基于快速扫描光程的受激拉曼光谱成像系统的制作方法

本发明属于非线性光学成像技术领域，具体涉及一种改进型的受激拉曼光谱成像系统，即可以实现快速受激拉曼光谱采集，又能同时针对多个拉曼振动峰进行同时成像的系统。

背景技术：

受激拉曼成像技术是一种新兴的非性线光学成像手段，凭借着其信号强度高、无光谱失真、信号强度与被测物浓度成线性关系等诸多优点，近年来受激拉曼成像技术得到了迅猛发展，并在生物医学检测与成像，生物化学分析等领域广泛应用。

受激拉曼散射是拉曼散射与受激辐射技术的有机结合，它需要两束频率不同的高能量密度的脉冲激光同时作用在样品上。这两束激光分别被称作泵浦光和斯托克斯光，它们的频率差要与被测物的自发拉曼峰相对应。因此，受激拉曼成像系统的每单次扫描只能针对一个拉曼振动频率进行成像，即单色成像。如果需要针对另外一个拉曼振动频率进行成像就需要改变泵浦光或斯托克斯光的波长。一直以来，这个不足之处严重阻碍了受激拉曼成像技术的应用。近些年来，已有多个研究小组提出了可以实现多色受激拉曼成像的解决方案。纵观这些方法，都不同程度地增加了实验设备的数量、系统光路变的复杂性，以及实验数据处理的繁琐程度。相对而言，基于光谱聚焦法的受激拉曼光谱成像技术操作简便，易于实现，且成本低廉。在受激拉曼光谱成像技术系统中，首先用高折射率的介质对泵浦光和斯托克斯光进行啁啾，把两束飞秒脉冲激光展宽皮秒脉冲激光，用光学延迟线，对泵浦光和斯托克斯光的相对时间延迟进行调节，就可以在一定范围内（一般为200cm^-1左右）连续改变它们之间的频率差，如此就可以实现多色受激拉曼成像了。但是，光学延迟线位置的调整，常规做法是靠机械平动的方式来移动反射镜的位置，速度较慢，无法实现实时探测两种或更多的拉曼振动频率。这对于需要双色或多色成像而又快速移动的被测物来说，多张针对不同拉曼峰的单色图在合并成一张多色图时势必会引入误差。并且，受激拉曼光谱的采集也受光学延迟线移动速度的限制，达不到快速测量光谱的效果。

本发明正是一种基于高光谱受激拉曼成像系统的多色受激拉曼成像系统，可同时对多个拉曼振动频率进行成像，并快速采集样品的受激拉曼光谱。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种同时探测多个拉曼振动频率的受激拉曼成像系统，并实现对样品受激拉曼光谱的快速采集。

本发明提出的受激拉曼光谱成像系统，是基于快速扫描光程技术的，即把光谱聚焦成像技术与快速扫描光程技术的有机结合，是改良型的受激拉曼光谱成像系统。如图1所示，系统包括：线偏振性良好且偏振方向一致的两束飞秒脉冲激光（即斯托克斯光和泵浦光），两块啁啾介质，电光调制器，快速改变光程单元（也称快速光程扫描单元），二相色镜，显微镜，短通滤色片，光电二极管，锁相放大器，计算机。其中，所述的两束飞秒激光作为系统光源，由高折射率的啁啾介质分别将它们啁啾；其中，斯托克斯光经电光调制器调制后经过快速改变光程单元，二相色镜将它和泵浦光重合，并一起导入到带有二维扫描振镜的显微镜；采用受激拉曼光损失的方式获取信号，通过样品的光经过短通滤色片过滤，然后由光电二极管将其转化为电信号，再输入到锁相放大器中；信号经锁相放大器解析后输送给计算机。

本发明中，所述快速改变光程单元，其结构如图2所示，由以下部件组成：两个D形反射镜，透射式光栅，透镜和一维振镜；透镜设置于透射式光栅和一维振镜中间，距离为一倍焦距；其光路为：入射光首先打在透射式光栅上，然后依次经过：透镜，一维振镜；返回至透镜，透射式光栅，第一D形反射镜；再反射至透射式光栅，透镜，一维振镜；再返回至透镜，透射式光栅，进入第二D形反射镜；最后被第二D形反射镜反射出来。

其中，快速扫描一维振镜就可以快速地连续或离散地得到不同的光程延迟，实现受激拉曼光谱采集和多色受激拉曼成像。光程延迟振镜的扫描频率可以达到1KHz，使得我们可以在每秒钟得到2000个受激拉曼光谱。对多个拉曼光谱进行平均处理，就能大大提高信噪比，提高探测灵敏度。

本发明系统中，确定的快速采集光谱和多色成像的限制条件为：被测的拉曼频移位置不超过泵浦光和斯托克斯光之间可以产生的频率差（本系统约为200cm^-1）。

本发明系统中，实现多色受激拉曼成像的过程为：使用同一台计算机结合一块高性能的数据采集卡来控制显微镜的扫描单元和产生光程延迟振镜的角度，并接收锁相放大器解析出的受激拉曼信号。显微镜的扫描单元的振镜的每一个运作都与光程延迟振镜的运作紧密配合，使成像时，每一条线扫描都对应光程延迟振镜的一个角度（也即对应了一个特定的拉曼频移位置）。把光程延迟振镜不同的角度时采集到的数据分别对应分配到不同的成像通道，再把这多个通道的单色图像进行合并就实现了多色的受激拉曼成像。

本发明巧妙地把光谱聚焦法和快速改变光程的方法结合起来，光路设计简单，改进成本低，易于操作，系统工作稳定。由于它能够极快地产生光谱聚焦法所需要的光程延迟，所以可以快速采集样品的受激拉曼光谱，对多次采集到的光谱进行平均可以大大提高信噪比，从而提高检测灵敏度；实时检测多种成分的目标物；当被测样品中的两种目标物的拉曼光谱有重叠时（比如脂质和蛋白质），消除样品的移动所带来的光谱误差。该系统可以快速实现受激拉曼光谱采集，又能同时针对多个拉曼振动峰进行同时成像。

附图说明

图1为多色受激拉曼成像系统示意图。

图2为多色受激拉曼成像系统中快速改变光程单元的示意图。

图3为二甲基亚砜（DMSO）的自发拉曼光谱和受激拉曼光谱。其中，A为DMSO的自发拉曼光谱，B为DMSO的受激拉曼光谱，C为快速扫描模式下得到的不同浓度的DMSO水溶液的受激拉曼光谱。

图4为水稻花粉的彩色图像以及不同扫描模式下的海拉细胞图像。其中，A为一颗水稻花粉粒的不同化学组分分布图，B和C分别为逐帧成像模式和多色成像模式下得到的海拉细胞图。

具体实施方式

搭建与测试双色受激拉曼成像系统的步骤如下：

（1）光路搭建。

如图1所示，本发明所提出的多色受激拉曼成像系统建立在高光谱受激拉曼成像系统的基础上。将均为线偏振光的泵浦光和斯托克斯光的脉冲分别用啁啾介质在时间上展宽。斯托克斯光被电光调制器以特定的调制频率进行调制后经过快速改变光程单元。最后通过一个二向色镜与泵浦光合并在一起被导入显微镜。两束激光在样品上发生相互作用后，被一个短通滤光片过滤，仅剩的泵浦光的强度被光电二极管检测得到后送入锁相放大器进行解析；锁相放大器的解析频率与电光调制器的调制频率需严格一致。

快速改变光程单元的光路如图2所示，入射的光束依次经过或遇到：光栅，透镜，振镜，透镜，光栅，D形反射镜1，光栅，透镜，振镜，透镜，光栅，D形反射镜2；被D形反射镜2反射的光束即为出射光。为了让光束按照上述的路径传输，需要合理而精细地调整各个光学元件的位置和摆放角度。

（2）Labview软件程序的编写。

上步骤中搭建好的光路需要计算机通过一个高性能的数据采集卡来进行控制光程延迟振镜的角度并在恰当的时刻采集数据。实现多色受激拉曼成像的过程为（以3色成像为例）：使用同一台计算机来控制显微镜的扫描单元，控制产生光程延迟振镜的角度，以及接收锁相放大器解析出的受激拉曼信号。使显微镜的扫描单元对成像区域的每条线扫描都进行3次，在每个单次线扫描时，光程延迟振镜分别固定在一个特定的角度以对应被探测的拉曼峰；在每次线扫描结束时，光程延迟振镜会在负责成像线扫描的振镜复位的时间内快速切换到下一个目标拉曼峰所需要的角度。与此同时，分别记录下成像振镜每条线扫描时所采集到的受激拉曼信号，并把这些线扫描的数据依次循环往复地分配给3个成像通道就可以得到三幅单色的受激拉曼图像，把三张单色图合并在一起即可得到三色图。多色成像方法与此类似。

（3）系统测试。

图3（A）和（B）给出了DMSO 在大概2850cm^-1到3050 cm^-1范围内的自发拉曼光谱和受激拉曼光谱。其中的受激拉曼光谱是通过我们系统中的光程延迟振镜的扫描而得出的。可以看出，我们得到的DMSO的受激拉曼光谱与其自发拉曼光谱是高度吻合的。接下来，我们利用对光谱进行多次平均方法，对不同浓度的DMSO水溶液的受激拉曼光谱进行了采集。如图3（C）所示，在浓度为1mM的DMSO水溶液中依然清晰可见地检测到了它在2910 cm^-1附近的特征拉曼峰（背景已被去除）；获取这个光谱所需要的时间还不到30秒。

图4（A）给出了一个某特定发育时期的花粉粒的三色受激拉曼图像，图中三种不同的颜色（实际上为红，绿，蓝）分别代表了脂质，淀粉和蛋白质三种化学组分。这张三色图像验证了本发明系统的多色同时成像功能。另外，在活体样品内部会存在局部物体或物质的不确定地运动，这样以来，在高光谱受激拉曼成像技术的逐帧扫描的模式下得到的图像在合成为多色图像时就会引入人为的误差。图4（B）和（C）是本发明用不同成像模式得到的活体海拉细胞图像，图中的两种颜色（实际上红色和洋红色）分别代表了脂质和蛋白质两个化学成分。图4（B）中的箭头标示出了由于细胞脂滴的漂移而引入的误差，这是在逐帧扫描的模式下难以克服的一个缺点。然而在对应的图4（C）中，在本发明采用的准实时多色成像模式下，就避免了由于活细胞内各种成分的运动带来的图像误差。