一种检测鳞状细胞癌抗原的荧光材料、荧光免疫传感器及其应用

本发明涉及肿瘤检测，特别是涉及一种检测鳞状细胞癌抗原的荧光材料、荧光免疫传感器及其应用。

背景技术：

1、鳞状细胞癌抗原(scca)是晚期鳞状细胞肿瘤的血清学标志物。人血清中高scca水平与宫颈癌、肺鳞状细胞癌、食管癌等密切相关，因此对人血清中的scca进行检测，是宫颈癌、肺鳞状细胞癌、食管癌等早期筛查的重要手段。目前，检测scca的检测方法包括放射免疫分析、免疫比色法、电化学免疫传感技术等。然而，现有的技术都存在一些问题，影响了它们在血清中低浓度水平scca痕量检测的要求。其中，放射免疫分析的放射性和安全问题有待解决；免疫比色法的灵敏度不够高，无法满足痕量分析的要求；而电化学免疫传感技术的稳定性和重现性有待进一步加强。因此，研究血清中痕量scca的高灵敏和稳定性好的检测新方法具有重要意义。

2、荧光分析方法因其灵敏度高、成本低、响应速度快、操作简单等优点在免疫分析领域越来越受到人们的关注。其中，荧光分析方法中的荧光试剂是荧光传感器等检测平台的核心。传统的荧光试剂主要是有机染料、金属量子点等。但是上述传统的荧光试剂应用于荧光传感器，往往生物兼容性不好，量子产率低并且具有一定的毒性，这限制了它们的应用。此外，传统荧光传感器往往对目标分子不具备特异性，抗干扰能力有待进一步提升。因此，研发具有良好生物兼容性、高量子点产率，毒性低，并且具有对目标分子具有选择识别性能的荧光传感器仍然是当前荧光分析技术的重要挑战。近年来，一些新型的荧光纳米材料，比如碳量子点得到了越来越多的关注。碳量子点(cqds)是一类具有显著荧光特性零维碳纳米材料，具有分子量小、微纳尺度、荧光稳定、无光闪烁、宽激发光谱、连续和可调发射波长、生物相容性高、低毒性等优点。因此，广泛应用于生物检测与传感、体内和体外成像、药物递送和诊断药物等生物医学领域。由于荧光稳定性强，根据荧光强度变化，cqds用于检测多种阴阳离子(k+、a13+、br-等)、药物分子(四环素、抗生素、土四环素等)和生物分子(dna、蛋白质、胆固醇等)。但目前，尽管cqds具有独特的光学性能，但仍然存在荧光效率低的问题，其实际应用受到限制，为提高其荧光效率，n原子掺杂是目前较为有效的用于改性cqds的方式。为了进一步提升cqds的荧光性能，随着研究的深入发现采用无机纳米材料结合cqds，不仅可以有效提高cqds在水溶液中的稳定性，而且对其发光性能的提升同样具有重要的作用。在提升荧光传感器的选择性识别能力方面，引入分子识别元件是重要的途径。比如dna适配体、分子印迹膜等。然而相对于这些分子识别元件而言，抗原-抗体之间的免疫反应的特异性更高，并且稳定性和可靠性更强，因此，开发基于免疫反应的荧光传感器对于医学检验领域，特别是癌细胞标志物的检测具有重要的意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种检测鳞状细胞癌抗原的荧光材料、荧光免疫传感器及其应用，由于本发明提供的荧光材料(agnps@n/cqds)具有很高的荧光量子产率，传感器表现出了很高的灵敏度，而三明治的免疫结构则使得传感器表现出了对scca很强的特异性，检测过程中能够有效排除干扰。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种检测鳞状细胞癌抗原的荧光材料，由包括以下步骤制备得到：

4、1)将菠萝叶进行热解，得到热解物；

5、2)将所述步骤1)得到的热解物与混合酸混合、回流，得到回流液；

6、所述混合酸包括浓硫酸和浓硝酸，所述浓硫酸和浓硝酸的体积比为3:1；

7、3)将所述步骤2)得到的回流液与水混合，调节ph值为7.2后，依次进行过滤、透析和干燥，得到干燥物；

8、4)将所述步骤3)得到的干燥物分散于水中，再与乙二胺溶液混合后进行热处理，将得到的热处理物透析、旋蒸，得到旋蒸物；

9、5)将所述步骤4)得到的旋蒸物分散于水中，再与柠檬酸钠混合后进行水浴处理，再与硝酸银混合后进行水浴回流、干燥，得到荧光材料。

10、优选的，所述步骤1)热解的条件包括：温度为700℃，时间为3h；

11、所述菠萝叶在热解前还包括：将所述菠萝叶在70℃下烘干6h，再研磨为粉末；

12、所述步骤2)热解物的质量与混合酸的体积比为3g:10ml；

13、所述回流的条件包括：温度为90℃，时间为2h。

14、优选的，所述步骤3)水与步骤2)热解物的质量比为100:3；

15、所述过滤使用的滤膜孔径为0.22μm；

16、所述透析的条件包括：透析袋的截留分子量为3500d，透析时间为4h，透析液为pbs溶液，所述pbs溶液的浓度为0.05mol/l，ph值为7.4。

17、优选的，所述步骤4)乙二胺溶液的浓度为0.5mol/l；

18、所述干燥物的质量与水的体积、乙二胺溶液的体积比为0.5g:10ml:10ml；

19、所述热处理的条件包括：温度为240℃，时间为3h；

20、所述透析的条件包括：透析袋的截留分子量为3500d，透析时间为5h，透析液为pbs溶液，所述pbs溶液的浓度为0.05mol/l，ph值为7.4；

21、所述旋蒸的温度为50℃。

22、优选的，所述步骤5)水的体积与柠檬酸钠的质量、步骤3)干燥物的质量比为10ml:10mg:0.5g；

23、所述水浴处理的条件包括：温度为95℃，时间为30min；

24、所述柠檬酸钠与硝酸银的质量比为10:20；

25、所述水浴回流的条件包括：温度为95℃，时间为1.5h；

26、所述水浴回流后经过0.22μm的滤膜后，滤液进行干燥，所述干燥的条件包括：温度为70℃，时间为5h。

27、本发明还提供了一种检测鳞状细胞癌抗原的荧光免疫传感器，由包括以下步骤制备得到：

28、a、将氧化铟锡电极与pbs缓冲液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液混合后进行静置反应，得到荧光材料修饰的电极；

29、所述pbs缓冲液含有权利要求1～5任一项所述的荧光材料，浓度为0.005g/ml；

30、b、将所述步骤a得到的荧光材料修饰的电极与鳞状细胞癌一抗溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、n-羟基琥珀酰亚胺溶液混合后继续反应，得到继续反应物；

31、c、将步骤b得到的继续反应物与牛血清白蛋白溶液混合后进行封闭反应，洗涤后，与鳞状细胞癌抗原溶液混合、孵育，再与纳米金标记的鳞状细胞癌二抗溶液混合、孵育反应，得到荧光免疫传感器。

32、优选的，所述步骤a中ito电极的长度为2cm，宽度为0.5cm；

33、所述pbs缓冲液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液的体积比为10:1；所述pbs缓冲液的浓度为0.05mol/l，ph值为7.4；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液的浓度为0.02mol/l；

34、所述静置反应的时间为10min，在静置反应前先搅拌5min。

35、优选的，所述步骤b中鳞状细胞癌一抗溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、n-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为2:1:0.5；

36、所述鳞状细胞癌一抗溶液的浓度为0.005g/ml，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液的浓度为0.02mol/l，所述n-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为0.05mol/l；

37、所述继续反应的时间为10min，在继续反应前先搅拌5min。

38、优选的，所述步骤c中牛血清白蛋白溶液的质量百分含量为1％，所述封闭反应的条件包括：温度为4℃，时间为5min；

39、所述孵育的条件包括：温度为37℃，时间为20min；

40、所述鳞状细胞癌二抗溶液的浓度为0.005g/ml；

41、所述孵育反应的条件包括：温度为37℃，时间为25min。

42、本发明还提供了上述技术方案所述的荧光材料或上述技术方案所述的荧光免疫传感器在制备检测鳞状细胞癌抗原试剂盒中的应用。

43、本发明的有益效果为：

44、本发明以菠萝叶为原料，采用热裂解法合成了一种具有优异荧光性能的核壳型荧光材料：银纳米颗粒@氮掺杂石墨烯量子点(agnps@n/cqds)，并通过交联剂将agnps@n/cqds修饰到氧化铟锡电极(ito)表面，紧接着将鳞状细胞癌抗体(一抗)通过戊二醛结合到agnps@n/cqds上；然后将ito电极用于吸附捕获scca后，通过免疫反应使得scca与金纳米标记的鳞状细胞癌抗体(二抗)结合，构建三明治免疫结构，从而得到新型荧光免疫传感器。由于agnps@n/cqds具有很强的荧光信号，而金纳米能够有效猝灭这个荧光信号，因此，通过ito电极吸附不同浓度的scca，再结合相应浓度的金纳米标记二抗，获得不同的荧光信号，从而建立检测scca的荧光新方法。由于agnps@n/cqds具有很高的荧光量子产率，传感器表现出了很高的灵敏度，而三明治的免疫结构则使得传感器表现出了对scca很强的特异性，检测过程中能够有效排除干扰。线性检测范围为5.0×10-12-6000×10-12mol/l，检测限为1.26×10-12mol/l。