一种生物材料及非侵入近红外激光辅助3D打印方法与流程

本发明属于3d生物打印技术领域，具体涉及到一种生物材料及非侵入近红外激光辅助数字光处理在体3d打印方法。

背景技术：

自二十世纪五十年代以来，器官移植已经拯救了成百上千万的患有绝症的病人，但是目前对可移植器官的需求量远远超过了器官捐献量。因此迫切需要一种技术以满足日益增长的亟待接受器官移植的病人，另外器官移植也有免疫反应和器官排斥所固有的缺陷。3d生物打印技术(源自增材制造)在过去的10年中取得了显著进步。作为一种组织工程策略中，在再生医学中，切实可用且有广泛的应用前景。3d生物打印技术在制造组织结构修复或替换损伤或病变的组织和器官。多数3d打印的组织或器官在手术移植前需要在体外生物反应器中培养成熟。3d生物打印制造组织器官的三种方法有仿生、自动自组装和微组织构筑模块。常见的3d生物打印系统有激光直写技术、喷墨挤出和细胞静电纺丝。其中，激光直写技术通常指的是自由形态制造或快速成型，可通过控制制备参数，适用于制造3d支架。该技术主要是利用光紫外光制造微米和纳米级3d生物结构，但是通常紫外激光的使用对细胞有负面影响。

由于普通的激光直写技术使用的紫外光的穿透能力弱，且对组织细胞有较强的杀伤能力，因此紫外光辅助的3d打印技术无法实现在体打印。然而长波长的近红外(nir)光有较深的组织穿透能力并且对正常细胞损害较少，且因上转换纳米粒能吸收长波长的近红外光并且转换成具有更高能量的uv、可见光和nir，广泛地应用于彩色显示器、生物成像和多电子设备等领域。该激发光可用于在此波长范围内有特定吸收的光引发剂产生自由基进而引发低聚物或聚合物单体进行链式聚合反应形成高度交联的网状结构聚合物如水凝胶。利用近红外光较好的组织穿透能力的优势，本发明利用基于上转换纳米材料的复合物为新型的光引发剂，为在体3d打印提供了一项新的手段和技术。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供一种新型的生物材料及近红外激光辅助数字光处理在体3d打印技术，旨在实现体内3d生物打印组织或器官提供新策略和新技术。该项技术与传统的3d打印可移植组织或器官的优势在于一方面不需要繁琐的外科手术植入的方式，只需要将生物材料与细胞注射到体内的指定部位即可实现体内制造组织或器官，另一方面无需体外生物反应器，所制造的组织或器官可利用人体作为一种天然的生物反应器培养成熟而发挥其功能。

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种生物材料。该生物材料可注入生物体内，采用近红外激光辅助数字光处理在体3d打印，从而实现体内打印技术。

本发明的生物材料，由光敏聚合物单体和基于上转化纳米材料的光引发剂复合物组成。

具体的，上述生物材料，由光敏聚合物单体水溶液和基于上转化纳米材料的光引发剂复合物水溶液混合而成。

优选的，上述生物材料，所述混合而成的溶液中光敏聚合物单体浓度为5～50％。所述混合而成的溶液中基于上转化纳米材料的光引发剂复合物浓度为0.1～10％。所述的光敏聚合物单体浓度为5～50％表示每100μl混合溶液中含有5～50mg光敏聚合物单体。所述的光引发剂复合物浓度为0.1～10％表示每100μl混合溶液中含有1～10mg光引发剂复合物。

具体的，上述生物材料，所述光敏聚合物单体选自甲基丙烯酰化的透明质酸、甲基丙烯酰化的明胶、甲基丙烯酰化的聚乙二醇、甲基丙烯酰化壳聚糖、甲基丙烯酰化白蛋白、甲基丙烯化海藻酸或甲基丙烯化葡聚糖中至少一种。

具体的，上述生物材料，所述基于上转化纳米材料的光引发剂复合物由掺杂的上转换纳米材料和光引发剂组成，所述掺杂为掺有tm³⁺和yb³⁺。

优选的，上述生物材料，所述掺杂的上转换纳米材料还掺杂有er³⁺、pr³⁺、sm³⁺、tb³⁺、gd³⁺、ho³⁺、nd³⁺、dy³⁺中的至少一种。

优选的，上述生物材料，所述掺杂的上转换纳米材料中er³⁺、pr³⁺、sm³⁺、tb³⁺、gd³⁺、ho³⁺、nd³⁺、dy³⁺中的至少一种的摩尔含量为0.01～5％。总量为阳离子摩尔总量。当上转化材料为氧化物或氟化物时，例如为gd2o3、lu2o3、caf2、laf3、znf2、y2o3或yf3时，所述阳离子摩尔总量为化合物中的阳离子和掺杂的阳离子的摩尔总量；当上转换材料为gdyf4、nayf4、liyf4、kyf4、baf2、bayf5或ba2yf7时，所述的阳离子摩尔总量为化合物中的y离子和掺杂的阳离子的摩尔总量。

优选的，上述生物材料，所述掺杂的上转换纳米材料中yb³⁺的摩尔含量为5～40％，tm³⁺的摩尔含量为0.01～3％。总量为阳离子摩尔总量。当上转化材料为氧化物或氟化物时，例如为gd2o3、lu2o3、caf2、laf3、znf2、y2o3或yf3时，所述阳离子摩尔总量为化合物中的阳离子和掺杂的阳离子的摩尔总量；当上转换材料为gdyf4、nayf4、liyf4、kyf4、baf2、bayf5或ba2yf7时，所述的阳离子摩尔总量为化合物中的y离子和掺杂的阳离子的摩尔总量。

进一步的，上述生物材料，所述掺杂的上转换纳米材料中yb³⁺的摩尔含量为20～40％，tm³⁺的摩尔含量为0.1～1.5％。

进一步的，上述生物材料中，所述掺杂的上转化纳米材料外部还有一层保护层。所述保护层为nayf4或nagdf4。所述保护层能够降低上转化纳米材料表面的配体、溶剂或不纯物质引起的发光淬灭，提高纳米材料的发光强度。

再进一步的，上述生物材料中，所述掺杂的上转化纳米材料中的阳离子摩尔总量与保护层中的阳离子摩尔比为10︰1～1︰10。优选为2︰1～1︰2。例如nayf4掺杂yb³⁺，tm³⁺时，保护层为nayf4时，则核中y³⁺、yb³⁺、tm³⁺摩尔总量与保护层的阳离子y³⁺的摩尔比为10︰1～1︰10。优选为2︰1～1︰2。例如nayf4掺杂yb³⁺，tm³⁺时，保护层为nagdf4时，则核中y³⁺、yb³⁺、tm³⁺摩尔总量与保护层的阳离子gd³⁺的摩尔比为10︰1～1︰10。优选为2︰1～1︰2。

优选的，上述生物材料中，掺杂的上转换纳米材料与光引发剂的质量比为10︰1～1︰10。

进一步的，上述生物材料中，掺杂的上转换纳米材料与光引发剂的质量比为2︰1～1︰2。

具体的，上述生物材料中，所述上转换纳米材料为gd2o3、gdyf4、lu2o3、caf2、laf3、znf2、y2o3、yf3、nayf4、liyf4、kyf4、baf2、bayf5或ba2yf7中至少一种。

具体的，上述生物材料中，所述光引发剂为苯偶姻及衍生物、苯偶酰类化合物、烷基苯酮类化合物、酰基磷氧化物、二苯甲酮类化合物或硫杂蒽酮类化合物中至少一种。

优选的，上述生物材料中，所述苯偶姻及衍生物为安息香、安息香双甲醚、安息香乙醚、安息香异丙醚或安息香丁醚中至少一种。

优选的，上述生物材料中，所述苯偶酰类化合物为二苯基乙酮或α，α-二甲氧基-α-苯基苯乙酮。

优选的，上述生物材料中，所述烷基苯酮类化合物为α，α-二乙氧基苯乙酮、α-羟乙基苯酮或α-胺乙基苯酮中至少一种。

优选的，上述生物材料中，所述酰基磷氧化物为2,4,6-三甲基苯甲酰基二苯基氧化膦或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐。

优选的，上述生物材料中，所述二苯甲酮类化合物为二苯甲酮、2,4-二羟基二苯甲酮、米蚩酮或2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮中至少一种。

优选的，上述生物材料中，所述硫杂蒽酮类化合物为硫代丙氧基硫杂蒽酮或异丙基硫杂蒽酮。

本发明还提供了一种含有细胞的生物材料，其是由上述生物材料中添加细胞而成。所述细胞的量为每1ml生物材料中有细胞1×10⁵～1×10⁸个。所述的细胞为根据生物体部位，来添加与其相同或匹配的细胞组织。

本发明还提供了用于非侵入的近红外激光辅助基于dlp原理的在体3d打印方法，包括如下步骤：

a、在计算机上建立待打印样品的数字模型；

b、将生物材料或含有细胞的生物材料注射到生物体的指定部位，置于打印机内部的平台上；

c、近红外激光通过由无数个小镜片阵列组成的数字微镜元件dmd在一定的曝光时间范围内投影到步骤b中所述的指定部位进行打印即可。

优选的，上述打印方法步骤c中，所述近红外激光的最大发射波长为980nm，曝光时间范围为1～60s。

本发明中，将上转换纳米材料进行掺杂，得到掺杂的上转换纳米材料，将掺杂的上转换纳米材料分散在溶剂中形成均一纳米材料溶液；光引发剂溶解在溶剂中，滴加掺杂的上转换纳米材料溶液，搅拌充分反应，离心、洗涤得固体，即为基于上转化纳米材料的光引发剂复合物。所述温度为0～200℃。优选为室温。所述溶剂为环己烷、正己烷、正戊烷、二氯甲烷、氯仿、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或水中至少一种。或者将掺杂的上转换纳米材料和光引发剂简单地混合均匀，也即得到基于上转化纳米材料的光引发剂复合物。

本发明中，掺杂的上转换纳米材料制备方法，包括以下步骤：稀土元素氯化物(y，yb，tm)，按照一定的摩尔浓度与油酸和1-十八烯混合，加热形成均一的油酸混合物溶液，随后加入氟化铵和氢氧化钠的甲醇溶液制成前驱体，随后在高温加热的条件下通过奥斯特瓦尔德熟化即得nayf4:tm,yb上转换纳米材料，后处理酸化除去油酸即可。

进一步的，采用上述类似的方法下形成核壳结构纳米粒子nayf4:tm,yb@nayf4，即nayf4:tm,yb的纳米粒外围由nayf4保护层包裹，然后酸化除去油酸制备得到带有正电且水溶性的带有nayf4核壳的nayf4:tm,yb上转换纳米材料。

本发明的有益效果是：本发明上转换材料中所掺杂的yb³⁺能够吸收有较深组织穿透能力并且对正常细胞损害较少980nm的光而激发tm³⁺释放出345nm和361nm波长的紫外光，上转换纳米粒能够吸收进而被吸附在纳米粒表面或分布在其周围的光引发剂所吸收形成自由基，从而可用于激光直写技术3d生物打印，在体3d打印研究领域有潜在的应用价值。打印过程中依次包括近红外光激发光引发剂复合物中的上转换纳米粒发射紫外光，被所述复合物中的引发剂吸收紫外光形成自由基，进而引发光敏聚合物单体聚合而固化成型。

附图说明

图1为本发明的一种非侵入的近红外激光辅助数字光处理在体3d打印技术示意图。首先在计算机上建立待打印样品的数字模型，由无数个小镜片阵列组成的数字微镜元件dmd投影到载有生物材料和细胞的小鼠体内，生物材料中的上转换纳米材料的光引发剂复合物被引发形成自由基，进而引发聚合物单体聚合形成水凝胶，所混合的细胞镶嵌在聚合物水凝胶的网络中。

图2为利用本发明技术在裸鼠体内打印成型

具体实施方式

本发明的生物材料，由光敏聚合物单体和基于上转化纳米材料的光引发剂复合物组成。

具体的，上述生物材料，由光敏聚合物单体水溶液和基于上转化纳米材料的光引发剂复合物水溶液混合而成。

进一步的，所述混合而成的溶液中光敏聚合物单体浓度为5～50％。所述混合而成的溶液中基于上转化纳米材料的光引发剂复合物浓度为0.1～10％。所述的光敏聚合物单体浓度为5～50％表示每100μl混合溶液中含有5～50mg光敏聚合物单体。所述的光引发剂复合物浓度为0.1～10％表示每100μl混合溶液中含有1～10mg光引发剂复合物。

具体的，所述光敏聚合物单体选自甲基丙烯酰化的透明质酸、甲基丙烯酰化的明胶、甲基丙烯酰化的聚乙二醇、甲基丙烯酰化壳聚糖、甲基丙烯酰化白蛋白、甲基丙烯化海藻酸或甲基丙烯化葡聚糖中至少一种。

具体的，所述基于上转换材料的光引发剂复合物由掺杂的上转换纳米材料和光引发剂组成，所述掺杂为掺有tm³⁺和yb³⁺；其中tm³⁺作为激化剂，yb³⁺作为敏化剂。

进一步的，所述掺杂的上转换纳米材还掺杂er³⁺、pr³⁺、sm³⁺、tb³⁺、gd³⁺、ho³⁺、nd³⁺、dy³⁺中的至少一种，其作为激发剂掺杂到上转换纳米材料中。

进一步的，当光引发剂加入过多时，则掺杂的上转换纳米材料则相对较少，则激发出的光较弱，不足以使光引发剂充分分解释放自由基，从而使聚合物单体光聚合反应较慢，影响固化成型。所以优选掺杂的上转换纳米材料与光引发剂的质量比为10︰1～1︰10。更优选2︰1～1︰2。

所述基于上转换材料的光引发剂复合物中，所述上转换纳米材料经表面修饰后带电荷，再与带相反电荷的光引发剂可通过静电作用吸附在粒子的表面形成复合物；如光引发剂不带电荷，分散在掺杂的上转换纳米材料的周围。

本发明中，采用常规方法对上转换纳米材料进行掺杂，得到掺杂的上转换纳米材料；采用常规方法制备光引发剂。例如：

本发明中，掺杂的上转换纳米材料制备方法，包括以下步骤：稀土元素氯化物(y，yb，tm)，按照一定的摩尔浓度与油酸和1-十八烯混合，加热形成均一的油酸混合物溶液，随后加入氟化铵和氢氧化钠的甲醇溶液制成前驱体，随后在高温加热的条件下通过奥斯特瓦尔德熟化即得nayf4:tm,yb上转换纳米材料，后处理酸化除去油酸即可。

进一步的，采用上述类似的方法下形成核壳结构纳米粒子nayf4:tm,yb@nayf4，即nayf4:tm,yb的纳米粒外围由nayf4保护层包裹，然后酸化除去油酸制备得到带有正电且水溶性的带有nayf4核壳的nayf4:tm,yb上转换纳米材料。

本发明中，光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐制备方法如下：二甲基苯基膦酸盐和2,4,6-三甲基苯甲酰氯混合发生米歇尔-阿尔布佐夫反应得到苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸甲酯，加入溴化锂的丁酮溶液制备得到带有负电的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐。

实施例1

1.nayf4:tm,yb上转换纳米材料的合成，即掺杂的上转换纳米材料的合成

100ml的圆底烧瓶中加入氯化钇(108.3mg，0.556mmol)，氯化镱(67.0mg，0.24mmol)和氯化铥(1.1mg，0.004mmol)并加入6ml油酸和14ml十八烯，真空条件下缓慢升温至140℃并维持30min直至形成透明的溶液，然后氮气保护下降温至50℃，缓慢加入氟化铵(118.4mg，3.2mmol)和氢氧化钠(80mg，2mmol)的甲醇溶液10ml并于50℃下搅拌30min，升至70℃减压除去甲醇，随后快速升温至300℃并维持1.5h，降至室温后加入10ml乙醇沉淀，6500rpm离心5min收集沉淀，弃上清，加入2ml环己烷再分散，再加入18ml乙醇沉淀，6000rpm离心3min收集沉淀，如此重复洗涤三次，最终产物分散在4ml环己烷中。

2.nayf4:tm,yb@nayf4核壳结构上转换纳米材料的合成，即带核壳的掺杂的上转换纳米材料的合成

50ml的圆底烧瓶中加入氯化钇(78mg，0.4mmol)，并加入3ml油酸和7ml十八烯，真空条件下缓慢升温至140℃并维持30min直至形成透明的溶液，然后氮气保护下降温至50℃，加入2ml新制的nayf4:tm,yb，缓慢加入氟化铵(59.2mg，1.6mmol)和氢氧化钠(40mg，1mmol)的甲醇溶液5ml并于50℃下搅拌30min，升至70℃减压除去甲醇和环己烷，随后快速升温至300℃并维持1.5h，降至室温后加入10ml乙醇沉淀，6500rpm离心5min收集沉淀，弃上清，加入2ml环己烷再分散，再加入18ml乙醇沉淀，6000rpm离心3min收集沉淀，如此重复洗涤三次，最终产物分散在4ml环己烷中。

3.后处理除油酸，即得无油酸包裹的nayf4:tm,yb@nayf4

油酸包裹的ucnps与0.1n盐酸溶液混合，45℃超声1h，反应过程中ucnps表面的油酸配体被质子化产生油酸，然后高速离心，弃上清，加入乙醇洗涤，高速离心，如此重复三次，最终无油酸包裹的纳米粒子分散在去离子水中。

4.苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐的合成

于室温下氮气的保护条件下，250ml的圆底烧瓶中加入2,4,6-三甲基苯甲酰氯(3.2g,18mmol)，逐滴加入二甲基苯基膦酸盐(3.0g，18mol)，室温下搅拌18h。把反应液加热到50℃，加入100ml溴化锂(6.1g，72mmol)的丁酮溶液，10min后可以得到白色沉淀，冷却到室温后静置4h，过滤，用丁酮洗涤3次，清除未反应完全的溴化锂。收集白色固体，抽干。

5.基于上转换纳米材料的光引发剂复合物的制备

一定量的无油酸包裹的nayf4:tm,yb@nayf4分散在水中，搅拌条件下苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂盐的水溶液，室温下搅拌过夜，离心收集固体得上转换材料光引发剂复合物。

6.体内打印

a、在计算机上建立待打印样品的数字模型如矩形；

b、8周左右的裸鼠腹腔注射60μl10％水合氯醛水溶液进行麻醉，然后将20μl含有25％聚乙二醇二丙烯酸酯pegda(购自sigma)、2.5％基于上转换纳米材料的光引发剂复合物和5×10⁵个细胞的混合溶液注射到小鼠皮下，然后置于打印机内部的平台上；

c、980nm近红外激光通过由无数个小镜片阵列组成的数字微镜元件dmd投影到步骤b中所述的指定部位15s；

d、解剖观察并拍照。