的有机分子添加到上述分散有纳米粒子的非极性溶液中，在上述纳米粒子的表面形成第1有机分子膜而制作前体分散溶液的工序，在碱的存在下制作使含有多个烷基的脂肪酸溶解于水的脂肪酸水溶液的工序，将上述前体分散溶液与上述脂肪酸水溶液混合而制作相分离为非极性溶剂相和水相的相分离溶液的工序，对上述相分离溶液照射超声波而在上述纳米粒子的表面形成赋予有亲水性的被膜的工序，以及使上述纳米粒子分散在水中而制作分散有纳米粒子的水溶液的工序。
[0061]
即，通过将至少包含烷基硫醇的有机分子添加于上述分散有纳米粒子的非极性溶液，从而烷基硫醇的硫醇基吸附于纳米粒子的表面缺陷而在上述纳米粒子的表面形成第1有机分子膜，制作前体分散溶液。其后，将前体分散溶液与脂肪酸水溶液混合而制作相分离溶液，对该相分离溶液照射超声波，由此脂肪酸的烷基通过与烷基硫醇的烷基的疏水性相互作用而吸附于纳米粒子的表面。而且，被膜由于被作为亲水性基团的脂肪酸的羧基赋予亲水性，因此在超声波照射后再次相分离的相分离溶液中，能够使发光体分散在水中，由此能够得到发光光谱特性和发光效率良好的发光体。
[0062]
另外，本发明的发光体的制造方法优选在上述纳米粒子的表面形成上述被膜的工序包括通过上述超声波照射而形成水包油滴型微乳液的工序，将形成有上述第1有机分子膜的上述纳米粒子和上述脂肪酸封闭在上述微乳液内，使上述脂肪酸吸附于上述纳米粒子的表面。
[0063]
即，通过超声波照射而对微乳液施加较大的冲击力，微乳液随着照射时间的经过而逐渐变小。然后，吸附于纳米粒子的表面的脂肪酸自组装而成为第2有机分子膜，进一步赋予亲水性，因此超声波照射后能够使发光体分散存在于水中。
[0064]
另外，本发明的发光体的制造方法优选制作上述分散有纳米粒子的非极性溶液的工序包括：使ag化合物和in化合物溶解于溶剂而制作ag－in溶液的工序，使se粉末溶解于
溶剂而制作se溶液的工序，以将上述ag－in溶液加热到规定温度的状态将上述se溶液注入到上述ag－in溶液中而制作混合溶液的工序，以及将上述混合溶液以比上述规定温度高的反应温度加热规定的反应时间而制作被表面保护剂被覆的由化合物半导体构成的纳米粒子的工序。进而，优选制作上述分散有纳米粒子的非极性溶液的工序包括：使ag化合物、in化合物和ga化合物溶解于溶剂而制作ag－in－ga溶液的工序，使se粉末溶解于溶剂而制作se溶液的工序，以将上述ag－in－ga溶液加热到规定温度的状态将上述s该混合溶液以比上述规定温度高的反应温度加热规定的反应时间而制作被表面保护剂被覆的由化合物半导体构成的纳米粒子的工序。
[0065]
如此以规定温度制作化合物半导体后，以比上述规定温度高的反应温度加热规定的反应时间，由此尽力抑制纳米粒子彼此凝聚，并且纳米粒子的结晶性提高而能量损耗得到抑制，能够以高效率得到可带边发光的发光体。
66.另外，本发明的发光体的制造方法包括将形成有上述被膜的上述纳米粒子与由主成分具有阳离子性的膜透过性肽形成的表面修饰剂混合的工序，优选将上述被膜的表面用上述膜透过性肽被覆，进一步优选上述膜透过性肽为八聚精氨酸。
[0067]
由此，如上所述能够将发光体容易地导入到生物体物质内。
[0068]
本发明的生物体物质标记剂的特征在于，具备上述发光体。
[0069]
由此对发光体赋予亲水性，且具有良好的发光光谱特性和发光效率，因此也不存在有机溶剂这样的有害物质吸附于生物体组织的情况，能够以所期望的高灵敏度且多种颜色对生物体图像进行动态且高效率的解析，能够得到适于生物成像的生物标志物的生物体物质标记剂。特别是，在利用由主成分具有阳离子性(正电荷)的膜透过性肽形成的表面修饰剂被覆被膜的情况下，在带负电荷的细胞膜与具有阳离子性(正电荷)的膜透过性肽之间产生静电相互作用，发光体移动到细胞膜的表面后，可以通过内吞过程而将发光体容易地导入到生物体物质内，能够有效地标记生物体物质。即，能够仅通过对导入到生物体物质内的发光体照射光来确认生物体物质的状态。
[0070]
根据本发明的发光体，是含有由至少包含ag成分、in成分和se成分的化合物半导体构成的纳米粒子的发光体，赋予有亲水性的被膜在上述纳米粒子的表面形成并分散在水中，发光量子产率为10％以上，因此也不存在对细胞有害的非极性的有机溶剂吸附于生物体组织的情况，能够得到适于具有良好的发光效率的生物成像的发光体。
[0071]
另外，根据本发明的发光体，是含有由至少包含ag成分、in成分和se成分的化合物半导体构成的纳米粒子的发光体，赋予有亲水性的被膜在上述纳米粒子的表面形成并分散在水中，发光强度的峰值波长在650nm～1000nm的范围，上述峰值波长的半峰宽为100nm以下，因此即便在对纳米粒子的表面进行了亲水化的情况下，也能够在近红外区域不损害半峰宽的情况下得到具有分辨率高的具有良好的发光光谱特性且适于生物成像的发光体。
[0072]
进而，根据本发明的发光体的制造方法，包括：制作由至少包含ag成分、in成分和se成分的化合物半导体构成的纳米粒子分散于非极性溶剂的分散有纳米粒子的非极性溶液的工序，将至少包含烷基硫醇的有机分子添加到上述分散有纳米粒子的非极性溶液中，在上述纳米粒子的表面形成第1有机分子膜而制作前体分散溶液的工序，在碱的存在下制作使含有多个烷基的脂肪酸溶解于水的脂肪酸水溶液的工序，将上述前体分散溶液与上述脂肪酸水溶液混合而制作相分离为非极性溶剂相和水相的相分离溶液的工序，对上述相分
离溶液照射超声波而在在上述纳米粒子的表面形成赋予有亲水性的被膜的工序，以及使上述纳米粒子分散在水中而制作分散有纳米粒子的水溶液的工序，因此，首先，烷基硫醇的硫醇基吸附于纳米粒子的表面缺陷而在上述纳米粒子的表面形成第1有机分子膜，制作前体分散溶液。其后，将前体分散溶液与脂肪酸水溶液混合而制作相分离溶液，对该相分离溶液照射超声波，由此脂肪酸的烷基通过与烷基硫醇的烷基的疏水性相互作用而吸附于纳米粒子的表面。然后，被膜被作为亲水性基团的脂肪酸的羧基赋予亲水性，在超声波照射后再次相分离的相分离溶液中，形成有亲水性被膜的纳米粒子移动到水相侧而在水中分散，由此能够得到发光光谱特性和发光效率良好的发光体。
[0073]
另外，本发明的生物体物质标记剂由于具备上述的发光体，因此，由于对发光体赋予有亲水性且具有良好的发光光谱特性和发光效率，所以也不存在有机溶剂这样的有害物质吸附于生物体组织的情况，能够以期望的高灵敏度且多种颜色对生物体图像进行动态且高效率的解析，能够得到低毒性且适于生物成像的生物标志物的生物体物质标记剂。特别是，在利用由主成分具有阳离子性(正电荷)的膜透过性肽形成的表面修饰剂被覆被膜的情况下，在带负电荷的细胞表面与具有阳离子性(正电荷)的膜透过性肽之间产生静电相互作用，由此能够将发光体容易地导入到生物体物质的细胞内，能够有效地标记生物体物质。即，能够仅通过对导入生物体内的发光体照射光来确认生物体物质的状态。
附图说明
[0074]
图1是示意地表示本发明的发光体分散于水中的状态的图。
[0075]
图2是表示上述发光体的发光光谱的主要部分的谱图。
[0076]
图3是示意地表示上述发光体的一个实施方式(第1实施方式)的图。
[0077]
图4是对本发明的发光体的制造方法的一个实施方式进行说明的工序图(1/6)。
[0078]
图5是对本发明的发光体的制造方法的一个实施方式进行说明的工序图(2/6)。
[0079]
图6是对本发明的发光体的制造方法的一个实施方式进行说明的工序图(3/6)。
[0080]
图7是对本发明的发光体的制造方法的一个实施方式进行说明的工序图(4/6)。
[0081]
图8是对本发明的发光体的制造方法的一个实施方式进行说明的工序图(5/6)。
[0082]
图9是对本发明的发光体的制造方法的一个实施方式进行说明的工序图(6/6)。
[0083]
图10是示意地表示本发明的发光体的第2实施方式的截面图。
[0084]
图11是表示上述第2实施方式的制造过程的主要部分的示意图。
[0085]
图12是表示本发明的发光体向生物体物质的导入过程的图。
[0086]
图13是表示实施例1的超声波照射前和超声波照射后的相分离溶液的照片。
[0087]
图14是表示实施例1的吸收光谱和透射光谱的谱图。
[0088]
图15是实施例1的试样编号11(超声波照射前)和试样编号12(超声波照射后)的发光光谱的谱图。
[0089]
图16是表示实施例1的试样编号11(超声波照射前)和试样编号12(超声波照射后)的吸收光谱的谱图。
[0090]
图17是表示实施例1的试样编号11(亲水化前)和试样编号12(亲水化后)的stem图像的图。
[0091]
图18是表示实施例2的超声波照射前后的试样编号21和试样编号22的发光光谱的
谱图。
[0092]
图19是表示实施例3的试样编号31～33的发光光谱的谱图。
[0093]
图20是表示实施例3的试样编号32和33的超声波照射前后发光光谱的谱图。
[0094]
图21是表示实施例3的试样编号31～33的吸收光谱的谱图。
[0095]
图22是将实施例4的试样编号41的发光光谱与试样编号12一起表示的谱图。
[0096]
图23是表示实施例4的试样编号12a的摩尔浓度与细胞存活率的关系的图。
[0097]
图24是表示实施例4的试样编号41a的摩尔浓度与细胞存活率的关系的图。
[0098]
图25是表示实施例4的试样编号12和试样编号41的荧光强度的图。
[0099]
图26是表示实施例4中将试样编号12a的试样注入到小鼠皮下时的摩尔浓度与荧光状态的关系的图。
[0100]
图27是表示实施例4的试样编号12b的荧光强度的图。
具体实施方式
[0101]
接下来，对本发明的实施方式进行详细说明。
[0102]
＜发光体和其制造方法＞
[0103]
(第1实施方式)
[0104]
图1是示意地表示作为本发明的一个实施方式(第1实施方式)的发光体分散于水中的状态的图。
[0105]
即，在容器1中储存有水2，发光体3以分散于水中的状态存在。具体而言，该发光体3在透射光谱中在1000nm～1100nm的波长区域具有90％以上的透射率，成为在水中凝聚等得到抑制的良好的分散状态。
[0106]
该发光体3具有由含有ag成分、in成分、se成分的aginse系化合物半导体构成的纳米粒子4，在该纳米粒子4的表面形成有通过超声波照射而赋予了亲水性的被膜5。另外，被膜5为具有至少含有烷基硫醇的第1有机分子膜6和以含有多个烷基的脂肪酸为主成分的第2有机分子膜7的双重结构。
[0107]
而且，该发光体3的发光量子产率为10％以上，优选为30％以上，而且，具有发光强度的峰值波长在650nm～1000nm的范围且峰值波长的半峰宽δh满足100nm以下的发光光谱特性。
[0108]
如此，本发光体3由于通过超声波照射对被膜5赋予了亲水性，且被膜5为双重结构，因此形成高密度的被膜5，表面缺陷被良好地封盖，因而能够使发光量子产率为10％以上、优选30％以上。另外，由于该被膜5被赋予了亲水性，因此能够以分散于水中的状态使用，也不存在对细胞有害的非极性的有机溶剂吸附于生物体组织的情况，能够得到兼具发光光谱特性和发光效率且适于生物成像的发光体3。
[0109]
接下来，在本实施方式中，对如上所述地规定纳米粒子材料、发光光谱特性(发光强度的峰值波长和半峰宽δh)和发光量子产率的理由进行详细说明。
[0110]
(1)纳米粒子材料
[0111]
如上所述，具有黄铜矿型晶体结构的aginse系半导体化合物与cdse、cdte这样的cd系材料不同，为低毒性，通过调整组成而形成固溶体，能够控制发光波长。而且，该aginse系半导体化合物、例如aginse2的带隙能量在块状状态下为1.24ev(以波长换算计为
1000nm)，带隙能量小，在近红外区域进行发光。因此，通过将aginse系半导体化合物纳米粒子化并控制粒径，从而发挥量子尺寸效应，因此，即便为相同组成，也在近红外区域以各种波长进行发光。
[0112]
因此，在本实施方式中，作为发光体3的核的纳米粒子材料使用aginse系化合物半导体。
[0113]
应予说明，aginse系化合物半导体的各成分的组成比只要不损害发光光谱特性就没有特别限定，优选使in成分比化学计量组成多地含有。
[0114]
即，认为ag成分与in成分的化学计量组成为1：1，通过比化学计量组成多地含有制造时的in成分，能够抑制被激发的电子返回到基态时不放出光的无辐射失活过程，能够得到强度进一步提高的发光峰。但是，在与化学计量组成相比过度过量地含有制造时的in成分的情况下，有可能生成异相等杂质，因此导致纯度降低，反而发光峰的强度有可能降低。如果考虑该方面，则在比化学计量组成多地含有制造时的in成分的情况下，in成分相对于ag成分的配合比率以摩尔比换算计优选1.5～3。
[0115]
另外，纳米粒子4的平均粒径只要在650～1000nm的波长区域表现出量子尺寸效应，就没有特别限定，例如制作到0.1～20nm的范围。
[0116]
(2)发光光谱特性(发光强度的峰值波长和半峰宽δh)
[0117]
图2是示意地表示本发光体3的发光光谱的主要部分的谱图，横轴表示波长(nm)，纵轴表示发光强度(a.u.)。
[0118]
如[背景技术]的项中所述，在波长比近红外短的小于700nm、特别是小于650nm的可见光区域中，血红蛋白等生物体构成物质的吸收大。另一方面，如果波长变长超过1700nm，则水分的吸收变大，因此光无法以高效率在生物体内透过，即便在生物体内发光也难以得到期望的生物体信息。
[0119]
与此相对，在波长为700～1700nm的近红外区域中，对生物体的透光性良好，适于利用生物成像技术的生物体组织的动态图像解析。特别是波长为650～1000nm的范围对生物体的透光性良好，通过在该范围得到发光强度具有峰值波长的发光光谱，能够获得期望的生物体信息。
[0120]
进而，为了使用生物成像技术得到期望的生物体信息，需要使发光体3强烈发光来提高分辨率，为此，需要发光光谱的峰值波长附近的谱图陡峭且尖锐。而且，峰值波长的陡峭性
·
尖锐性可以利用发光强度的峰值波长p的1/2p处的波长宽度、即半峰宽δh进行评价。即，如果上述半峰宽δh超过100nm，则峰值波长缺乏陡峭性
·
尖锐性，有可能导致分辨率降低。
[0121]
因此，在本实施方式中，发光强度的峰值波长在650～1000nm的范围出现，且规定成峰值波长的半峰宽δh为100nm以下。应予说明，上述半峰宽δh的下限值没有特别限定，如果过度变小，则容易产生从靶的“偏离”，有可能无法检测出确切的生物体信息，因此优选为10nm以上。
[0122]
如此，在本实施方式中，通过如上述所述地规定发光强度的峰值波长和半峰宽δh，能够得到适于在再生医疗、癌症治疗等中确认给药效果、细胞状态的生物成像的生物标志物的发光体，能够对生物体物质赋予荧光性而以高灵敏度且多种颜色对图像进行动态解析。
[0123]
(3)发光量子产率
[0124]
纳米粒子4由于以纳米水平进行超微粒化，因此大量的原子位于纳米粒子表面。因此，表面缺陷多，妨碍发光而导致发光效率的降低，无法得到充分的发光量子产率(纳米粒子吸收的光子中，进行发光而放出的光子的比例)。
[0125]
即，一直以来，着眼于有机溶剂的配位力，使纳米粒子材料溶解于有机溶剂，在合成纳米粒子4的同时将表面用由有机配体构成的表面保护剂被覆，由此封盖表面缺陷，尽力除去该表面缺陷，从而使发光量子产率提高。
[0126]
然而，用表面保护剂去除表面缺陷的方法自然存在极限，因此仅在基于表面保护剂的封盖时，无法充分地提高发光量子产率。
[0127]
因此，在本实施方式中，在纳米粒子4的合成后，在该纳米粒子的表面由至少含有烷基硫醇的有机分子形成第1有机分子膜6而使表面缺陷进一步减少，其后，通过超声波照射在纳米粒子4的表面形成以脂肪酸为主成分的第2有机分子膜7，在纳米粒子4的表面形成由第1有机分子膜6和第2有机分子膜7构成的双重结构的被膜5。由此能够形成高密度的被膜5，因此能够有效地封盖表面缺陷，并且也能够有助于表面钝化，能够抑制能量损耗。其结果，发光量子产率提高到10％以上、优选30％以上，与不形成双重结构的被膜5的情况相比，得到2.5倍以上的良好的发光量子产率。
[0128]
而且，由于通过超声波照射对被膜5赋予了亲水性，因此即便应用于生物成像用的生物体物质标记剂，也不存在对细胞有害的非极性的有机溶剂吸附于生物体构成物质的情况，能够实现适于生物成像的发光体3。
[0129]
即，在本实施方式中，通过利用超声波照射而形成上述被膜5并制成如上所述的双重结构，从而实现获得10％以上、优选30％以上的发光量子产率，与超声波照射前相比，得到2.5倍以上的良好的发光量子产率。发光量子产率的上限没有特别限定，通常为50％以下。
[0130]
应予说明，如非专利文献1那样在纳米粒子的合成时形成表面保护剂，其后不添加烷基硫醇，立即添加脂肪酸进行超声波照射时，即便能够对被膜赋予亲水性，也会残留很多未被封盖的表面缺陷，因此无法得到良好的发光量子产率。
[0131]
另外，作为亲水性的赋予方式，除了超声波照射以外，还考虑用具有亲水性的硫醇基(－sh)、羧基(－cooh)对表面保护剂的有机配体进行配体置换。然而，此时即便能够赋予亲水性也难以提高发光量子产率。即，此时，在配体置换时，与脱离的配体一起直到纳米粒子表面的原子被去除而形成新的表面缺陷，或者应进行配体置换的配体未充分地存在于纳米粒子表面，该纳米粒子表面富有反应性而无法充分地钝化，因此无法提高发光量子产率，无法得到期望的发光效率。
[0132]
因此，为了使发光量子产率提高到10％以上、优选30％以上，重要的是在第2有机分子膜6的形成时照射超声波，并且使被膜5为由第1有机分子膜6和第2有机分子膜7构成的双重结构，充分地封盖表面缺陷来抑制能量损耗。
[0133]
接下来，对作为本发明的一个实施方式的上述发光体3的构成进行更详细的说明。
[0134]
图3是示意地表示发光体3的放大图，如上所述，该发光体3在纳米粒子4的表面形成有由有机配体构成的表面保护剂8。即，如上所述，在纳米粒子4的表面形成有很多表面缺陷，反应性高，纳米粒子4彼此容易凝聚。因此，通常，在纳米粒子4的合成时，使作为有机配
体发挥作用的表面保护剂8配位于纳米粒子4的表面，由此对表面缺陷进行某种程度的封盖而去除该表面缺陷，促进了钝化。
[0135]
具体而言，表面保护剂8由具有烷基(－ch2)等疏水性基团和硫醇基(－sh)、羧基(－cooh)、氨基(－nh2)等亲水性基团的有机配体构成，配位成亲水性基团吸附于纳米粒子4的表面、疏水性基团位于外侧。
[0136]
该表面保护剂8中，在纳米粒子4的合成时使用的溶剂在合成后成为有机配体而形成于纳米粒子4的表面。因此，作为表面保护剂8，可以使用作为溶剂而沸点高且化学稳定、抑制纳米粒子4彼此的凝聚、有助于表面钝化的物质。
[0137]
作为这样的表面保护剂8，例如可以使用巯基乙酸正辛酯(ch3(ch2)7oc(＝o)ch2sh)、1－十二烷硫醇(ch3(ch2)
11
sh)、正己烷硫醇(ch3(ch2)5sh)等烷基硫醇、油胺(h2n(ch2)8hc＝ch(ch2)7ch3)等烷基胺、正辛基醚(h3c(ch2)7o(ch2)7ch3)等。特别是，表面保护剂8由于其配位力对纳米粒子4的粒径造成影响，因此优选根据所要求的粒径而进行选择。例如，在近红外区域中在更短波长侧进行发光时，优选使用得到5nm左右的平均粒径的巯基乙酸正辛酯与油胺的组合，在长波长侧进行发光时，优选使用得到6～7nm左右的平均粒径的1－十二烷硫醇与油胺的组合。
[0138]
另外，在纳米粒子4的表面且表面保护剂8间吸附有烷基硫醇(通式ch3(ch2)
n
sh)9。即，纳米粒子4仅通过表面保护剂8无法充分地去除表面缺陷，因此在本实施方式中将存在于表面保护剂8间的表面缺陷利用烷基硫醇9进一步封盖而除去。
[0139]
具体而言，配位成作为亲水性基团的烷基硫醇9的硫醇基(－sh)吸附于表面保护剂8间所存在的纳米粒子4的表面缺陷、作为疏水性基团的烷基(－ch2)位于外侧，由此由有机配体所构成的表面保护剂8和配位于该表面保护剂8间的烷基硫醇9而形成第1有机分子膜6，有效地封盖表面缺陷。
[0140]
进而，在纳米粒子4的表面，将以具有多个烷基的脂肪酸(通式c
n
h
m
cooh)10为主成分的第2有机分子膜7与第1有机分子膜6形成为双重结构，由第1有机分子膜6和第2有机分子膜7形成被膜5。即，配位成通过后述的疏水性相互作用在纳米粒子4的表面且第1有机分子膜6间吸附作为疏水性基团的脂肪酸10的烷基(－ch2)，作为亲水性基团的末端的羧基(－cooh)位于终端。而且，由此被膜5由第1有机分子膜5和第2有机分子膜6在纳米粒子4上形成双重结构，形成高密度的被膜5，因此有助于表面钝化，而且更有效地去除表面缺陷。另外，通过超声波照射而使脂肪酸10的羧基位于终端而对被膜5赋予亲水性，因此，发光体3能够分散在水中。
[0141]
这里，作为烷基硫醇9，没有特别限定，可以使用巯基乙酸正辛酯(ch3(ch2)7oc(＝o)ch2sh)、1－十二烷硫醇(ch3(ch2)
11
sh)、正己烷硫醇(ch3(ch2)5sh)等。
[0142]
另外，脂肪酸10也只要含有多个烷基就没有特别限定，可以使用油酸(ch3(ch2)7hc＝ch(ch2)7cooh)、月桂酸(ch3(ch2)
10
cooh)、辛酸(ch3(ch2)6cooh)等。
[0143]
但是，从提高发光量子产率的观点考虑，脂肪酸10优选含有具有比烷基硫醇9的烷基的链长长的链长的烷基。例如，使用烷基的个数为“12”的1－十二烷硫醇作为烷基硫醇9时，优选使用烷基的个数为“15”的油酸作为脂肪酸10，使用烷基的个数为“8”的巯基乙酸正辛酯作为烷基硫醇9时，优选使用烷基的个数为“11”的月桂酸、烷基的个数为“15”的油酸作为脂肪酸10。
[0144]
如此，本发光体3由于含有由aginse系化合物半导体构成的纳米粒子4，且被赋予有亲水性的被膜5的发光量子产率为10％以上，因此，也不存在对细胞有害的非极性的有机溶剂吸附于生物体组织的情况，能够得到具有良好的发光效率且适于生物成像的发光体3。
[0145]
另外，本发光体3由于发光强度的峰值波长在650nm～1000nm的范围，且上述峰值波长的半峰宽为100nm以下，因此，即便在对纳米粒子4的表面进行了亲水化的情况下，也能够在近红外区域的半峰宽δh良好且不损害发光光谱特性的情况下得到分辨率高且具有良好的发光光谱特性的适于生物成像的发光体，能够得到兼具发光光谱特性和发光效率的发光体。
[0146]
特别是，认为通过被膜5为具有至少含有烷基硫醇9的第1有机分子膜6和以含有多个烷基的脂肪酸10为主成分的第2有机分子膜7的双重结构，能够以高密度形成被膜5，能够有效地封盖纳米粒子4的表面缺陷，也有助于表面钝化。而且，如上所述，被膜5通过超声波照射而赋予了亲水性，因此与由配体置换反应来赋予亲水性的情况不同，能够抑制新的表面缺陷的形成。而且，由此能够得到具有发光量子产率为10％以上、优选30％以上的良好的发光效率，且兼具亲水性赋予和发光效率的适于生物成像的发光体。
[0147]
接下来，参照图4～图9对上述发光体的制造方法的一个实施方式进行详述。
[0148]
[分散有纳米粒子的非极性溶液的制作]
[0149]
图4中的(a)表示分散有纳米粒子的非极性溶液12，形成有表面保护剂8的纳米粒子4在非极性溶剂11中分散。图4中的(b)示意性地表示纳米粒子4的详细情况的放大图。
[0150]
该分散有纳米粒子的非极性溶液12可以如下制作。
[0151]
首先，准备含有ag成分的ag化合物和含有in成分的in化合物，以合成后的ag成分与in成分的配合比率、即in/ag比优选1.5～3左右的比化学计量组成多地分别称量ag化合物和in化合物。通过如此调整in/ag比，能够得到发光强度的峰值波长陡峭且半峰宽δh小、尖锐的发光光谱。
[0152]
应予说明，ag化合物、in化合物中使用的化合物种类没有特别限定，可以优选使用比较廉价、化学稳定且容易获得的金属配合物、例如以乙酸根离子等脂肪酸离子为配体的乙酸银(ag(ococh3)、乙酸铟(in(ococh3)3)。
[0153]
接下来，使这些称量物溶解于溶剂，制作ag－in溶液。如上所述，该溶剂在合成后以有机配体的形式形成表面保护剂8，例如，可以使用含有选自上述巯基乙酸正辛酯、1－十二烷硫醇、油胺和正辛基醚中的至少1种的混合溶液。
[0154]
接下来，准备se粉末，使该se粉末溶解于溶剂来制作se溶液。该情况下，作为溶剂，例如也可以使用上述1－十二烷硫醇、己烷硫醇等烷基硫醇与油胺等烷基胺的混合溶液、三丁基膦、三辛基膦等膦类。
[0155]
接下来，将ag－in溶液放入容器中，减压脱气后，进行氮置换，其后，进行加热处理，使反应场的温度从室温升温到规定温度(例如，100℃～150℃)。
[0156]
接下来，在加热到上述规定温度的ag－in溶液中注入se溶液，其后，进一步加热到规定的反应温度，以该反应温度(例如，200℃以上)保持规定的反应时间(例如，30～120分钟)，由此得到反应物。
[0157]
接着，将该反应物放置冷却直到达到室温，其后，进行离心分离处理，分离成上清液和沉淀物，回收上清液，并且弃去沉淀物。然后，将甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等不良溶剂加入
到上清液中而生成沉淀物，再次进行离心分离处理而分离回收沉淀物。以下，将不良溶剂的添加
→
离心分离处理
→
沉淀物的回收这样的操作反复进行多次，制作不含有异相等杂质的高纯度的沉淀物、即被表面保护剂8被覆的由aginse系化合物半导体构成的纳米粒子4。接着，使该纳米粒子4分散于氯仿、甲苯、己烷等非极性溶剂中，由此制作如图4中的(a)所示的分散有纳米粒子的非极性溶液12。
[0158]
[前体分散溶液的制作]
[0159]
在分散有纳米粒子的非极性溶液12中添加烷基硫醇9。这样，如图5中的(b)所示，配位成烷基硫醇9作为亲水性基团的末端的硫醇基吸附于纳米粒子4的表面、作为疏水性基团的烷基位于外侧。然后，由此烷基硫醇9封盖纳米粒子4的表面缺陷，由表面保护剂8和烷基硫醇9形成第1有机分子膜6，如图5中的(a)所示，被第1有机分子膜5被覆的纳米粒子4分散在非极性溶剂11中，由此制作前体分散溶液14。
[0160]
[脂肪酸水溶液的制作]
[0161]
如图6所示，使油酸等脂肪酸10溶解于添加有naoh、koh等碱的水溶液15，制作脂肪酸水溶液16。
[0162]
[相分离溶液的制作]
[0163]
将脂肪酸水溶液16搅拌到整体起泡的程度后，将该脂肪酸水溶液16与前体分散溶液14混合。这样，如图7所示，脂肪酸10分散在非极性溶剂相18中，得到分离成水相17和非极性溶剂相18的相分离溶液19。
[0164]
[超声波照射]
[0165]
对相分离溶液19照射超声波20。这样，对相分离溶液19施加较大的冲击力，如图8中的(a)所示，水相17与非极性溶剂相18混合而形成均匀的水溶液21，并且在水溶液21内形成水包油滴型的微乳液22。此时，如图8中的(b)所示，形成有第1有机分子膜6的纳米粒子4和脂肪酸10被封闭在微乳液22内。
[0166]
如果对水溶液21继续照射超声波20，则如图8中的(c)～(d)所示，微乳液22随着照射时间的经过而逐渐变小，在纳米粒子4的表面将第2有机分子膜7与第1有机分子膜6形成为双重结构。即，刚形成微乳液22后，如上述图8中的(b)所示，脂肪酸10在微乳液22内悬浮，但如果继续照射超声波20，对微乳液22施加较大的冲击力，则微乳液22逐渐变小。而且，随着微乳液22变小，脂肪酸10的一部分接近纳米粒子4，如图8中的(c)所示，脂肪酸10的烷基通过与第1有机分子膜6的烷基之间起因于范德华力的疏水性相互作用而吸附于纳米粒子4的表面，由此，脂肪酸10的末端的羧基以位于外侧的方式配置。然后，如果进一步继续照射超声波20，则如图8中的(d)所示，微乳液22进一步变小，并且脂肪酸10向纳米粒子4吸附且自组装，脂肪酸10成为第2有机分子膜7而有效地封盖存在于第1有机分子膜6间的表面缺陷。
[0167]
如此，脂肪酸10以作为疏水性基团的烷基(－ch2)吸附于纳米粒子4的表面，另一方面，作为亲水性基团的末端的羧基(－cooh)位于外侧的方式配置，利用羧基对被膜5赋予亲水性。即，在纳米粒子4的表面以高密度配位第1有机分子膜6和第2有机分子膜7，形成赋予有亲水性的双重结构的被膜5。
[0168]
[分散有纳米粒子的水溶液的制作]
[0169]
在微乳液22充分变小的时刻结束超声波照射。这样，如图9所示，水溶液21再次相
分离为水相17和非极性溶剂相18而形成相分离溶液19。然后，具有赋予有亲水性的被膜5的发光体3移动到水相17侧，在该水相17内分散。
[0170]
其后，添加适量的氯仿等有机溶剂，反复进行离心分离处理并回收水相17，进一步在回收的水相17中添加己烷等有机溶剂，再次反复进行离心分离处理并回收水相17，由此能够制作纳米粒子分散于水中的高纯度的分散有纳米粒子的水溶液。
[0171]
如此，根据本发光体的制造方法，首先，烷基硫醇9的硫醇基吸附于纳米粒子4的表面缺陷而在上述纳米粒子4的表面形成第1有机分子膜6，制作前体分散溶液14。其后，将脂肪酸水溶液16与前体分散溶液14混合而制作相分离溶液19，对该相分离溶液19照射超声波20，由此形成微乳液22，并且在该微乳液22内封闭纳米粒子4和脂肪酸10。然后，脂肪酸10的烷基通过与烷基硫醇9的烷基的疏水性相互作用而吸附于纳米粒子4的表面，在纳米粒子4的表面以与第1有机分子膜6重叠的形态形成以脂肪酸10为主成分的第2有机分子膜7，由此在纳米粒子4的表面形成由第1有机分子膜6和第2有机分子膜7构成的双重结构的被膜5。然后，被膜5通过脂肪酸10末端的羧基而被赋予亲水性，因此，在超声波照射后再次相分离的相分离溶液19中，形成有亲水性的被膜5的纳米粒子4移动到水相17侧并在水中分散，由此能够得到发光光谱特性和发光效率良好的适于生物体物质标记剂的发光体3。
[0172]
(第2实施方式)
[0173]
在上述第1实施方式中，纳米粒子4由aginse系化合物半导体形成，但在本第2实施方式中，纳米粒子4由在aginse系化合物半导体中注入有ga成分的agingase系化合物半导体形成。
[0174]
agingase系化合物半导体与aginse系化合物半导体相比，带隙能量略大，吸收端向短波长侧偏移，因此能够使半峰宽δh维持在100nm以下的同时在更短波长侧的近红外区域进行发光。特别是，通过使ga与in的配合比率即ga/in比不同，从而即便不使平均粒径不同也能够控制发光强度的峰值波长。
[0175]
对于本第2实施方式的发光体的制造方法，除了ag化合物和in化合物以外还使ga化合物溶解于溶剂而制作ag－in－ga溶液，除此以外，与上述实施方式同样。
[0176]
这里，作为ga化合物，没有特别限定，例如，可以使用化学式(1)表示的乙酰丙酮镓。
[0177][0178]
(第3实施方式)
[0179]
图10是示意地表示本发明的发光体的第3实施方式的截面图。
[0180]
在该第3实施方式中，除了第1实施方式以外，被膜5还被以阳离子性的膜透过性肽为主成分的表面修饰剂31被覆。
[0181]
即，具有阳离子性的膜透过性肽如后所述通过静电相互作用被生物体物质表面的带负电荷的细胞膜吸引，发光体32可以经过内吞过程而容易地导入到生物体物质内。然后，由此能够仅通过对发光体32照射光就能够检测各种生物体信息。
[0182]
而且，作为本发光体32的发光源的aginse系化合物半导体与cd系化合物半导体不同，为低毒性，因此，即便将更大量的发光体导入到生物体物质中，细胞的死亡也得到抑制，因此能够良好地维持细胞存活率。顺便而言，如后所述，本发明人等对ascs(来自脂肪组织的干细胞)的细胞培养液添加了各种摩尔浓度不同的发光体32，结果确认了即便将以摩尔浓度换算计为160nmol/l的发光体32导入到细胞内，也能够得到80％以上的细胞存活率。
[0183]
这里，作为膜透过性肽，只要是具有阳离子性、促进内吞的膜透过性肽就没有特别限定，优选可以使用化学式(2)表示的分子内排列有8个精氨酸(r)的八聚精氨酸(r8：rrrrrrrr)。
[0184][0185]
本第3实施方式的发光体可以如下制作。
[0186]
图11是表示本发光体的制造过程的主要部分的示意图。
[0187]
首先，通过与第1实施方式同样的方法
·
步骤制作被被膜5被覆的纳米粒子4。
[0188]
即，该纳米粒子4由aginse系化合物半导体形成，在纳米粒子4的表面形成有由第1有机分子膜6和第2有机分子膜7构成的被膜5。另外，第1有机分子膜6的硫醇基等亲水性基团吸附于纳米粒子4的表面，烷基等疏水性基团配置于外侧。第2有机分子膜7由脂肪酸10形成，形成该脂肪酸10的烷基通过疏水性相互作用而吸附于第1有机分子膜6间且纳米粒子4的表面，末端的羧基配置于外侧，由此，赋予了亲水性。
[0189]
接下来，将形成有被膜5的纳米粒子4与由主成分为r8等具有阳离子性的膜透过性肽形成的表面修饰剂31混合。具体而言，以膜透过性肽相对于纳米粒子4的混合比率充分过量，例如，以摩尔比换算计上述混合比率为10000倍左右将上述纳米粒子4与上述表面修饰剂31在液相中混合。由此，第2有机分子膜7的表面被表面修饰剂31被覆，形成本发光体32。例如，在使用r8作为具有阳离子性的膜透过性肽的情况下，如果将形成有被膜5的纳米粒子4与大量的r8混合，则被膜5中的形成第2有机分子膜7的羧基(－cooh)与形成r8的胍基(－nh－(c＝nh)－nh2)反应而形成肽键(－nhco－)，由此第2有机分子膜7与r8键合，因此被膜5被r8被覆，能够制作被该r8表面修饰的发光体32。而且，此时，位于r8的末端的羧基也与外部相接，因此能够确保亲水性。
[0190]
＜生物体物质标记剂＞
[0191]
本发光体3、32由于被赋予了亲水性，且具有良好的发光光谱特性和发光效率，因此即便将上述发光体3、32导入到生物体物质内，也不存在有机溶剂这样的有害物质吸附于生物体组织的情况，能够以期望的高灵敏度且多种颜色对生物体图像进行动态且高效率的解析，另外，由于不含有cd等有害元素，因此能够得到低毒性且适于生物成像的生物标志物的生物体物质标记剂。
[0192]
图12是表示发光体的生物体物质的导入过程的示意图，本发光体表示第3实施方式的发光体。
[0193]
即，被覆被膜5的表面修饰剂31具有阳离子性，因此表面带有正电荷。因此，在与生物体物质表面的带负电荷的细胞膜34之间产生静电相互作用，表面修饰剂31被细胞膜34的表面吸引，如该图12所示，发光体32移动到细胞膜34上。其后，通过所谓的内吞过程将发光体32向细胞膜34的内部输送，被摄入到细胞膜34内，因此发光体32仅通过照射光就发出荧光，由此能够作为生物体物质标记剂来利用。
[0194]
应予说明，在上述实施方式中，对发光体32被表面修饰剂31被覆的情况进行了说明，但即便是未被表面修饰剂被覆的第1和第2实施方式这样的发光体3，也可以通过内吞而将发光体3导入到细胞内。即，此时，发光体3的表面的第2有机分子膜7与细胞膜上的受体结合，在该受体的介导下，能够经过内吞过程将发光体3摄入到生物体物质内，可以作为生物体物质标记剂来利用。
[0195]
如此，本发光体3、32被赋予了亲水性且具有良好的发光光谱特性和发光效率，因此，也不存在有机溶剂这样的有害物质吸附于生物体组织的情况，仅通过对导入到生物体内的发光体照射光就能够确认生物体物质的状态。即，能够对生物体图像以期望的高灵敏度且多种颜色进行动态且高效率的解析，能够得到适于生物成像的生物标志物的生物体物质标记剂。
[0196]
应予说明，本发明不限定于上述实施方式。上述实施方式为本发明的一个实施方式，只要不变更要旨，当然就可以进行变更。例如，上述第3实施方式中，虽然使用aginse系化合物半导体作为纳米粒子，但当然使用如第2实施方式所示的agingase系化合物半导体也同样。
[0197]
另外，本发明的发光体如上所述可以用于生物体物质标记剂，除此以外，还可以在用于激发生物体内的标记的光源中利用。例如，通过在蓝色发光二极管、紫外发光二极管的密封部填充本发明的发光体，本发明的发光体被蓝色发光二极管、紫外发光二极管的激发而在650～1000nm的近红外区域发射，因此能够作为在该波长区域使生物体内的标记激发的光来利用。
[0198]
接下来，对本发明的实施例进行具体说明。
[0199]
实施例1
[0200]
〔试样的制作〕
[0201]
＜分散有纳米粒子的非极性溶液的制作＞
[0202]
分别准备纯度99.99％的se粉末(sigma
‑
aldrich公司制)、纯度99％的乙酸银(nacalai tesque公司制)和纯度99.99％的乙酸铟(alfa aesar公司制)作为纳米粒子材料，分别准备纯度95％的巯基乙酸正辛酯(东京化成工业公司制)、纯度80％的油胺(acros organics公司制)、纯度95％的正辛基醚(东京化成工业公司制)作为溶剂。
[0203]
然后，以合成后的ag/in比为1/2称量这些乙酸银0.133mmol和乙酸铟0.267mmol，将该称量物与搅拌子(stirrer tip)一起投入到内容量为50ml的三颈烧瓶中，接着，添加巯基乙酸正辛酯1ml和正辛基醚9ml进行搅拌，制作ag－in溶液。
[0204]
另外，使se粉末0.4mmol溶解于巯基乙酸正辛酯1ml和油胺1ml，加热到80℃，制作se溶液。
[0205]
接下来，将储存有ag－in溶液的三颈烧瓶减压脱气后，进行氮置换，其后将三颈烧瓶用加热器加热，从室温升温到100℃。然后，在反应场的温度达到100℃的时刻向三颈烧瓶中注入se溶液，使反应场的温度升温到200℃，在该温度进行60分钟加热处理而得到反应物。
[0206]
接着，将该反应物进行空气冷却直到达到室温，其后以转速5000rpm进行5分钟离心分离处理而分离成上清液和沉淀物，回收上清液，弃去沉淀物。
[0207]
接下来，添加上清液的容量的约3倍的乙醇(纯度99.5％，关东化学公司制)，使aginse系纳米粒子沉淀。其后，再次进行离心分离处理并回收上述纳米粒子，在回收的纳米粒子中添加乙醇5ml，利用涡流混合器使沉淀的纳米粒子分散后，以转速5000rpm进行5分钟离心分离处理，再次回收晶体粒子。其后，将甲醇添加
→
离心分离处理
→
纳米粒子的回收这样的操作反复进行多次，使得到的高纯度的纳米粒子分散于作为非极性溶剂的氯仿(纯度99％，nacalai tesque公司制)中，由此得到分散有纳米粒子的非极性溶液。将如此分散于非极性溶液中的超声波处理前的纳米粒子作为试样编号11。
[0208]
＜前体分散溶液～相分离溶液的制作＞
[0209]
准备作为烷基硫醇的纯度95％的1－十二烷硫醇(东京化成工业公司制)、作为脂肪酸的纯度90％的油酸(sigma
‑
aldrich公司制)。
[0210]
另外，将上述分散有纳米粒子的非极性溶液调整成波长400nm处的吸光度为10。然后，在该分散有纳米粒子的非极性溶液1ml中添加1－十二烷硫醇16mg，封盖纳米粒子的表面缺陷，由此形成第1有机分子膜，使形成有该第1有机分子膜的纳米粒子分散于非极性溶液而制作前体分散溶液。
[0211]
接下来，在50ml的烧杯中添加纯水20ml和1m的氢氧化钠(纯度97％，nacalai tesque公司制)25μl而制成碱水溶液，向其中添加油酸40μl，剧烈搅拌5分钟以便整体起泡，由此制作脂肪酸水溶液。
[0212]
其后，将前体分散溶液与上述脂肪酸水溶液混合，制作相分离为氯仿相和水相的相分离溶液。
[0213]
＜超声波照射＞
[0214]
使用超声波均质机(三井电气精机公司制，ux－300)，对相分离溶液照射超声波。
[0215]
该超声波均质机由振荡器和振子构成，由振荡器发出的输出被振子转化为振动能，振子前端的端头(tip)垂直振动，对相分离溶液施加较大的冲击波。即，通过超声波照射施加较大的冲击波而形成均匀的水溶液，能够在水溶液中形成水包油滴型的微乳液。
[0216]
这里，上述端头直径的端头，使探针浸入到相分离溶液1cm左右连续地照射30分钟超声波。超声波均质机的输出设定为该超声波均质机的操作画面的输出显示部条形图(输出功率)为50％左右。
[0217]
＜分散有纳米粒子的水溶液的制作＞
[0218]
如果超声波照射结束，则水溶液再次相分离成水相和氯仿相，赋予有亲水性的纳米粒子移动到水相。
[0219]
接下来，在水相中添加氯仿10ml进行搅拌后，以转速5000rpm进行2分钟离心分离处理，将回收水相的一系列作业进行2次。接下来，在回收的水相中加入纯度96％的己烷(nacalai tesque公司制)10ml进行搅拌，其后，将以转速5000rpm进行2分钟离心分离处理的作业进行2次，进行清洗，由此制作高纯度的分散有纳米粒子的水溶液。将如此分散在水溶液中的超声波处理后的纳米粒子作为试样编号12。
[0220]
〔试样的评价〕
[0221]
图13表示超声波照射前后的相分离溶液。
[0222]
图中，(a)为超声波照射前，(b)为超声波照射后，溶液在超声波照射的前后均相分离为水相和氯仿相。而且，作为发光体的核的纳米粒子在超声波照射前如图13中的(a)所示，分散在作为非极性溶剂的氯仿相内，在超声波处理后如图13中的(b)所示，分散在水相内。如此，确认了纳米粒子在超声波照射后从超声波照射前的氯仿相移动到水相，对发光体赋予了亲水性。
[0223]
接下来，使用紫外可视近红外分光光度计(日立高新技术公司制，u4100)，在光程长1cm、测定波长区域300nm～1500nm的测定条件下对超声波处理后的试样编号12测定吸收光谱和透射光谱。
[0224]
图14表示对试样编号12将波长400nm处的吸光度归一化为0.1时的吸收光谱和透射光谱。图中，横轴为波长(nm)，左纵轴为吸光度(a.u.)，右纵轴为透射率(％)。应予说明，该图14中，除去了作为溶剂的氯仿和水的超声波照射前后的吸收而示出。
[0225]
根据该图14明确可知，透射率在1000～1100nm的波长区域大致为100％，因此，发光体高精度地分散在水中。
[0226]
接下来，使用绝对发光量子产率测定装置(hamamatsu photonics公司制c9920－02)，在25℃的室温下进行测定试样编号11和试样编号12的发光量子产率和发光光谱。
[0227]
其结果可知，对于发光量子产率，试样编号11(超声波照射前)为9％，与此相对，试样编号12(超声波照射后)为44％，超声波照射后的发光量子产率与超声波照射前相比为4.9倍，显著提高。
[0228]
图15表示试样编号11和12的发光光谱。图中，横轴为波长(nm)，纵轴为发光强度(a.u.)。
[0229]
根据该图15明确确认了在试样编号11和12中，均是发光强度的峰值波长均为780nm，半峰宽δh为70nm，即便进行超声波照射也不损害发光光谱特性。
[0230]
图16是将试样编号11(超声波照射前)的吸收光谱以与试样编号12(超声波照射后)的吸收光谱(图14)的对比而示出的谱图。图中，横轴为波长(nm)，纵轴为吸光度(a.u.)。
[0231]
根据该图16明确可知，在超声波照射的前后，吸收端波长几乎没有变化，即便进行超声波照射也未对纳米粒子的带隙能量造成影响。
[0232]
接下来，对试样编号11和12的各试样，使用扫描式透射电子显微镜(scanning transmission electron microscope，以下称为“stem”)(日立高新技术公司制，hd－2300a)，以倍率600k拍摄stem图像。
[0233]
图17表示其拍摄结果。
[0234]
根据该图17明确确认了超声波照射前后(亲水化前后)纳米粒子的平均粒径均为5nm左右，形状、大小看不出变化。
[0235]
由此可知，通过对纳米粒子照射超声波进行亲水化，能够在维持发光强度的峰值波长、半峰宽δh和平均粒径的同时飞跃性地提高发光量子产率。
[0236]
实施例2
[0237]
〔实施例试样的制作〕
[0238]
使用1－十二烷硫醇(纯度95％，东京化成工业公司制)代替巯基乙酸正辛酯，制作分散有纳米粒子的非极性溶液。
[0239]
即，以合成后的ag/in比为1/2称量乙酸银0.067mmol和乙酸铟0.134mmol，将该称量物与搅拌子一起投入到内容量为50ml的三颈烧瓶中，接着，添加1－十二烷硫醇1ml和正辛基醚8ml进行搅拌，制作ag－in溶液。
[0240]
另外，使se粉末0.2mmol溶解于1－十二烷硫醇1ml和油胺1ml，加热到80℃，制作se溶液。
[0241]
接下来，将储存有ag－in溶液的三颈烧瓶内减压脱气后，进行氮置换，其后将三颈烧瓶用加热器加热，从室温升温到150℃。
[0242]
然后，在反应场的温度达到150℃的时刻向三颈烧瓶中注入se溶液，使反应场的温度升温到200℃，在该温度下进行120分钟加热处理而得到反应物。
[0243]
接下来，将该反应物进行空气冷却直到达到室温，其后以转速5000rpm进行5分钟离心分离处理，分离为上清液和沉淀物，回收上清液，弃去沉淀物。
[0244]
接下来，添加上清液的容量的约3倍的乙醇，使aginse系的纳米粒子沉淀。其后，再次进行离心分离处理并回收上述纳米粒子，在回收的纳米粒子中添加乙醇5ml，用涡流混合器使沉淀的纳米粒子分散后，以转速5000rpm进行5分钟离心分离处理，再次回收纳米粒子。其后，将乙醇添加
→
离心分离处理
→
纳米粒子的回收这样的操作反复进行多次，使得到的高纯度的纳米粒子分散于氯仿中，得到分散有纳米粒子的非极性溶液。将如此分散于非极性溶剂中的超声波照射前的纳米粒子作为试样编号21。
[0245]
其后，通过与实施例1同样的方法
·
步骤制作分散有纳米粒子的水溶液，将分散于该水溶液中的超声波处理后的纳米粒子作为试样编号22。
[0246]
〔比较例试样的制作〕
[0247]
通过与上述实施例试样同样的方法
·
步骤制作分散有纳米粒子的非极性溶液。
[0248]
接下来，将3
‑
巯基丙酸(hs(ch2)2cooh)(纯度98％，nacalai tesque公司制)4ml与2m的氢氧化钾(koh)(纯度85％，nacalai tesque公司制)15ml混合，进行制备。然后，将该制备的溶液0.5ml和乙醇1ml放入到试管中。
[0249]
接下来，将分散有纳米粒子的非极性溶液调整为波长400nm处的吸光度为1，将该分散有纳米粒子的非极性溶液1ml添加到上述试管中并盖住。其后，用调整为60℃的温度的加热搅拌器搅拌过夜，使3－巯基丙酸与1－十二烷硫醇和油胺之间发生配体置换反应，对纳米粒子的表面赋予亲水性。然后，空气冷却后，以5000rpm进行5分钟离心分离处理，回收作为沉淀物的纳米粒子。在该纳米粒子中加入乙醇5ml，用涡流混合器分散后，再次以5000rpm进行5分钟离心分离处理，回收纳米粒子，由此进行清洗。使得到的纳米粒子分散于纯水后，以5000rpm进行5分钟离心分离处理，回收上清液，由此制作分散有纳米粒子的水溶
液。将该分散在水溶液中的纳米粒子作为试样编号23。
[0250]
〔试样的评价〕
[0251]
对试样编号21～23的各试样利用与实施例1同样的方法和步骤来测定发光光谱和发光量子产率。
[0252]
图18示出试样编号21～23的发光光谱。图中，横轴为波长(nm)，纵轴为发光强度(a.u)。
[0253]
表1示出试样编号21～23的发光强度的峰值波长(nm)、半峰宽δh和发光量子产率(％)。
[0254]
[表1]
[0255][0256]
*为本发明范围外
[0257]
根据表1和图18明确可知，试样编号23的发光光谱描绘了极其平缓的曲线，无法测定准确的半峰宽δh。另外，发光量子产率也为3％，较低。
[0258]
另外，对于试样编号21，峰值波长为820nm，半峰宽δh为70nm而为100nm以下，陡峭性
·
尖锐性良好，但发光量子产率为12％，较低。
[0259]
与此相对，可知试样编号22的峰值波长和半峰宽δh与试样编号21同样地在超声波照射前后没有变动，发光量子产率为38％，与超声波照射前相比提高到3倍以上。
[0260]
即，即便如试样编号23那样进行配体置换而赋予亲水性，也无法使发光量子产率提高，但在如试样编号22这样进行超声波照射的情况下，能够在将发光强度的峰值波长和半峰宽δh维持在超声波照射前的特性的同时使发光量子产率提高。因此，确认了为了提高发光量子产率，重要的是实施超声波照射。
[0261]
实施例3
[0262]
准备纯度99.99％的乙酰丙酮镓(stremchemicals公司制)，向aginse中注入ga，制作ga含量不同的agingase系纳米粒子，评价发光光谱和发光量子产率。
[0263]
即，称量乙酸银0.133mmol和乙酸铟0.267mmol，进一步以ga/in比为0、1、2称量乙酰丙酮镓。然后，将该称量物与搅拌子一起投入到内容量为50ml的三颈烧瓶中，接着，添加巯基乙酸正辛酯2ml和正辛基醚9ml进行搅拌，制作aginga溶液。
[0264]
另外，使se粉末0.4mmol溶解于巯基乙酸正辛酯2ml和油胺2ml，加热到80℃，制作se溶液。
[0265]
接下来，将储存有aginga溶液的三颈烧瓶内减压脱气后，进行氮置换，其后将三颈烧瓶用加热器加热，从室温升温到100℃。然后，在反应场的温度达到100℃的时刻向三颈烧瓶中注入se溶液，使反应场的温度升温到200℃，在该温度进行60分钟加热处理而得到反应
物。
[0266]
接着，将该反应物进行空气冷却直到达到室温，其后，以转速5000rpm进行5分钟离心分离处理，分离为上清液和沉淀物，回收上清液，弃去沉淀物。
[0267]
接下来，添加上清液的容量的约3倍的乙醇，使agingase系的纳米粒子沉淀。其后，再次进行离心分离处理并回收上述纳米粒子，在回收的纳米粒子中添加乙醇5ml，用涡流混合器使沉淀的纳米粒子分散后，以转速5000rpm进行5分钟离心分离处理，再次回收晶体粒子。其后，将乙醇添加
→
离心分离处理
→
纳米粒子的回收这样的操作重复多次，使得到的高纯度的纳米粒子分散在作为非极性溶剂的氯仿中，得到分散有纳米粒子的非极性溶液。
[0268]
其后，通过与实施例1同样的方法
·
步骤进行包含超声波照射的一系列工序，制作试样编号31(in/ga＝0)、试样编号32(in/ga＝1)和试样编号33(in/ga＝2)的分散有纳米粒子的水溶液。
[0269]
〔试样的评价〕
[0270]
通过与实施例1同样的方法
·
步骤对试样编号31～33测定发光光谱和发光量子产率。另外，对于试样编号32和33，也在超声波照射前测定发光光谱和发光量子产率。
[0271]
图19表示试样编号31～33的超声波照射后的发光光谱的测定结果，图20表示试样编号32、33的超声波照射前和超声波照射后的发光光谱的测定结果。图中，横轴为波长(nm)，纵轴为发光强度(a.u)。
[0272]
表2表示试样编号31～33的超声波照射前后的发光强度的峰值波长(nm)、半峰宽δh和发光量子产率(％)。
[0273]
[表2]
[0274][0275]
如表2和图19所示，对于发光强度的峰值波长，试样编号31为780nm，试样编号32为750nm，试样编号33为700nm，均在近红外区域进行发光。而且，可知伴随ga相对于in的配合比率、即ga/in比变大，发光强度的峰值波长向短波长侧偏移，能够根据ga的含量来控制峰值波长。
[0276]
另外，如表2和图20所示，如果ga/in比为一定，则在超声波照射的前后，峰值波长、半峰宽δh没有变动，但发光量子产率在超声波照射前分别为9％、9％、4％，在超声波处理后为44％、40％、10％，与超声波照射前相比为2.5倍以上。
[0277]
接下来，通过与实施例1同样的方法
·
步骤对试样编号31～33测定吸收光谱。
[0278]
图21表示其测定结果，横轴为波长(nm)，纵轴为吸光度(a.u.)。
[0279]
根据该图21明确，伴随ga的含量增加而吸收端波长向短波长侧偏移，认为因ga成分的注入而带隙变大。
[0280]
综上可知，在aginse系化合物半导体中注入ga的情况下，虽然峰值波长根据ga的含量而向短波长侧偏移，但能够通过超声波处理在保持发光波长和半峰宽δh的同时提高
发光效率。
[0281]
实施例4
[0282]
对实施例1中制作的试样编号12的试样，使用活体成像技术一边与比较例试样进行对比一边评价特性。
[0283]
[比较例试样]
[0284]
使用invitrogen公司制，qdot800itk羧基量子点(以下，称为“qdot800”)作为比较例试样。
[0285]
qdot800的纳米粒子具有核－壳结构，该核－壳结构由包含高毒性的cd的构成元素具有cd、se和te的核和由zns构成的壳形成，zns的表面被含有羧酸酯基(－coo)的高分子化合物被覆。另外，qdot800的平均粒径约为15nm，将该比较例试样即qdot800作为试样编号41。
[0286]
通过与实施例1同样的方法
·
步骤对该试样编号41的试样测定发光量子产率，结果为58％。应予说明，试样编号12的发光量子产率如实施例1中所记载为44％。
[0287]
另外，通过与实施例1同样的方法
·
步骤对试样编号41测定发光光谱。
[0288]
图22为表示试样编号41的发光光谱的谱图，为了比较，再次示出试样编号12(图14)的发光光谱。图中，横轴为波长(nm)，纵轴为发光强度(a.u.)。
[0289]
根据该图22明确：试样编号41的发光强度的峰值波长约为800nm，半峰宽δh与试样编号12相比稍大，但为100nm以下。因此，确认了试样编号41也与试样编号12同样，半峰宽δh在本发明范围内。
[0290]
[毒性评价]
[0291]
使用sigma
‑
aldrich公司制的r8(八聚精氨酸)作为表面修饰剂，将试样编号12和试样编号41分别与r8的混合溶液添加到ascs培养液中，评价对ascs的毒性。
[0292]
即，首先，分别准备作为培养基材的dulbecco改良eagle培养基(dulbeco’s modified eagle’smedium；以下，称为“dmem”。)和营养混合物ham’s f12(nutrient mixture hams’f12；以下，称为“f12”)、作为补充剂的胎牛血清(fetal bovine serum；以下，称为“fbs”)、作为抗生苏的青霉素－链霉素。应予说明，这些dmem、f12、fbs和青霉素－链霉素均使用thermo fisher scientific公司制的产品。
[0293]
然后，将dmem与f12分别等量混合的混合物作为基础培养基，在该基础培养基中混合20％fbs和1％青霉素－链霉素，制作培养基。
[0294]
另外，在上述基础培养基中混合2％fbs和1％青霉素
‑
链霉素，制作ascs维持培养基(以下，简称为“维持培养基”)。
[0295]
另外，作为细胞培养用微孔板，准备康宁公司制的96孔板(纵
×
横：8
×
12，每1孔的容量：360μl)。
[0296]
然后，从小鼠脂肪组织中分离制备干细胞，以细胞数为1
×
104cells/well将上述干细胞接种于96孔板，在37℃的温度下，在co2浓度调整为5％的孵育箱内培养24小时，由此制作第1ascs培养液。
[0297]
接下来，使用维持培养基，以试样编号12或试样编号41的各试样的摩尔浓度分别为规定浓度将r8与试样编号12或试样编号41混合，静置30分钟。具体而言，用维持培养基进行稀释以使试样编号12的摩尔浓度为0～512nmol/l，制作aginse溶液。接着，将r8用维持培
养基稀释以使试样编号12的试样与r8的混合比率以摩尔比计为为试样编号12：r8＝1：10000，制作r8溶液。然后，将该aginse溶液与r8溶液混合，静置30分钟，制作由aginse－r8混合溶液构成的试样编号12a的试样。
[0298]
同样地，对于试样编号41，也用维持培养基进行稀释以使摩尔浓度为0～64nmol/l，制作qdot800溶液。接着，将r8用维持培养基进行稀释以使qdot800与r8的混合比率以摩尔比计为为qdot800：r8＝1：10000，制作r8溶液。然后，将该qdot800溶液与r8溶液混合，静置30分钟，制作由qdot800－r8混合溶液构成的试样编号41a的试样。
[0299]
接下来，将上述第1ascs培养液更换成试样编号12a的试样，用培养基培养24小时，制作第2ascs培养液。同样地，将上述第1ascs培养液更换成试样编号41a，用培养基培养24小时，制作第3ascs培养液。
[0300]
然后，对于试样编号12a和试样编号41a的各试样，使用活细胞数测定试剂盒(同仁化学研究所公司制，cell counting kit
‑
8)，求出将无添加的细胞组的细胞存活率设为100％时的细胞存活率。
[0301]
图23表示试样编号12a的测定结果，图24表示试样编号41a的测定结果。图23和图24中，横轴为摩尔浓度(nmol/l)，纵轴为细胞存活率(％)。
[0302]
根据图23和图24明确，在试样编号41a中，为了得到80％以上的细胞存活率，需要使摩尔浓度为23nmol/l以下，与此相对，在试样编号12a中，即便在摩尔浓度为160nmol/l的情况下，也能够得到80％以上的细胞存活率。即，试样编号12a与试样编号41a相比，能够以约7倍的高浓度进行添加。认为这是由于试样编号41a的纳米粒子含有高毒性的cd，因此即便在将试样编号41a少量添加于细胞中的情况下，死亡的细胞也多，与此相对，试样编号12a的纳米粒子由低毒性的aise系化合物半导体形成，因此即便在摩尔浓度与试样编号41a相比相当程度地高的情况下，也能够有效地抑制细胞的死亡，由此，能够维持较高的细胞存活率。
[0303]
应予说明，在图23和图24中，有时细胞存活率超过100％，另外，在图23中在96nmol/l的摩尔浓度下细胞存活率低于80％，认为这是由于受到96孔板的各孔中的细胞增殖性的偏差、细胞的耗竭度等因素影响。然而，如果整体上观察图23和图24的图表的特性，则可以如上对细胞存活率进行评价。
[0304]
[试样的荧光强度]
[0305]
采用作为细胞清洗溶液而广泛使用的sigma
‑
aldrich公司制的磷酸缓冲生理盐水(phosphate
‑
buffered saline；以下，称为“pbs”)，进行稀释以使试样编号12的摩尔浓度为160nmol/l。另外，对于试样编号41，也使用pbs进行稀释以使摩尔浓度为23nmol/l。
[0306]
然后，对于这些稀释后的试样编号12和试样编号41，使用perkinelmer公司制的ivis spectrum ct，在激发光为710nm、检测滤波器的波长为800nm的条件下测定荧光强度。
[0307]
图25表示试样编号12和试样编号41的各试样的荧光强度，纵轴为荧光强度(p/s)/(μw/cm2)。各荧光强度示为减去pbs单独的荧光强度而得的值，对发光源本身的荧光性进行评价。
[0308]
即，对于荧光强度，试样编号12为9.0
×
10
10
(p/s)/(μw/cm2)，试样编号41为9.6
×
10
10
(p/s)/(μw/cm2)。因此，确认了试样编号12具有相当于试样编号41的约94％的荧光强度，作为本发明试样的试样编号12具有与作为比较例试样的试样编号41(qdot800)同等程
度的充分的荧光强度。
[0309]
接下来，将试样编号12的试样用pbs进行稀释以使摩尔浓度为0nmol/l、20nmol/l、40nmol/l、80nmol/l和160nmol/l，将上述稀释后的各试样注入到小鼠皮下的规定位置。然后，与上述同样地在激发光为710nm、检测滤波器的波长为800nm的条件下利用ivis spectrum ct测定荧光强度。
[0310]
图26是表示试样编号12的荧光状态的显微镜照片。图中，标记〇表示添加了各摩尔浓度的试样的周边区域。原画为彩色图像，图26将彩色图像转换为单色图像而显示。原画中，荧光强度低的区域显示蓝色，荧光强度高的区域显示黄色，强度差用多种颜色表现，但在转换为单色图像的图26中，以深浅表示荧光强度的强度差。应予说明，图中，将“mol/l”简记载为“m”。
[0311]
根据该图26明确，试样编号12无添加、即摩尔浓度为0nmol/l时不发出荧光，摩尔浓度为20nmol/l和40nmol/l时，添加区域整体的色调深，表示荧光强度低。与此相对，可知在摩尔浓度为80nmol/l和160nmol/l时，周边部的色调深，荧光强度低，但中心部色调浅，荧光强度高。而且，由此确认了注入到细胞内的试样的摩尔浓度与荧光强度存在正相关关系。
[0312]
[标记性的评价]
[0313]
使用上述的培养基，将1
×
105cells的ascs接种于25ml的细胞培养瓶(康宁公司制)，在37℃的温度下，在co2浓度制备为5％的孵育箱内培养24小时，制作第4ascs培养液。其后，用维持培养基进行稀释以使试样编号12的试样的摩尔浓度为15nmol/l，制作aginse溶液。另外，将r8用维持培养基进行稀释以使r8的摩尔比为试样编号12的10000倍，制作r8溶液。接着，将该aginse溶液与r8溶液混合，静置30分钟，制作由aginse－r8混合溶液构成的试样编号12b的试样。其后，将上述第4ascs培养液更换成试样编号12b的试样并培养24小时，制作第5ascs培养液。接下来，使用胰蛋白酶－edta溶液(sigma
‑
aldrich公司制)，将试样编号12b从细胞中剥离并回收。接着，将5
×
104cells用pbs稀释，与上述同样地，在激发光为710nm、检测滤波器的波长为800nm的条件下利用ivis spectrum ct测定试样编号12b和pbs的荧光强度。
[0314]
图27表示其测定结果。纵轴为荧光强度(p/s)/(μw/cm2)，表示从试样编号12b中减去pbs单独的荧光强度而得的值。
[0315]
根据该图27明确，试样编号12b的荧光强度为1.4
×
107(p/s)/(μw/cm2)，并确认到aginse系纳米粒子的荧光，因此可知得到了良好的标记性。
[0316]
[试样的元素浓度]
[0317]
使用上述的培养基，将7
×
105cells的ascs接种于上述25ml的细胞培养瓶中，与上述同样地进行培养，制作第6ascs培养液。接着，用维持培养基稀释以使试样编号12的摩尔浓度为10nmol/l，制作aginse溶液。另外，将r8用维持培养基进行稀释以使摩尔比为试样编号12的试样的10000倍，制作r8溶液。接着，将该aginse溶液与r8溶液混合，静置30分钟，制作由aginse－r8混合溶液构成的试样编号12c的试样。
[0318]
其后，将第6ascs培养液更换成试样编号12c的试样并培养24小时。接着，使用上述胰蛋白酶－edta溶液，将试样编号12c从细胞中剥离并回收。
[0319]
另外，不将aginse溶液与r8溶液混合，除此以外，通过与上述试样编号12c同样的方法
·
步骤制作未被r8表面修饰的试样编号12d的试样。
[0320]
进而，不添加aginse－r8混合溶液，除此以外，通过与上述试样编号12c同样的方法
·
步骤制作仅由细胞构成的试样编号42的试样。
[0321]
接下来，使试样编号12c、试样编号12d和试样编号42分散于水中，利用icp－ms(inductively coupled plasma－mass spectrometry；电感耦合等离子体质谱仪)测定元素浓度。
[0322]
表3示出其测定结果。
[0323]
[表3]
[0324][0325]
*表示本发明范围外
[0326]
根据该表3明确，试样编号42由于仅为细胞，因此ag、in为检测限以下。另一方面，由于试样编号12c和12d均添加了aginse纳米粒子，因此检测出ag和in。而且，被r8表面修饰的试样编号12c与未被r8表面修饰的试样编号12d相比，ag和in的元素浓度提高到2.3～2.6倍。因此，确认了通过将aginse系纳米粒子的表面用r8修饰，能够有效地将该aginse系纳米粒子导入到细胞内。
[0327]
应予说明，试样编号12c、12d和42的各试样均检测出zn，认为这是检测出了作为细胞构成成分而微量含有的zn成分。
[0328]
产业上的可利用性
[0329]
实现发光量子产率为10％以上、优选30％以上、在650～1000nm的近红外区域半峰宽δh为100nm以下、较小、强烈发光、在水中分散的发光体，得到低毒性且适于生物成像的生物标志物的生物体物质标记剂。
[0330]
符号说明
[0331]2ꢀꢀ
水
[0332]
3、32
ꢀꢀ
发光体
[0333]4ꢀꢀ
纳米粒子
[0334]5ꢀꢀ
被膜
[0335]6ꢀꢀ
第1有机分子膜
[0336]7ꢀꢀ
第2有机分子膜
[0337]8ꢀꢀ
表面保护剂
[0338]9ꢀꢀ
烷基硫醇
[0339]
10
ꢀꢀ
脂肪酸
[0340]
11
ꢀꢀ
非极性溶剂
[0341]
16
ꢀꢀ
脂肪酸水溶液
[0342]
17
ꢀꢀ
水相
[0343]
18
ꢀꢀ
非极性溶剂相
[0344]
19
ꢀꢀ
相分离溶液
[0345]
20
ꢀꢀ
超声波
[0346]
31
ꢀꢀ
表面修饰剂
[0347]
34
ꢀꢀ
细胞