来源于京尼平或含京尼平材料的着色剂复合物的制作方法

来源于京尼平或含京尼平材料的着色剂复合物的制作方法
【专利说明】来源于京尼平或含京尼平材料的着色剂复合物 发明背景 1 .技术领域 本公开内容涉及着色剂复合物、包含其的组合物以及制造和使用其的方法，所述着色 剂复合物是从美洲格尼帕树(Genipa americana)汁，京尼平或京尼平类似物与胺的反应中 分离的。 2.【背景技术】 消费者对使用合成着色剂的怀疑(主要由于其毒性)导致了天然着色剂化合物的研究 和开发。这些化合物已被使用了多个世纪，但是最近的技术进展使得这些着色剂能够在工 业上和商业上可行，并且能够与合成着色剂竞争。参见联合国贸易和发展会议（2005)提出 的"Market Brief in the European Union for selected natural ingredients derived from native species;Genipa americana"。国际上，天然着色剂（例如，美洲格尼 帕树的蓝色和黑色着色剂)在食物、化妆品和纺织工业中均有使用。 制备蓝色着色剂的方法已报道过。例如Echeverri等(美国专利No.7,927,637,其内容 通过引用整体并入本文中）描述了制备pH稳定的蓝色着色剂的方法，所述蓝色着色剂来源 于从美洲格尼帕树果肉获得的未加工原汁与甘氨酸的混合物。制备蓝色着色剂的另一些实 例包括H. Okuyama等的日本专利公开No. 52053932A2和52053934A2，其描述了由伯胺与京尼 平的自发反应制备的蓝紫色着色剂；以及Wu等(W0 2009/120579)，其描述了将美洲格尼帕 树汁与其他果汁(例如西瓜)和氨基酸混合。这些现有方法一般使用不经进一步纯化得到的 粗混合物，其原因可能是本领域公认的纯化这些混合物的难度。参见Touyama R等，Studies on the Blue Pigments Produced from genipin and methylamine. I. Structures of the Brownish-Red Pigments，Intermediates Leading to the Blue Pigments，Chem Pharm.Bull 42,66,1994(来源于京尼平或结构类似物与氨基酸的反应的蓝色颜料"基于其 色谱行为、不可分析的13C-NMR谱图并通过分子量测量被发现是难以处理的高分子聚合物的 混合物"）。关于蓝色颜料材料分子结构的描述有限，这是因为这种材料由于其非常高的极 性而几乎只溶于水，从而导致TLC监测困难。已报道了分子量为9000的聚合物（参见 H. Jnouye，Y等，26th Symposium on the Chemistry of Natural Product，Kyoto,摘要·第 577至584页，1983)。最近，Wu和Horn(美国公开No. 2013/0115252)描述了从美洲格尼帕树中 富集京尼平的方法以及所富集的京尼平材料的用途。然而，"富含京尼平的提取物"被公开 为30%至97% (重量/重量）京尼平，并且组合物的剩余部分包含水分、脂肪、少量的酸和含 氮化合物，余量为碳水化合物(参见美国公开No. 2013/0115252,第3页，左栏）。
【发明内容】
本发明的贡献为克服关于来源于京尼平与氨基酸的反应的蓝色颜料材料的分子结构 的知识缺乏。本文提供了包含基本上经纯化的着色剂复合物(例如，聚合物）的着色剂组合 物，和分离着色剂复合物的方法以及使用经分离的着色剂复合物的方法。 某些实施方案涉及基本上经纯化的式1A或式1B的化合物、其几何异构体、其互变异构 体、其盐或其组合；
某些实施方案涉及基本上经纯化的式2、3A或3B的化合物、其几何异构体、其互变异构 体、其盐或其组合。
某些实施方案涉及着色剂组合物，所述着色剂组合物包含式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐， 其中η为2至200的整数； 其中Α各自独立地选自式5Α、式5Β、式5C、其几何异构体、其互变异构体、其盐及其组合：
其中： R1为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基； R2和V 2独立地为氢或Ci-iq:院基； R3是氢或COOH; 并且其中T1为氢或甲基;且T2为氢或A-T1，其中A和T1如上所限定； 其中所述着色剂组合物基本上不含选自式6、式7、式8、其几何异构体、其互变异构体及 其盐的第一附加化合物：
在一些实施方案中，着色剂组合物包含式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐， 其中η为2至20的整数； 其中Α各自独立地选自式5'Α、式5'Β、式5'C、其几何异构体、其互变异构体、其盐及其组 合：
其中： R1为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基； 并且其中T1为氢或甲基;且T2为氢或A-T1，其中A和T1如上所限定； 其中所述着色剂组合物基本上不含选自式式3'A、式3'B、其几何异构体、其互变异 构体及其盐的第一附加化合物：
在一些实施方案中，R1是甲基。在一些实施方案中，按聚合物的重量计第一附加化合物 的总重量小于1 %。 某些实施方案涉及基本上经纯化的式3ΚΜΘ)或式3ΚΜΘ)的化合物、其几何异构体、 其互变异构体、其盐或其组合：
某些实施方案涉及基本上经纯化的式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐， 其中η为2至20的整数； 其中Α各自为式S^Me)、其几何异构体、其互变异构体或其盐：
其中Τ1是氢或甲基;且Τ2是氢或Α-Τ1，其中Α和Τ1如上所限定。 某些实施方案涉及经纯化的着色剂复合物以及来源于京尼平与甘氨酸的反应的着色 剂复合物的分离方法。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于经纯化的京尼平(例如，按 重量计大于80%、85%、90%、95%或99% )与甘氨酸的反应。在一些实施方案中，着色剂复 合物来源于甘氨酸与包含京尼平的汁的反应。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于甘 氨酸与来自美洲格尼帕树的果汁的反应。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于经纯化 的甘氨酸与京尼平的反应，其中所述京尼平是经纯化的京尼平(例如，按重量计大于80%、 85%、90%、95%或99% )或包含京尼平的汁。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于包含 甘氨酸的混合物(例如，包含甘氨酸的汁或包含甘氨酸的干混合物如包含甘氨酸的汁浓缩 物)与京尼平的反应，其中所述京尼平是经纯化的京尼平(例如，按重量计大于80%、85%、 90%、95%或99% )或包含京尼平的汁。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于包含甘氨 酸的汁（例如果汁，如来自以下的汁：西瓜、白葡萄、菠萝、荔枝、哈密瓜、香蕉、桔子、苹果、 梨、柠檬、西番莲果、红葡萄、蓝莓、罗望子、桃、木瓜、巴西莓、李子、番石榴、柑橘、博罗霍果、 古布阿苏果、枸杞或猕猴桃)与包含京尼平的汁(例如果汁，如来自美洲格尼帕树的汁)的反 应。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于来自西瓜的汁与来自美洲格尼帕树的汁的反 应。 某些实施方案涉及分离着色剂复合物的方法，所述方法包括：用醇溶剂提取来源于京 尼平与甘氨酸的反应的蓝色混合物，以产生醇溶性部分和醇不溶性部分;纯化醇溶性部分 或醇不溶性部分。在一些实施方案中，蓝色混合物为来源于京尼平与甘氨酸的反应的干粉 (例如，冻干粉）。 某些实施方案涉及基本上经纯化的着色剂复合物，所述着色剂复合物包含经纯化的式 4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐。在一些实施方案中，基本上经纯化的着色 剂复合物包括式2、式S'AWe)或式3ΚΜΘ)的二聚物。在一些实施方案中，基本上经纯化的 着色剂复合物，例如聚合物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐），不 含碳水化合物，例如糖。在一些实施方案中，基本上经纯化的着色剂复合物包含至少80%、 85%、90%、95%、99%或100%不含碳水化合物并且至少80%、85%、90%、95%、99%或 100%不含其他杂质（例如，单体、二聚物、脂肪酸、脂肪、蛋白质和/或有机酸）的聚合物(例 如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐）。 在一些实施方案中，赋予基质蓝色的方法包括使所述基质与本文所述的着色剂组合物 相接触。在一些实施方案中，所述基质是食物、药物或营养品、化妆品或医疗装置。在一些实 施方案中，着色剂组合物包含经纯化的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐。 在一些实施方案中，着色剂组合物包含基本上纯的式2、式3ΚΜΘ)或式3ΚΜΘ)的二聚物。 【附图说明】 图1A-B示出1号化合物的两种异构体形式的化学式。 图2A-B示出1号化合物的两种异构体形式的化学式的另一种表示。 图3A-B示出3号化合物的两种异构体形式的化学式。 图4A-B示出3号化合物的两种异构体形式的化学式的另一种表示。 图5示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的化合物1的核磁共振(NMR)波谱学谱图。 图6示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的化合物3的NMR波谱学谱图。 图7示出从京尼平与甘氨酸的反应中分离的S31、S32、S33和S34级（来源于S3级分）的 NMR谱图。 图8是具有式4的聚合物结构的示意图。 图9示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的不溶性部分的NMR谱图。 图10示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的聚合物的1H-13C固态NMR谱图。 图11示出了通过选择性分子量过滤从京尼平与甘氨酸的反应中分离的聚合物得到的 质谱图。 图12示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的聚合物的红外图谱。 图13A-D示出了四个样品(A、B、C和D)的高效液相色谱(HPLC)迹线，所述样品包含来自 美洲格尼帕树汁与甘氨酸的反应的蓝色聚合物。A)粉线240nm，吸光度较低的蓝线590nm;B) 在240nm和590nm处的吸光度几乎相等;C)在590nm处的吸光度较大；以及D)具有载体的生料 (raw batch)〇 图14A-F分别示出了蓝色聚合物参考标准溶液的校正曲线1至6。 图15示出了样品PF、FC和PC(参见实施例10中关于PF、FC和PC的定义）的HPLC谱图和UV 吸收。 图16示出了样品PF、FC和PC的颜色参数。 图17示出了从XAD-7树脂中洗脱的聚合物部分和水性部分的HPLC谱图。 图18示出了美洲格尼帕树汁与不同氨基酸的反应产物的紫外可见吸收光谱。 图19A-C示出了美洲格尼帕树汁与不同氨基酸的反应产物的HPLC分析(根据氨基酸来 分类）。图19A-C示出了对于每种氨基酸，（19A)甘氨酸、赖氨酸和缬氨酸；（19B)甲硫氨酸和 脯氨酸；以及(19C)酪氨酸和色氨酸的以下内容:使用实施例6的方法，美洲格尼帕树汁与氨 基酸的反应产物的HPLC谱图；鉴别出聚合物的HPLC区域的放大图；以及所选择信号的紫外 可见光谱。 图20示出了在254nm处的UV照射下在pH为3.0的缓冲溶液中不同氨基酸与美洲格尼帕 树汁的反应产物的稳定性（以半衰期表示）。 图21A示出了新鲜美洲格尼帕树果实的中果皮的水性提取物的HPLC图谱，所述HPLC图 谱具有保留时间为19分钟至20分钟的峰，接近京尼平的保留时间（22分钟至23分钟），并且 最大吸收波长在240nm处。 图21B示出了美洲格尼帕树果实的中果皮(果皮）的水性提取物的HPLC图谱，所述美洲 格尼帕树果实的年龄与图21A中的相同，但在提取前于室温下放置三天。所述图谱具有保留 时间为19分钟至20分钟和22分钟至23分钟的峰。 图22示出了从美洲格尼帕树果实的中果皮(果皮)的水性提取物与甘氨酸中得到的紫 色产物的1H NMR。 图23示出了从使美洲格尼帕树果实的中果皮(果皮）的经预热水性提取物与甘氨酸反 应的方法中得到的蓝色产物的1H NMR。 图24示出了囊果皮(外果皮）、内果皮(果肉）和中果皮(果皮)被标记的美洲格尼帕树 (哈瓜)的未熟果实。 图25Α-Β示出了京尼平（25Α)和在中果皮中发现的前驱体(25Β)在CD3OD(水抑制）中的 咕NMR图谱。 图26A-B示出了中果皮水提取物(26A)和水提取物的乙酸乙酯溶剂区（26B)的HPLC图谱 (240nm)。 图27示出了中果皮水提取物的HPLC图谱(240nm)，所述中果皮来自在收获后的数天期 间保持在室温条件下的哈瓜果实。 图28示出了中果皮的水提取物的咕匪R实验，场区被放大以示出预计醛峰所在的区 域。 图29示出了在哈瓜中果皮中发现的京尼平前驱体的13C NMR谱图。 图30示出了京尼平（1)和京尼平苷(2)的化学结构。 图31示出了通过以下得到的色谱图:Me-Gly:美洲格尼帕树汁与甘氨酸和甲硫氨酸同 时反应；1+2:甲硫氨酸与美洲格尼帕树汁反应后与甘氨酸反应；以及RN:美洲格尼帕树汁与 单独的甘氨酸反应。 发明详述 定义 如本文所使用的术语"聚合物"意指通过聚合形成并且基本上由重复的结构单元组成 的化学化合物或所述化合物的混合物。 本文中经纯化的聚合物可以理解为具有特定分子结构和固定数目的重复结构单元的 经纯化的单一化学化合物。经纯化的聚合物也可以理解为在聚合反应中形成的具有多个聚 合度(即，重复结构单元的数目可以不同）的聚合化合物的混合物。 方案1示出了反应物1 (例如京尼平，R1=Me)和反应物2(例如甘氨酸，R3 = COOH，R2和V 2为H)的示例性聚合反应。来自方案1中所述反应的经纯化的聚合物于是可以是单个聚合物 分子(式4的单个聚合物分子意指式中的?^?^Α和η是固定的）的某一纯度(例如，包含按重 量计大于75%、80%、85%、90%或95%的聚合物）的经分离聚合物组合物。来自方案1中所 述反应的经纯化的聚合物也可以是聚合化合物的混合物的某一纯度(例如，包含按重量计 大于75%、80%、85%、90%或95%的聚合物）的经分离聚合物组合物，所述聚合化合物在反 应混合物中形成，其具有相同的重复结构单元但是具有不同的聚合度(例如，在式4中，聚合 化合物具有相同的Α值，但具有不同的η值）。
在某些实施方案中，本文中的聚合物通过分子式(例如，式4、其几何异构体、其互变异 构体或其盐)来表征。如本文所使用的的术语"式4的聚合物"是指具有根据式4或其几何异 构体、其互变异构体或其盐的结构的一种或更多种聚合物。在某些实施方案中，本文中的聚 合物通过物理数据(例如，谱图数据、分子量分布)来表征。用于表征聚合物的方法是本领域 已知的。例如，聚合物可以通过谱学方法(例如IR、紫外/可见、匪R、MS等)表征;并且可以分 析聚合物的分子量以获得数均分子量(Μη)和/或重均分子量(Mw)。 如本文所使用的术语几何异构体意指除了在双键处具有不同构型（即，E异构体或Z异 构体，或顺式/反式异构体)之外结构相同的异构体。为了说明，方案2示出了一对的两个几 何异构体的实例，其中两个异构体之间的唯一区别在于双键处的构型。
如本文所使用的术语互变异构体(tautomer)或互变异构体(tautomeric i somer)意指 可以通过互变异构化互相转化的化合物。互变异构化是本领域已知的，并且通常是指如方 案3A中所示的反应。在大多数情况下，反应中的G基团为氢。
互变异构体的另一个实例示于方案3B。方案3B不应被理解为示出了所有可能互变异构 体结构。
方案2、3A和3B中使用的的箭头是用于说明的目的，而不应被理解为异构体或互变异构 体之间的真实平衡。 除非另有说明，否则如本文所使用的术语"盐"应理解为包括内盐或外盐二者。外盐的 实例包括具有阳离子作为平衡离子的盐，所述阳离子为例如碱金属离子(例如，Na+、K+等）； 碱土金属离子(例如，Mg2+、Ca2+等）；铵离子(例如，NH4+或有机铵离子)等。外盐的实例还包括 具有阴离子作为平衡离子的盐，所述阴离子为例如无机阴离子(例如，Cr、S042'Br'HS(V 等)或有机阴离子(例如，羧酸阴离子，例如甲酸根、乙酸根等）。 如本文所使用的1号化合物、2号化合物和3号化合物是指如实施例部分中所述的从京 尼平和甘氨酸的反应中分离的化合物。 如本文所使用的二聚物或二聚化合物意指基本上由两种单体组成的化合物。二聚物的 实例包括1号化合物、2号化合物和3号化合物，以及式14、18、2、34、38、2/、3^、3/8、3 /八 (Me)、3l(Me)、6、7和8的化合物。 如本文所使用的"基本上不含"化合物(例如，第一附加化合物、第二附加化合物或其组 合)意指所述化合物的总重量小于参照物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构 体或其盐）的5重量％。在一些实施方案中，"基本上不含"化合物意指所述化合物的总重量 小于参照物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)的4.5重量％、小于4 重量％、小于3重量％、小于2重量％、小于1重量％、小于0.5重量％、小于0.1重量％或小于0.01重量％。在一些实施方案中，"基本上不含"化合物的组合物(例如，着色剂组合物)意指 所述组合物不含所述化合物。在一些实施方案中，"基本上不含"化合物意指所述化合物的 总重量为参照物(例如式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)的0.01重量％至 5重量％、〇.〇1重量％至4.5重量％、0.01重量％至4重量％、0.01重量％至3重量％、0.01重 量％至2重量％、0.01重量％至1重量％、0.01重量％至0.5%或0.01重量％至0.1重量％。 如本文所使用的术语"基本上经纯化的"或基本上纯的化合物(例如，基本上经纯化的 聚合物、基本上经纯化的二聚物)是指纯度大于80% (例如，按重量计（例如干重，即不计算 挥发性组分如溶剂(例如，水、CH3CN、MeOH、EtOH等））大于80%、85%、90%、95%或99%)的 化合物。在一些实施方案中，基本上纯的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐 包含按干重计大于80 %、85 %、90 %、95 %或99%的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或 其盐。 本文所使用的术语经纯化的京尼平是指包含按重量计大于80 %、85%、90 %、95 %或 99%的京尼平的物质。同样地，本文所使用的术语经纯化的甘氨酸是指包含按重量计大于 80%、85%、90%、95%或99%甘氨酸的物质。 本公开内容的着色剂的纯度可以通过已知的分析方法(例如，高效液相色谱(HPLC)分 析)来测量。因此，样品中化合物(例如，二聚物、聚合物）的量化可以通过使用HPLC方法(例 如与实施例部分中所述的方法类似)来实现。 包含二聚物的着色剂组合物 本发明提供了着色剂复合物及其分子结构式，以及来源于美洲格尼帕树京尼平与甘氨 酸的反应的着色剂复合物的分离方法。在一些实施方案中，化合物是通过用色谱对反应所 得材料进行多重分级得到的。在一些实施方案中，分子结构式由1Η核磁共振谱(?匪R)、J- 调制(JMOD)、H-H相关谱(实验及其他分子结构工具分析而确定。 在一些实施方案中，式3Α的着色剂复合物(在本申请中，式3Α是呈优选同分异构形式的 3号化合物）：
在另一个实施方案中，着色剂复合物具有式3Β的同分异构形式(在本申请中，式3Β是呈 同分异构形式的3号化合物）：
某些实施方案涉及分离式3Α的着色剂复合物的方法：
其中所述方法包括： A. 从美洲格尼帕树汁中分离京尼平； B. 使甘氨酸与所述京尼平反应以获得可溶于甲醇的材料； C. 通过色谱法将可溶于甲醇的材料分离成SI、S2、S3和S4级分； D. 再通过色谱法将S3级分分离成531、532、533和534级分。通过反相色谱法从533级分 中分离式I的化合物。 一个不太优选的实施方案涉及分离具有式3B的同分异构形式的化合物的方法：
所述方法包括： A. 从美洲格尼帕树汁中分离京尼平； B. 使甘氨酸与所述京尼平反应以获得可溶于甲醇的材料； C. 通过色谱法将可溶于甲醇的