专利名称：水生丛毛单胞菌属菌株及其在废水生物脱氮中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域。具体涉及水生丛毛单胞菌属菌株及其对含氮 工业废水以及含氮生活污水的短程硝化一反硝化脱氮处理及应用。
二.
背景技术：
随着工农业生产的发展和人民生活水平的提高，含氮化合物的排放量急剧增 加，已成为环境的主要污染源。水体氮素污染造成的环境危害日益严重，最主要 的后果是导致水体富营养化，引起水体藻类过渡繁殖并造成藻类水华暴发。水体 氮素污染还会引起水生生态系统以及对对生物健康方面的有害影响，最直接的影 响是氨对水生生物的毒害，进入水体的氨氮在硝化菌的作用下，可氧化成亚硝酸 盐和硝酸盐，消耗大量氧气，降低水体质量，严重危害水生生态系统安全。另外， 亚硝酸盐和硝酸盐也是严重威胁人类健康的有害物质。
短程硝化一反硝化生物脱氮技术较传统生物脱氮技术具有减少反应容积，节 省基建投资，减少曝气量和碳源等优点，已成为生物脱氮领域研究的热点之一。 目前，亚硝化控制技术主要是通过控制温度、DO、 pH值、游离氨浓度(FA) 等条件筛选出氨氧化细菌，淘汰亚硝酸盐氧化细菌，实现亚硝酸盐积累。但这些 方法同时也存在控制条件苛刻和容易向全程硝化转化的缺点，从而局限了其应 用。
三.
发明内容
本发明需要解决的问题是为含氮废水的生物处理提供高效的短程硝化一反 硝化菌制剂，强化含氮废水的脱氮处理。从自然界中分离出的一株水生丛毛单胞
菌属菌，能够以C02为碳源及能量或者以C02和有机物为混合碳源和能量、氨
氮或硝态氮为氮源生长，通过将氨氮转化为亚硝酸盐氮，再将亚硝酸盐氮转化为 氮气实现短程硝化一反硝化，对含氮废水具有高效的脱氮作用。在含氮废水脱氮 中具有广泛的应用前景。
本发明的技术解决方案是，本发明提供的水生丛毛单胞菌属菌株为 Owwwo"cwLNL3，于2008年1月24日保藏于"中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心"，其保藏号CGMCCNo . 2 361。
该水生丛毛单胞菌属菌株是从镇江金山湖水体水生植物根区、金山湖水体敞 水区以及金山湖沉积物中采集、分离得到。
具体筛选步骤如下
用预先灭菌的针管(15cmxl.5cm)、底泥采样器从镇江金山湖水平面以下 30cm 50cm处的水体中，水生植物根区，金山湖表层底泥等处，分别采集水体、 植物根区以及底泥中的微生物样，取样后立即封口，作为菌源进行分离，富集培 养。在无菌条件下，将水样加到氨氧化细菌富集培养基中(氨氧化细菌培养基成 分为(NH4)2SO4O.2g， K2HPO40.1g， MgSO40.05g， NaCl 0.2g， FeSO40.04g， CaC03 0.5g， H20 lOOml， pH值7.2，其中培养基在121。C湿热灭菌20min后使用)，置 于摇床上在28。C条件下培养48h。然后再转到氨氧化细菌的固体培养基中，固 体培养基成分为(NH4)2SO4 0.2g， K2HPO40.1g， MgSO40.05g， NaC10.2g， FeS04 0.04g， CaCO30.5g，琼脂2g， H20 100ml， pH值7.2，将扩培后的菌种进行平板 划线初步分离，平板在28i:培养48h。根据平板上长出的单个微生物，选择其中 长势较好的进行再次富集培养。最后在固体培养基上反复进行平板划线分离，分 离出一株对氨氮和亚硝酸盐氮具有高效降解能力的水生丛毛单胞菌属菌株。
该水生丛毛单胞菌属菌株在pH值6.5~8.5培养基介质中培养，适合的生长 温度为25 35'C ;其细菌学形态特征为革兰氏阴性菌，尺寸为0.5 1.0x l 4 pm，有鞭毛，好氧或厌氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，以C02为碳源及能量 或者以C02和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源生长。
该菌在固体培养基上28'C培养15 20天，菌落小，呈圆形，边缘光滑， 表面光滑，菌体呈现无色，极易挑起。
依据该菌株形态学以及分子生物学分析，可鉴定其为水生丛毛单胞菌属的菌 株。通过扩增该菌株的16SrDNA，得到了长度为1415bP的16S rDNA全序列。 PCR引物采用细菌16S rDNA的通用引物fDl( 5 ，- AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3 ')禾口 rDl ( 5 ，-AAGGAGGTGATCCAGCC - 3 ')。用PCR仪(GeneAmp ， PCR system 9700 )进行扩增反应。PCR反应体系总体积为40pL :其中10xPCR反
应缓冲液4pL，2.5mmol/L的dNTP溶液4^iL， lOpmol/pL的引物fDl和rDl各4pL， Taq酶2个单位，DNA模版40ng。提取的DNA稀释后取2pL于反应体系中， 94。C预变性5min; 94。C变性lmin， 55"C退火30s， 72°<3延伸lmin， 33个循环； 72'C延伸7min。 1.5%的琼脂糖凝胶，EB染色后紫外检测。通过Blast程序进行 同源性比较，表明该菌株与Cowa附o加s叫w^/ca的相似度高达99%以上、可重 复性100% 。
本发明的水生丛毛单胞菌属菌株既可在富营养培养基中生长，也可在以C02 为碳源及能量或者以C02和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源的 基础培养基中生长。
该水生丛毛单胞菌属菌株对氨氮的降解能力极强，经该菌株作用后，氨氮在 可见光区最大吸收峰(412nm)消失，从而降低废水中的氨氮浓度。
该水生丛毛单胞菌属菌株通过将亚硝酸盐氮转化为氮气，使得亚硝酸盐氮在 可见光区最大吸收峰(540nm)消失，从而降低废水中的亚硝酸盐氮。
本发明的水生丛毛单胞菌属菌株，可以用新鲜培养的生长期菌种或是固定化 菌株对氨氮进行降解处理。
本发明的水生丛毛单胞菌属菌株，可以用新鲜培养的生长期菌种或是固定化 菌株先将氨氮转化为亚硝酸盐氮，然后将亚硝酸盐氮转化为氮气，通过短程硝化 一反硝化作用对含氮废水进行高效降解处理。
本发明所达到的有益效果是本发明提供的水生丛毛单胞菌属菌株对氨氮和 亚硝酸盐具有较强的转化能力，降解速度快，降解率高达90%以上。该菌株可作 为游离生物菌制剂或固定化菌株，投加到现有的废水处理系统中，对含氮废水进 行短程硝化一反硝化处理，提高原处理系统的反应效率，降低能耗，縮短反应时 间，增强原处理系统的处理能力和效率，在工业水处理和生活污水处理中具有广 阔的应用潜力。
四.
图l.水生丛毛单胞菌属菌株去除氨氮能力，一A—进水氨氮浓度(mg/L)， 一口 一出水氨氮浓度(mg/L)， 一令一氨氮去除率(100%)
图2.水生丛毛单胞菌属菌株去除亚硝酸盐能力，一A—进水亚硝酸盐浓度 (mg/L), —口一出水亚硝酸盐浓度(mg/L) ， 一V—亚硝酸盐去除率(100%)
图3水生丛毛单胞菌属菌株硝化一反硝化去除氨氮能力
一画一进水氨氮浓度(mg/L)， 一A —出水氨氮浓度(mg/L)， 一A —出水亚硝酸盐 浓度(mg/L)， 一*一氨氮去除率(100%)
图4.实验反应装置，(1).进水箱;(2).剂量泵;(3).反应器;(4).出水;(5) 空压机；(6).气体流量计；(7).循环水泵；(8).循环水箱；(9).加热元件和温 度传感器
图5不同氨氮负荷情况下氨氮去除率及亚硝化率
一翻一进水氨氮浓度，一A —出水氨氮浓度，一A —亚硝化率，一o—氨氮去 除率
图6不同亚硝酸盐进水浓度下亚硝酸盐去除率
一A —出水硝酸盐浓度，一令一进水亚硝酸盐浓度，一B—出水亚硝酸盐浓度，一
A—进水硝酸盐浓度，一*一亚硝酸盐去除率
图7系统处理含氨氮和葡萄糖废水能力
一画一进水氨氮浓度，一V —出水氨氮浓度，一o—出水硝酸盐浓度，一A —氨 氮去除率，一*一总氮去除率
五.
具体实施例方式
实施例1本发明提供的水生丛毛单胞菌属菌株的筛选步骤
用预先灭菌的针管(15cmxl.5cm)、底泥采样器从镇江金山湖水平面以下 30cm 50cm处的水体中，水生植物根区，金山湖表层底泥等处，分别釆集水体、 植物根区以及底泥中的微生物样，取样后立即封口，作为菌源进行分离，富集培
养。在无菌条件下，将水样加到氨氧化细菌富集培养基中(氨氧化细菌培养基成 分为(NH4)2SO4 0.2g， K2HPO40.1g， MgSO40.05g， NaCl 0.2g， FeSO40.04g， CaC03 0.5g， H20 100ml， pH值7.2，其中培养基在12rC湿热灭菌20min后使用)，置 于摇床上在28'C条件下培养48h。然后再转到氨氧化细菌的固体培养基中(固 体培养基成分为(NH4)2SO40.2g， K2HPO40.1g， MgSO40.05g， NaC10.2g， FeS04 0.04g， CaCO30.5g，琼脂2g， H20 lOOml， pH值7.2)，将扩培后的菌种进行平 板划线初步分离，平板在28X:培养48h。根据平板上长出的单个菌株，选择其中 长势较好的进行再次富集培养。最后在固体培养基上反复进行平板划线分离，分 离出一株对氨氮和亚硝酸盐氮具有高效降解能力的水生丛毛单胞菌属菌株，并将 该菌株于2008年1月24日保藏于"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心"，其保藏号CGMCC No . 2 361 。
该水生丛毛单胞菌属菌株在pH值6.5~8.5培养基介质中培养，适合的生长 温度为25~35 °C ;其细菌学形态特征为革兰氏阴性杆菌，尺寸为0.5 1.0 x 1 4 pm，有鞭毛，好氧或厌氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，以C02为碳源及能量 或者以C02和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源生长。 本发明提供的水生丛毛单胞菌属菌株的16SrRNA扩增 通过扩增该菌株的16SrDNA，得到了长度为M15bP的16SrDNA全序列。 PCR引物采用细菌16S rDNA的通用引物fDl( 5 '- AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3 ')和rDl ( 5 ，-AAGGAGGTGATCCAGCC - 3 ')。用PCR仪(GeneAmp , PCR system 9700 )进行扩增反应。PCR反应体系总体积为40^L :其中10xPCR反 应缓冲液 L， 2.5mmol/L的dNTP溶液4piL， 1 Opmol/pL的引物fDl和rDl各4pL， Taq酶2个单位，DNA模版40ng。提取的DNA稀释后取2pL于反应体系中， 94。C预变性5min; 94"C变性lmin， 55。C退火30s， 72。C延伸lmin， 33个循环; 72'C延伸7min。 1.5%的琼脂糖凝胶，EB染色后紫外检测。通过Blast程序进行 同源性比较，表明该菌株与Comamo"似agwarica的相似度高达99%以上、可重 复性100%。
制备水生丛毛单胞菌属菌株的细胞液体培养物-
挑取固体培养基上的水生丛毛单胞菌属菌株单菌落于装有灭菌的液体培养 基中，于28°C, pH 7.5 , 80r/min，进行好氧培养48h，取培养好的菌液lml接种
在装有100 ml含氨氮(100 mg/L)的基础培养基的250 ml锥形瓶中，28。C, pH 7.5 , 80r/min，进行好氧培养48 h，即为水生丛毛单胞菌属菌株的细胞液体培养 物。
制备固定化水生丛毛单胞菌-
采用亲水性玻璃态单体甲基丙烯酸卩羟乙酯(HEMA)、丙烯酸羟乙酯(HEA) 与蒸馏水按照一定的体积比混合均匀，在-63'C -78'C温度条件下，用剂量为 lxl03Gy lxl06Gy的高能射线辐照形成生物相容性固定化共聚物多孔载体，加 入经活化培养进入对数生长期的水生丛毛单胞菌属菌液，使之吸附于固定化载体 表面并通过增殖进入多孔载体内部实现固定化。
实施例2
本发明在富营养培养基中对氨氮降解研究的应用，其步骤如下 [1]在250ml的锥形瓶中加入50ml富营养培养基(氨氮浓度为50mg/L)。 [2]将实施例1制得的水生丛毛单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述 [l]的锥形瓶中，28°C, 80r/min ，好氧培养。每隔2小时取样测定。图1为水生 丛毛单胞菌属菌株在富集培养基中降解氨氮情况。从图1可以看出，菌体少量的 生长足以使氨氮降解，接种6小时后，氨氮的降解率接近IOO %。 实施例3
本发明在以葡萄糖和C02为混合碳源，亚硝酸盐为氮源培养基中对亚硝酸 盐降解研究的应用，其步骤如下将实施例1中的培养基换为以葡萄糖和C02为混合碳源，亚硝酸盐为氮 源的基础培养基(亚硝酸盐浓度为50mg/L)将实施例1制得的水生丛毛单胞菌属菌株株的细胞液体培养物加入上 述[l]的锥形瓶中，28°C, 80r/min ,厌氧培养。每隔2小时取样测定。图2为水 生丛毛单胞菌属菌株在富集培养基中降解亚硝酸盐情况。从图2可以看出，菌体 少量的生长足以使亚硝酸盐降解，接种12小时后，亚硝酸盐的降解率接近100 %。
实施例4
本发明在以葡萄糖和C02为混合碳源，氨氮为氮源培养基中对氨氮降解研 究的应用，其步骤如下将实施例1中的培养基换为以葡萄糖和C02为混合碳源，氨氮为氮源的 基础培养基(氨氮浓度为50mg/L)将实施例1制得的水生丛毛单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述 [l]的锥形瓶中，28°C， 80r/min ,好氧一厌氧培养。每隔2小时取样测定。图3 为水生丛毛单胞菌属菌株在富集培养基中降解氨氮情况。从图3可以看出，菌体 少量的生长足以使氨氮降解，接种12小时后，出水中的氨氮浓度很低，亚硝酸 盐浓度也低，系统脱氮率达到65.8%,实现短程硝化一反硝化，达到脱氮的目的。
实施例5
本发明在实验室模拟流化床反应器中对含氨氮废水降解的应用，其步骤如
下图4为实验室模拟的流化床反应器。将实施例1制备的水生丛毛单胞菌 属菌株的固定化菌株投入反应器中，反应器中载体的填充率为10%。分别将含氨氮浓度为100mg/L、 150mg/L和200mg/L的废水加入反应器 中，在3(TC，曝气量为250ml/min条件下进行反应，24个小时后取样测定。图 5为水生丛毛单胞菌属菌株的固定化菌株在模拟流化床系统中处理含氨氮废水 的情况。从曲线可以看出，进行24个小时反应后，出水中的氨氮浓度很低，氨 氮去除率接近100%,降解的氨氮几乎转化为亚硝酸盐氮，亚硝化率维持在90%以 上，短程硝化效果明显。
实施例6
本发明在实验室模拟流化床反应器中对含亚硝酸盐氮废水降解的应用，其步 骤如下图4为实验室模拟的流化床反应器。将实施例1制备的水生丛毛单胞菌 属菌株的固定化菌株投入反应器中，反应器中载体的填充率为10%。分别将含亚硝酸盐浓度为30mg/L、 60mg/L和90mg/L和一定量葡萄糖 (TOC=100mg/L)的废水加入反应器中，在3(TC，曝气量为60ml/min (保证一
定的混合作用)条件下进行反应，24个小时后取样测定。图6为水生丛毛单胞 菌属菌株的固定化菌株在模拟流化床系统中处理含亚硝酸盐氮废水的情况。从曲 线可以看出，进行24个小时反应后，出水中的亚硝酸盐氮浓度很低，亚硝酸盐 氮去除率接近100%,实现了短程反硝化，达到脱氮的目的。
实施例7
本发明在实验室模拟流化床反应器中对含氨氮和葡萄糖废水降解的应用，其
步骤如下图4为实验室模拟的流化床反应器。将实施例1制备的水生丛毛单胞菌 属菌株的固定化菌株投入反应器中，反应器中载体的填充率为10%。将含氨氮浓度为100mg/L和一定量葡萄糖(TOC=100mg/L)的废水加入 反应器中，在30'C，曝气量为250ml/min条件下进行反应，24个小时后取样测 定。图7为水生丛毛单胞菌属菌株的固定化菌株在模拟流化床系统中处理含氨氮 和葡萄糖废水的情况。从曲线可以看出，进行24个小时反应后，出水中的氨氮 浓度很低，亚硝酸盐浓度也低，系统脱氮率达到75.2%，实现了短程硝化一反硝 化，达到脱氮的目的。
权利要求
1.一种水生丛毛单胞菌属菌株，其特征在于水生丛毛单胞菌属菌株为Comamonas aquatica LNL3，其细菌学形态特征为革兰氏阴性杆菌，尺寸为0.5～1.0×1～4μm，有鞭毛，好氧或厌氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，以CO2为碳源及能量或者以CO2和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源的基础培养基中生长，该菌株于2008年1月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No.2361。
2. 根据权利要求1所述的水生丛毛单胞菌属菌株筛选方法，其特征在于该 菌株是从镇江金山湖水体的水生植物根区、金山湖水体敞水区以及金山湖沉积物 中采集、分离得到；该菌株在pH值6.5~8.5培养基介质中培养，适合的生长温 度为25~35 °C。
3. 根据权利要求1所述的水生丛毛单胞菌属菌株在废水生物脱氮中的应用。
4. 根据权利要求3所述的水生丛毛单胞菌属菌株在废水生物脱氮的短程硝 化一反硝化中的应用。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域。具体涉及水生丛毛单胞菌菌株及其在废水生物脱氮过程中短程硝化-反硝化脱氮中的应用。本发明涉及的水生丛毛菌菌株，为Comamonas aquatica LNL<sub>3</sub>，于2008年1月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.2361；是从镇江金山湖水体水生植物根区、金山湖水体敞水区以及金山湖沉积物中采集、分离得到；该菌株可以以CO<sub>2</sub>为碳源及能量或者以CO<sub>2</sub>和有机物为混合碳源和能量、氨氮或硝态氮为氮源的基础培养基中生长。其菌液、休眠细胞以及固定化菌株均可以将氨氮分解为亚硝酸盐氮，同时可以将氨氮转化为氮气，既能够作为脱氮微生物将氨氮转化为亚硝酸盐氮，又能够将氨氮转化为氮气，实现短程硝化-反硝化。该菌株的益处是具有对含氮废水的硝化-反硝化作用，对氨氮的降解速度快，适用于含氮工业废水、含氮生活污水的处理。
文档编号C02F3/34GK101348772SQ200810020649
公开日2009年1月21日 申请日期2008年2月19日 优先权日2008年2月19日
发明者吕溢修, 张晓姣, 李正魁, 李芳捷, 杨竹攸, 石鲁娜, 赖鼎东 申请人:南京大学