金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒的制作方法

本发明涉及以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术：

各种精确的蛋白质定量方法对许多基础研究抑或是某些前沿领域的科学研究都是不可或缺的。蛋白质定量涉及了细胞生物学、生物化学、发育生物学、分子生物学、食品安全等领域的研究课题，不同的检测样品类型依据不同的条件选择相应的蛋白质定量方法。总蛋白定量分析的传统方法有：测量在280 nm 的紫外吸光值；二喹啉酸（BCA）和Bradford检测法；以及其他替代方法，例如Lowry 检测法等。然而，目前这些已知的方法都有其适用条件，并且都存在一定的缺点：它们既不是蛋白质特异的（存在干扰），也不是对所有的蛋白质都同样准确和兼容。因此，发展一种抗干扰能力强、定量准确快速的新方法仍具有一定的意义。

金纳米簇（gold nanoclusters, Au NCs）是一种新型的荧光纳米材料，其具有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、Stokes位移大、比表面积大、制备条件温和、表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点，其已被广泛应用于催化、传感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域。

本发明以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米簇作为荧光探针，基于蛋白质与金纳米团簇的特异性吸附作用，增强金纳米簇的荧光，用于总蛋白的检测，提供了一种简便、灵敏的总蛋白检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒。试剂盒中包括提供金纳米簇探针溶液（a液），牛血清白蛋白溶液（标准液）。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的一种金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒，其特征是试剂盒中有金纳米簇探针溶液和牛血清白蛋白溶液，所述的金纳米簇探针为6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米簇，金纳米簇探针溶液作为a液，牛血清白蛋白溶液为标准贮备液。

上述的金纳米簇探针由下述方法制备的：取含0.2 mol/L氢氧化钠，浓度为80 mmol/L的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶溶液与浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液按1:1比例混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化，冷冻干燥后得到6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米簇粉末。

所述的金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒，其特征是利用金纳米簇探针在535 nm处的荧光强度值以判断总蛋白含量，所使用的激发波长为472 nm。

所述的金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒，其特征是测定的线性范围为10~400 μg/mL，检测限为0.88 μg/ml。

本发明所述的一种金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒测定人血清总蛋白的方法，其特征是将牛血清白蛋白溶液作为标准贮备液用双蒸水稀释为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列标准溶液，在20 μL系列标准溶液中分别加入180 μL用双蒸水配制的盐酸调节pH为5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值，绘制总蛋白标准曲线或计算回归方程，取人血清样品，用双蒸水稀释50倍，在20 μL人血清稀释液中加入180 μL 用双蒸水配制的盐酸调节pH为5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值，根据标准曲线或回归方程进行定量，获得血清样品中的总蛋白含量。

本发明所述的一种金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒测定人血浆总蛋白的方法，其特征是将牛血清白蛋白溶液作为标准贮备液用双蒸水稀释为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列标准溶液，在20 μL系列标准溶液中分别加入180 μL用双蒸水配制的盐酸调节pH为5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值，绘制总蛋白标准曲线或计算回归方程，取人血浆样品，用双蒸水稀释50倍，在20 μL人血浆稀释液中加入180 μL 用双蒸水配制的盐酸调节pH为5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值，根据标准曲线或回归方程进行定量，获得血浆样品中的总蛋白含量。

本发明所述的一种金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒测定牛奶总蛋白的方法，其特征是将牛血清白蛋白溶液作为标准贮备液用双蒸水稀释为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列标准溶液，在20 μL系列标准溶液中分别加入180 μL用双蒸水配制的盐酸调节pH为5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值，绘制总蛋白标准曲线或计算回归方程，取牛奶样品，用双蒸水稀释10倍，在10 μL牛奶稀释液中加入10 μL浓度为10 mol/L的EDTA溶液和180 μL用双蒸水配制的盐酸调节pH为5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值，根据标准曲线或回归方程进行定量，获得牛奶样品中的总蛋白含量。

本发明所述的一种金纳米簇为探针的总蛋白荧光检测试剂盒测定细胞总蛋白的方法，其特征是将牛血清白蛋白溶液作为标准贮备液用双蒸水稀释为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列标准溶液，在20 μL系列标准溶液中分别加入180 μL用双蒸水配制的盐酸调节pH为5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值，绘制总蛋白标准曲线或计算回归方程，取细胞裂解样品，用双蒸水稀释6倍，在20 μL细胞裂解稀释液中加入180 μL用双蒸水配制的盐酸调节pH为5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值，根据标准曲线或回归方程进行定量，获得细胞样品中的总蛋白含量。

上述使用的金纳米簇探针由下述方法制备的：取含0.2 mol/L氢氧化钠，浓度为80 mmol/L的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶溶液与浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液按1:1比例混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化，冷冻干燥后得到6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米簇粉末。

为实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：

（一）金纳米簇探针的制备

以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米簇探针的制备如下：浓度为80 mmol/L的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶溶液（含0.2 mol/L氢氧化钠）与浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液按1:1比例混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化，冷冻干燥后得到金纳米簇探针粉末。

（二）总蛋白检测试剂盒：a液包括上述技术方案（一）制备后用双蒸水配制，盐酸调节pH=5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，标准贮备液包括浓度为4.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液。

（三）总蛋白的检测方法

将技术方案（二）的标准贮备液用双蒸水稀释为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列标准溶液，在20 μL系列标准溶液中加入180 μL技术方案（二）的a液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值（F₅₃₅），绘制总蛋白标准曲线或计算回归方程。在20 μL样品溶液中加入180 μL技术方案（二）的a液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值（F₅₃₅），根据标准曲线进行定量。

本发明的优点：

（1）本发明基于蛋白质与金纳米簇探针的特异性吸附作用，增强金纳米簇探针的荧光强度，用于总蛋白的检测。

（2）本发明使用的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶保护的金纳米簇探针其制备过程快速、简便，液相一步还原，不需要任何前修饰步骤。

（3）本发明所构建的试剂盒与检测方法特异性好、灵敏度高，金纳米团簇荧光强度与BSA浓度在10~400 μg/ml 范围内呈良好的线性关系，检测限低至0.88 μg/mL。

（4）本发明所构建的试剂盒和检测方法无需复杂的样品前处理过程即可用于人血清、人血浆、牛奶、细胞等的总蛋白检测。

附图说明

图1为蛋白质与金纳米簇探针作用后的荧光光谱图。

图2为总蛋白测定的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：

浓度为80 mmol/L的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶溶液（含0.2 mol/L氢氧化钠）与浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液按1:1比例混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化，冷冻干燥后得到金纳米簇探针粉末。

实施例2：

一种基于金纳米簇探针的总蛋白荧光检测试剂盒。试剂盒中包括提供金纳米簇探针溶液（a液）和牛血清白蛋白溶液（标准贮备液）。a液包括实施例1制备的金纳米簇探针粉末、用双蒸水配制，盐酸调节pH=5的浓度为0.5 mg/mL的金纳米簇探针溶液，标准贮备液为浓度为4.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液。

实施例3：

将实施例2的标准贮备液用双蒸水稀释为2.0 mg/mL的标准溶液，在20 μL浓度为2.0 mg/mL的标准溶液中分别加入180 μL实施例2的a液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定荧光光谱。如图1所示，最大荧光波长为535 nm。

实施例4：

将实施例2的标准贮备液用双蒸水稀释为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的系列标准溶液，在20 μL系列标准溶液中分别加入180 μL实施例2的a液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值（F₅₃₅），绘制总蛋白标准曲线或计算回归方程。如图2所示，随着蛋白质浓度的不断增大，荧光强度逐渐增强，测定的线性范围为10~400 μg/mL，回归方程相关系数为0.998，检测限为0.88 μg/ml。

实施例5：

将实施例2的标准贮备液用双蒸水稀释为2.0 mg/mL的标准溶液，在10份20 μL浓度为2.0 mg/mL的标准溶液中分别加入180 μL实施例2的a液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值（F₅₃₅），测定的标准偏差为2.3%，表明本方法重现性良好。

实施例6：

取人血清样品，用双蒸水稀释50倍，在20 μL人血清稀释液中加入180 μL实施例2的a液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值（F₅₃₅），根据实施例4标准曲线进行定量，获得血清样品中的总蛋白含量。与BCA法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与BCA方法无显著性差异。

血清总蛋白的测定结果

实施例7：

取人血浆样品，用双蒸水稀释50倍，在20 μL人血浆稀释液中加入180 μL实施例2的a液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值（F₅₃₅），根据实施例4标准曲线进行定量，获得血浆样品中的总蛋白含量。与BCA法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与BCA方法无显著性差异。

血浆总蛋白的测定结果

实施例8：

取牛奶样品，用双蒸水稀释10倍，在10 μL牛奶稀释液中加入10 μL 浓度为10 mmol/L的EDTA溶液和180 μL实施例2的a液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值（F₅₃₅），根据实施例4标准曲线进行定量，获得牛奶样品中的总蛋白含量。与BCA法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与BCA方法无显著性差异。

牛奶总蛋白的测定结果

实施例9：

用细胞裂解液裂解HL60细胞后，提取细胞总蛋白，用双蒸水稀释6倍，在20 μL细胞裂解稀释液中加入180 μL实施例2的a液，充分混匀后置于30 °C水浴反应30分钟，以472 nm为激发波长，测定在535 nm处的荧光强度值（F₅₃₅），根据实施例4标准曲线进行定量，获得细胞样品中的总蛋白含量。与BCA法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与BCA方法无显著性差异。

细胞总蛋白的测定结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。