一种生物炭固定化微生物的土壤改良及植物促生制剂的制备方法

本发明属于污染土壤治理技术及微生物肥料制备技术，具体涉及生物炭固定化微生物的土壤改良及植物促生制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、根据农业农村部科技发展中心的蔡彦虹及其团队的研究[1]指出，耕地受重金属污染造成退化已成为全球面临的重要问题，重金属污染的土壤不仅直接影响粮食等农作物产量与品质，还能通过食物链直接或间接影响其他生物。耕地中重金属cd的污染最为严重，其次为铬、铅等重金属。

2、传统的土壤改良方法是利用腐殖酸、石灰和钝化剂等物质来提高土壤有机质或降低土壤中的重金属含量。2019年农业农村部发布了《受污染耕地治理与修复导则(ny/t3499-2019)》，规定了受污染耕地治理与修复的基本原则：在土壤污染的治理中，在达成基本目标的同时应优先考虑修复方法对土壤性质的损伤风险以及环境污染风险，防止二次污染，保证耕地可持续利用。在这一原则下，许多用于降低重金属含量的传统土壤改良方法，因为了降低土壤中的重金属而牺牲了土壤的肥力，而导致这些技术难以在实际中使用。

3、为了满足前述原则，本领域研究者们将研究目光聚焦在环境友好型、可持续发展型的重金属土壤改良技术中。例如，农业农村部环境保护科研监测所的姚彦坡和安毅研究团队，总结了生物炭固定化微生物修复污染土壤的研究进展，指出生物炭固定化微生物技术具有高效、低成本和环境友好性的优点，在土壤修复中展现出巨大的应用潜力，并总结了已有生物炭固定化微生物技术的发展情况[2]。同时，该团队也指出，对于污染物成分较多的情况，还需要考虑如何进一步提高对土壤复合污染物的降解效果。除此之外，生物炭固定化微生物技术还面临着，引入的微生物虽然能降解重金属，但是不利于形成促进作物生长的微生物生态，从而导致相关技术在解决土壤重金属污染之时，未能提高耕地的使用价值。

4、为了解决上述问题，本领域主要从筛选既能具有土壤改良效果，又能促进作物生长的菌株方面进行研究，例如zl202010275497.3筛选出了一株防病促生和土壤改良的解淀粉芽孢杆菌peba20。然而，这方面的研究依赖于在不同诱变环境下进行大量筛选工作，由于所得菌株既需要具有相应的抗逆性，又能具备促进作物生长的效果，这使得相应诱变条件的设置变得十分复杂且难以预设，从而导致这方面研究的成果具有极大偶然性。因此，利用已有菌株进行相关摸索研究，可能是一条更具有可行性的研究途径。

5、综上所述，本领域亟需基于已有微生物，研发一种既能降低土壤中的重金属含量，又能促进作物生长的技术。

6、[1]王凯,孙星星,秦光蔚,等.我国土壤改良修复工程技术研究进展[j].江苏农业科学,2021,49(20):9.

7、[2]杜兆林,陈洪安,姚彦坡,等.生物炭固定化微生物修复污染土壤研究进展[j].农业环境科学学报,2022,41(12):2584-2592.

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于克服现有技术中固定化微生物技术难以兼顾土壤改良和促进植物生长的缺陷，提供一种可以更好降低土壤中重金属cd、pb和cr含量，同时能够促进植物生长、降低病害指数的制剂。

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、一种生物炭固定化微生物的土壤改良及植物促生制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

4、(1)向经蒸汽爆破处理的秸秆接种微生物组合a，进行堆沤处理3～5天，之后烘干后粉碎；所述微生物组合a由枯草芽孢杆菌ds3和萎缩芽孢杆菌ba10按照菌体数目比2:1组成；

5、(2)将棕榈纤维粉末浸泡在氢氟酸中0.5～3小时之后烘干，并按照重量比1:3:7～10的比例与步骤(1)所得物和田螺壳粉末混合，置于炭化炉中，通入氮气保护，于500～700℃下高温炭化0.5-3小时，得到生物炭；

6、(3)将步骤(2)所得生物炭浸没于微生物组合b的培养液中，过滤后，即得所述土壤改良制剂；

7、所述微生物组合b由枯草芽孢杆菌ds3、萎缩芽孢杆菌ba10、赤霉菌1210-2和细黄链霉菌nmg2-4-8按照菌体数目2:1:1:1组成；

8、所述枯草芽孢杆菌ds3的保藏号为cctcc m 2010146；

9、所述萎缩芽孢杆菌ba10的保藏号为cgmcc no.12053；

10、所述赤霉菌1210-2的保藏号为cctcc no：m 2012524

11、所述细黄链霉菌nmg2-4-8的保藏号为cgmcg no.3442；

12、所述植物包括十字花科作物；所述土壤改良包括降低土壤中cd、pb和cr的含量。

13、本发明研究之初，是基于发明人纪丁愈团队开发的田螺壳生物炭制备技术(部分研究成果见发明专利zl201910611307.8)，以期利用该生物炭固定微生物来解决土壤中的重金属污染问题。

14、赤霉菌1210-2是一种能够生产纳米银的菌株，最先报道于zl201210579134.4。根据其记载，其可以通过还原重金属，形成纳米粒子。发明人基于此，开展了将其固定在螺壳生物炭，并用于土壤修复的实验。发明人通过实验表明，其在土壤中对于减小重金属含量的效果有限，更重要的是，用其修复土壤后，再种植十字花科作物，还会抑制作物的生长。

15、目前，关于可以修复重金属污染土壤方面的微生物的研究中，芽孢杆菌的报道相对较多，例如芽孢杆菌crb-7在蛭石+腐殖酸+海藻酸钠的载体上，可以对cr实现96.18％的钝化率(wu m h,li yz,li j j，et al.bioreduction of hexavalent chromium using anovel strain crb-7immobilized on multiple materials；[j].journal of hazardousmaterials,2019,368:412-420.)；再如芽孢杆菌k1稻草生物炭上，可以对cd实现85％的降低效果(wang l，chen h,wu j,et al.effects ofmagnetic biochar-microbe compositeon cd remediation and microbial responses in paddy soil[j].journalofhazardous materials，2021,414:125494.)。同样遗憾的是，当发明人将上述芽孢杆菌单独或者与赤霉菌1210-2混合固定在田螺壳生物炭上，同样不能促进十字花科作物的生长。

16、通过不断的摸索，发明人发现当将枯草芽孢杆菌ds3、萎缩芽孢杆菌ba10、赤霉菌1210-2和细黄链霉菌nmg2-4-8混合，并固定在田螺壳生物炭上后，不仅可以大幅度减少土壤中重金属的含量，同时不会对十字花科作物的生长产生抑制。在所选用的菌株中，仅有赤霉菌1210-2被已有报道证明可用于去除重金属。在研究过程中，发明人选用萎缩芽孢杆菌ba10和细黄链霉菌nmg2-4-8是期望利用其在作物疫病防治的作用，然而发明人遗憾的发现，利用该两种菌株在根肿病的防治方面，效果差强人意，而且该两种菌的加入对于赤霉菌1210-2在重金属去除效果方面也没有改善。意外的是，当加入枯草芽孢杆菌ds3后，所得生物炭固定微生物制剂，可以大幅度的降低重金属的含量。其原因可能在于枯草芽孢杆菌ds3的抗逆性较强(已报道其可以耐受高浓度皂素废水)，其代谢产物可能有助于赤霉菌1210-2对于重金属的生物转化或者内吞包裹，至于萎缩芽孢杆菌ba10和细黄链霉菌nmg2-4-8在本发明微生物组合中如何提高重金属去除效果，目前尚未找到合适的理论推测，还需要进一步的研究。

17、由于上述生物炭固定微生物制剂在促进作物生长方面效果不突出，而萎缩芽孢杆菌ba10在针对本发明受试作物大白菜的疫病(黑斑病)是有效的，发明人考虑先通过发酵获得相应代谢产物，再进行下一步的生物炭制备。经过大量摸索发明人意外发现，当将利用枯草芽孢杆菌ds3、萎缩芽孢杆菌ba10接种经过处理的秸秆，短暂发酵后制成干燥粉碎物，并将所得粉碎物作为生物炭的原料之一后，所得生物炭不仅具有更好的重金属去除效果，而且还能很好的促进十字花科的生长，并起到防治十字花科根肿病的效果。可能的原因在于，枯草芽孢杆菌ds3、萎缩芽孢杆菌ba10的初级代谢产物中一些非蛋白的成分(因蛋白在高温后会失活)在高温后，对固定微生物时所选的微生物组合起到诱导作用，诱导产生了促进植物生长的代谢产物；对于重金属去除效果的影响的原因，可能是由于新原料的加入，使得生物炭表面形貌发生利于微生物组合以更好形式分布的变化，使得微生物组合在去除重金属方面产生了增效效应。

18、可选地，所述秸秆包括玉米秸秆、油菜秸秆、水稻秸秆中的至少一种。

19、优选地，所述蒸汽爆破具体的方法为：将秸秆破碎至3～5cm，在汽爆罐内，于1.6～1.8mpa下进行汽爆处理8～10分钟。

20、蒸汽爆破主要目的在于破坏秸秆组织结构，利于微生物发酵。

21、优选地，接种微生物组合a时，微生物组合a中的菌浓为1×108个/ml，按体积百分数接种量为2％。

22、优选地，所述田螺壳粉末的粒径为0.7～0.8mm，所述棕榈纤维粉末的粒径为0.2～0.3mm。

23、优选地，步骤(2)中，炭化温度为600℃，炭化时间为2小时。

24、优选地，步骤(3)中，微生物组合b的培养液中的菌浓为1×108个/ml，浸没时的温度为30℃；浸没时间为20～30分钟，于150rpm的摇床中进行。

25、可选地，进行过滤时，先用滤网过滤取固相物质，之后用无菌生理盐水对所得固相物质进行清洗并再次过滤。

26、本发明还提供了基于上述制备方法制备得到的生物炭固定化微生物的土壤改良及植物促生制剂。

27、本发明还提供了上述土壤改良制剂在作为生物肥促进植物生长、防治植物疫病和去除土壤中重金属改良土壤中的应用；所述植物包括十字花科作物，所述植物疫病包括十字花科根肿病；所述重金属包括cd、pb和cr。

28、本发明的有益效果：

29、本发明所得的制剂可以大幅度的去除土壤中的cd、pb和cr，同时还可以显著的促进十字花科作物的生长和减少根肿病的发生，具有较好的产业推广价值。