专利名称：一种固定化硝化细菌降解养殖废水亚硝酸盐的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及降解养殖废水亚硝酸盐的工艺，特别是涉及一种利用固定化硝化细菌处理 水产高密度养殖废水亚硝酸盐的工艺。
背景技术：
近年来由于经济社会的发展，人们对水产品的需求量越来越大，这促使高密度水养殖 得到迅速的推广。高密度水产养殖经常会出现养殖水体环境恶化的问题。养殖水体亚硝酸 盐的积累是常见问题之一。目前，人们普遍倾向于直接向水体投加微生态制剂来降低亚硝 酸盐。但这种方法存在微生物体易死亡，易流失的弊端。为解决这一问题，逐渐有人将固 定化微生物用于解决水产水体问题。微生物的固定化可分为吸附固定化和包埋固定法两种 方法。吸附固定化存在吸附量有限，易解吸的问题；固定化微生物颗粒具有生物量浓度高， 可以反复使用，抗环境毒性能力强等优点。因此，使用包埋固定化固定微生物处理养殖废 水将成为趋势之一。包埋法的原理是将微生物细胞截留在水不容性的凝胶聚合物孔隙的网 络空间中，通过聚合作用或通过离子网络形式，或通过沉淀作用，或改变溶剂温度、pH值 使细胞截留。凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄漏，同时能让基质渗入和产物扩散出来。
目前，常见的用于水产的固定化微生物有反硝化细菌、光合细菌、芽孢杆菌和藻类。 在国内外虽然也有人将固定化的硝化细菌用于水产，但多限于氨氮的去除，去除亚硝酸盐 尚未见报道。国外固定化微生物在水产养殖方面的使用多限于大型集约化养殖，而且他们 多采用吸附固定化的方法来固定微生物，将固定化微生物驯化一段时间，形成生物膜后再 用于废水处理。该法在运作过程中涉及大量设备，耗费大量能量。这在国内目前的养殖条 件下是比较难以实现的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种高效的固定化硝化细菌降解养殖废 水亚硝酸盐的工艺。
本发明目的可以通过如下途径达到
一种固定化硝化细菌去除养殖废水亚硝酸盐的工艺，包括如下步骤和工艺条件 (1)硝化细菌浓縮液的制备将发酵好硝化细菌菌液静置8 14h，去除上层清液， 收集底部浓縮菌液，然后用生理盐水将浓縮菌液释为20 30g/L，即得到包埋用硝化细菌浓
縮液；
(2) 硝化细菌固定化颗粒的制备将重量百分比浓度为8 10%的聚乙烯醇、1 3% 的海藻酸钠和1 2%的二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷却至室 温后以体积比1:1 1:3的比率向包埋液中加入歩骤(1)包埋用硝化细菌浓縮液，混匀后 滴入到交联剂中，交联剂与包埋液体积之比2: 1 4:1;所述交联剂由重量体积比浓度为2 %的氯化钙溶液和饱和硼酸溶液按1: 1 1:3的体积比例混合，pH预先调至6. 0 6. 5，交 联12 16h后用纱布滤出固定化颗粒，用生理盐水冲洗2 3次后得到固定化硝化细菌颗粒；
(3) 硝化细菌固定化颗粒的活化将固定化硝化细菌颗粒置于硝化细菌培养基中27 3(TC下通气活化12 15小时，然后滤出固定化小球，用生理盐水冲洗2-3次后备用；以自 来水1000mL计，硝化细菌培养基配方如下NaHC031. 2 1. 8g、NaN02 0. 3 0. 6g、MgS04 7H20 0. 1 0. 2g、 K2HP04 0. 1 0. 2g、 NaClO. 1 0. 3g和FeS04 7H20 0. 01 0. lg， pH7. 2 7. 6;
(4) 硝化细菌固定化颗粒反应包的制备将硝化细菌固定化颗粒和粒径为5-10mm的 干木炭颗粒以质量比1:1 1:3的比例混合，然后将混合物均匀固定在纱布反应包中；
(5) 反应包去除养殖废水亚硝酸盐将做好的反应包固定在离增氧机直径2 4m的范 围的表层水中，纱布反应包每亩养殖面积100 150个。
为进一步实现本发明的目的，所述的浓縮菌液浓度通过下述方法计算先测定发酵好
的硝化细菌菌液的0D6(K)及体积V,，发酵好菌液静置12h，去除上层清液，收集底部浓缩 菌液后再测定浓縮液体积V2，浓縮液的菌体浓度可按下列公式得到菌体浓度(g/L) =1.271 X0D,XV'/V2。
所述的均匀固定纱布反应包中是指将混合物以100g的量装入200mm X 200mm的单层 医用纱布袋中，将布袋缝合，再将混合物在袋中铺平，将布袋缝为16个相当大小的方格。 所述的反应包与增氧机连接并依靠浮力固定在离增氧机直径2 4m的范围的表层水中。
所述歩骤(5)纱布反应包经过10 15天使用后，反应包处理能力有减弱的情况时，
将反应包取下洗净后放入硝化细菌培养基中通气活化1 2天后继续使用。 本发明与国内广泛使用的养殖水处理技术相比具有如下优点
1、亚硝酸盐降解效果快速、持续、稳定。
使用包埋法固定硝化细菌可以大幅度提高颗粒内的生物浓度，其浓度可以高达13g/L; 采用上述包埋方法可以最大限度保留固定后硝化细菌的活性；据测定固定后硝化细菌活性 可以达到游离硝化细菌活性的40.04%，因此反应包对水体亚硝酸盐的降解很迅速。由于硝化 细菌是被包埋固定化的，硝化细菌不易被洗脱，死亡率与游离的硝化细菌相比要低很多， 可持续发挥降解能力。本发明采用PVA、 SA、 二氧化硅混合固定的方法制作固定化硝化细 菌颗粒，该方法制作的颗粒强度大，可以长时间使用而不至于变形，在实验过程中固定化 颗粒可连续使用60d而无明显形变，同时固定化增强了硝化细菌对环境的适应能力及对有 害因素的抵抗能力，这使反应包在使用过程中具有稳定的降解效果
2、 可以长时间维持高的生物活性。
反应包是采用固定化颗粒与木炭颗粒混合物填充的，木炭可起到重要作用 一方面， 木炭可减少水流对固定化颗粒的冲击作用；另一方面当水中亚硝酸浓度降到一个比较低的 水平时可利用木炭对亚硝酸盐的吸附作用富集亚硝酸盐，为固定的硝化细菌提供充足的底 物，维持固定化硝化细菌的基本生命代谢活动。由于反应包是固定在增氧机周围的，当增 氧机开动时可同时给反应包提供充足的溶氧及亚硝酸盐。因此，反应包可长时间维持高的 生物活性。
3、 反应包可反复使用。
与游离的硝化细菌制剂相比，固定化硝化细菌反应包最显著的特点就是可以回收反复 使用。试验证明反应包在水体亚硝酸盐浓度小于0.1mg/L时连续使用一段时候后，降解亚 硝酸盐的能力有所降低。但反应包内的硝化细菌并未死亡，只需将反应包浸入培养基中通 气活化24h就可迅速恢复反应包的活性。
4、 反应包制作方法简单、成本低。
与投加微生态制剂相比，使用反应包可大大降低生物降解亚硝酸盐的成本。包埋颗粒 的制作方法十分简单，反应包制作过程简单，制作材料只涉及PVA、 SA、 CaCl2、纱布等 常见材料。与游离菌相比可以固定化硝化细菌降低了亚硝酸盐生物去除成本。游离亚硝酸 盐氧化菌投加到水体后易死亡及在池塘换水过程中被洗脱；因此，投加游离硝化细菌只可 维持一定时间(时间长短由池塘里的微生态环境而定)降解效果，每隔一段时间需重新投 加硝化细菌制剂。而反应包对环境适应能力强，可活化反复使用。
而且，反应包在使用的过程中不需要其他任何装置，它只是充分利用已有的增氧设备 实现反应过程中的物质传递，基本不需要额外耗费能量。
5、 反应包有可观的应用前景。
该反应包不仅可用于大规模高密度水产养殖，还可以用于观赏鱼鱼缸内亚硝酸盐的脱 除以及其它工业废水中亚硝酸盐的去除。
图1是实施例1 3与其对照例亚硝酸盐氮含量降低曲线图。 图2是实施例4~5与其对照例亚硝酸盐氮含量降低曲线图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于实施例表 示的范围。
实施例l:
(1) 硝化细菌浓縮液的制备测定500ml发酵好的维氏硝化杆菌菌液的光密度(OD600) 为0.765，将菌液静置8h，菌体会絮凝沉积于容器底部，去除上层清液，收集底部浓縮菌 体，测定浓縮液体积10ml，浓缩液的菌体浓度可按下列公式得到
菌体浓度(g/L) =1.271 X0D,XV,/V2二 1.271X0.765X500/10=48.62 然后用生理盐水将浓縮菌液释到30g/L，即得到包埋用硝化细菌浓縮液。
(2) 硝化细菌固定化颗粒的制备将200ml重量百分比浓度为8%的聚乙烯醇(PVA)、 3%的海藻酸钠(SA)和2%的二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷 却至室温后以体积比1: 1的比率向包埋液中加入步骤(1)包埋用硝化细菌浓縮液，混匀 后滴入400ml交联剂中；所述交联剂由重量体积百分比为2%氯化钙溶液和饱和硼酸以1:1 体积比例混合，pH预先调至6.0，交联12h后用纱布滤出固定化颗粒，用生理盐水冲洗3 次后得到固定化硝化细菌颗粒；
(3) 硝化细菌固定化颗粒的活化将固定化硝化细菌颗粒置于硝化细菌培养基中27 'C下通气活化12小时，然后滤出固定化小球，用生理盐水冲洗2-3次后备用；以自来水 1000mL计，硝化细菌培养基配方如下歸C0!1.2g、 NaN02 0.3g、 MgS04 7H力0. lg、 K2HP04 0. lg、 NaClO. lg和FeS04 7H20 0. Olg， pH7. 2 7. 6;
(4) 硝化细菌固定化颗粒反应包的制备将硝化细菌固定化颗粒和粒径为5-10mm的 千木炭颗粒以质量比1: 1的比例混合，然后将混合物以lOOg的量装入200mmX200mm的 单层医用纱布袋中，将布袋缝合，再将混合物在袋中铺平，将布袋缝为16个相当大小的方 格。
(5) 反应包去除实验室条件下模拟废水亚硝酸盐在装有IOL模拟废水的水池中间放 置一通气石，3个反应包等距离的固定在靠近通气石的上方水面下。其处理结果如图1， 7 天后，水体中的亚硝酸盐氮含量降低至0.2mg/l以下，相对于对照例可见明显降低。图中例1对照例即为将200ml重量百分比浓度为8%的聚乙烯醇(PVA)、 3%的海藻酸钠(SA)和 2%的二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷却至室温后滴入400ml交 联剂中；所述交联剂由2%氯化钙溶液和饱和硼酸以1:1体积比例混合，pH预先调至6.0， 交联12h后用纱布滤出固定化颗粒，用生理盐水冲洗3次后得到的不含菌体的固定化小球。
实施例2
(1 )硝化细菌浓縮液的制备测定500ml发酵好的维氏硝化杆菌菌液的光密度(OD600) 为0.780，将菌液静置14h，菌体会絮凝沉积于容器底部，去除上层清液，收集底部浓縮菌 体，测定浓縮液体积15ml，浓縮液的菌体浓度可按下列公式得到
菌体浓度(g/L) =1.271 XOD^XVi/Va-lJTlXOJSOXSOO/lS-SS.OS 然后用生理盐水将浓縮菌液释到20g/L，即得到包埋用硝化细菌浓縮液；
(2) 硝化细菌固定化颗粒的制备以将200ml重量百分比浓度为10%的聚乙烯醇 (PVA)、 1%的海藻酸钠(SA)和2%的二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包
埋液，冷却至室温后以体积比1: 3的比率向包埋液中加入步骤(1)包埋用硝化细菌浓縮 液，混匀后滴入800ml交联剂中；所述交联剂由重量体积百分比为2%氯化钙溶液和饱和 硼酸以1:3比例混合，pH预先调至6.0，交联12h后用纱布滤出固定化颗粒，用生理盐水 冲洗3次后得到固定化硝化细菌颗粒；
(3) 硝化细菌固定化颗粒的活化将固定化硝化细菌颗粒置于硝化细菌培养基中30 t:下通气活化15小时，然后滤出固定化小球，用生理盐水冲洗2-3次后备用；以自来水 1000mL计，硝化细菌培养基配方如下NaHC031.8g、 NaN02 0.6g、 MgS04 7H20 0 . 2g、 K2HP04 0. 2g、 NaClO. 3g和FeS04 7H20 0. lg， pH7. 2 7. 6;
(4) 硝化细菌固定化颗粒反应包的制备将硝化细菌固定化颗粒和粒径为5-10mm的 干木炭颗粒以质量比1: 3的比例混合，然后将混合物以100g的量装入200mmX200mm的 单层医用纱布袋中，将布袋缝合，再将混合物在袋中铺平，将布袋缝为16个相当大小的方 格。
(5) 反应包去除实验室条件下模拟废水亚硝酸盐在装有IOL模拟废水的水池中间放 置一通气石，3个反应包等距离的固定在靠近通气石的上方水面下。其处理结果如图1所 示，7天后，水体中的亚硝酸盐氮含量降低至0.2mg/l以下，相对于对照例可见明显降低。 图中例2对照例即是将200ml重量百分比浓度为10%的聚乙烯醇(PVA)、 1%的海藻酸钠
(SA)和2%的二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷却至室温后滴入
800ml交联剂中；所述交联剂由2%氯化钙溶液和饱和硼酸以1:3比例混合，pH预先调至 6.0，交联12h后用纱布滤出固定化颗粒，用生理盐水冲洗3次后得到的不含菌体的固定化 小球。 实施例3
(1) 硝化细菌浓縮液的制备测定500ml发酵好的维氏硝化杆菌菌液的光密度(OD6oc)) 为0.803，将菌液静置llh，菌体会絮凝沉积于容器底部，去除上层清液，收集底部浓縮菌 体，测定浓縮液体积14ml，浓縮液的菌体浓度可按下列公式得到
菌体浓度(g/L) 4.271X0D,XV,/V2二1.271X0.803X500/14-36.45 然后用生理盐水将浓縮菌液释到25g/L，即得到包埋用硝化细菌浓縮液；
(2) 硝化细菌固定化颗粒的制备以将200ml重量百分比浓度为9W的聚乙烯醇(PVA)、 2%的海藻酸钠(SA)和1%的二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷 却至室温后以体积比1: 2的比率向包埋液中加入步骤(1)包埋用硝化细菌浓縮液，混匀 后滴入600ml交联剂中；所述交联剂由重量体积百分比为2%氯化钙溶液和饱和硼酸以1-.2 比例混合，pH预先调至6.0，交联12h后用纱布滤出固定化颗粒，用生理盐水冲洗3次后 得到固定化硝化细菌颗粒；
(3) 硝化细菌固定化颗粒的活化将固定化硝化细菌颗粒置于硝化细菌培养基中29 匸下通气活化14小时，然后滤出固定化小球，用生理盐水冲洗2-3次后备用；以自来水 1000mL计，硝化细菌培养基配方如下NaHCO:i 1. 5g、 NaN02 0. 45g、 MgS04 7H20 0. 15g、 K」'HP04 0. 15g、 NaClO. 2g和FeS04 7H20 0. 05g， pH7. 2 7. 6;
(4) 硝化细菌固定化颗粒反应包的制备将硝化细菌固定化颗粒和粒径为5-10mm的 干木炭颗粒以质量比1: 2的比例混合，然后将混合物以100g的量装入200mmX200mm的 单层医用纱布袋中，将布袋缝合，再将混合物在袋中铺平，将布袋缝为16个相当大小的方 格。
(5) 反应包去除实验室条件下模拟废水亚硝酸盐在装有IOL模拟废水的水池中间放 置一通气石，3个反应包等距离的固定在靠近通气石的上方水面下。其处理结果如图1所 示，7天后，水体中的亚硝酸盐氮含量降低至0.2mg/1以下，相对于对照例可见明显降低。 图中例3对照即是将200ml重量百分比浓度为9%的聚乙烯醇(PVA)、 2%的海藻酸钠(SA) 和1%的二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷却至室温后后滴入600ml 交联剂中；所述交联剂由重量体积百分比为2%氯化钙溶液和饱和硼酸以1:2比例混合， pH预先调至6.0，交联12h后用纱布滤出固定化颗粒，用生理盐水冲洗3次后得到不含菌
体的固定化小球。 实施例4
以例1所制备得到的反应包，按每亩100个反应包与增氧机连接并依靠浮力固定在增 氧机直径2m的范围的表层水中，用以处理5亩养殖面积的水塘中的亚硝酸盐。结果如图2 所示，6天后，养殖水体中亚硝酸盐氮的量降低到0.2mg/1以下，相对于对照例可见明显降 低。图中例4对照例即是在不利用例1所制得的反应包的自然条件下，养殖水体中亚硝酸 盐氮的含量变化。
实施例5
以例1所制备得到的反应包，按每亩150个反应包与增氧机连接并依靠浮力固定在增 氧机直径4m的范围的表层水中，用以处理5亩养殖面积的水塘中的亚硝酸盐。结果如图2 所示，6天后，养殖水体中亚硝酸盐氮的量降低到0.2mg/l以下，相对于对照例可见明显降 低。图中例5对照即是在不利用例1所制得的反应包的自然条件下，养殖水体中亚硝酸盐 氮的含量变化。
权利要求
1、一种固定化硝化细菌去除养殖废水亚硝酸盐的工艺，其特征在于包括如下步骤和工艺条件(1)硝化细菌浓缩液的制备将发酵好硝化细菌菌液静置8～14h，去除上层清液，收集底部浓缩菌液，然后用生理盐水将浓缩菌液释为20～30g/L，即得到包埋用硝化细菌浓缩液；(2)硝化细菌固定化颗粒的制备将重量百分比浓度为8～10％的聚乙烯醇、1～3％的海藻酸钠和1～2％的二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷却至室温后以体积比1∶1～1∶3的比率向包埋液中加入步骤(1)包埋用硝化细菌浓缩液，混匀后滴入到交联剂中，交联剂与包埋液体积之比2∶1～4∶1；所述交联剂由重量体积比浓度为2％的氯化钙溶液和饱和硼酸溶液按1∶1～1∶3的体积比例混合，pH预先调至6.0～6.5，交联12～16h后用纱布滤出固定化颗粒，用生理盐水冲洗2～3次后得到固定化硝化细菌颗粒；(3)硝化细菌固定化颗粒的活化将固定化硝化细菌颗粒置于硝化细菌培养基中27～30C下通气活化12～15小时，然后滤出固定化小球，用生理盐水冲洗2-3次后备用；以自来水1000mL计，硝化细菌培养基配方如下NaHCO31.2～1.8g、NaNO20.3～0.6g、MgSO4·7H2O0.1～0.2g、K2HPO40.1～0.2g、NaCl0.1～0.3g和FeSO4·7H2O 0.01～0.1g，pH7.2～7.6；(4)硝化细菌固定化颗粒反应包的制备将硝化细菌固定化颗粒和粒径为5-10mm的干木炭颗粒以质量比1∶1～1∶3的比例混合，然后将混合物均匀固定在纱布反应包中；(5)反应包去除养殖废水亚硝酸盐将做好的反应包固定在离增氧机直径2～4m的范围的表层水中，纱布反应包每亩养殖面积100～150个。
2、 根据权利要求1所述的一种固定化硝化细菌去除养殖废水亚硝酸盐的工艺，其特征在于所述的浓縮菌液浓度通过下述方法计算先测定发酵好的硝化细菌菌液的OD600及体积V,，发酵好菌液静置12h，去除上层清液，收集底部浓縮菌液后再测定浓縮液体积 V2，浓縮液的菌体浓度可按下列公式得到菌体浓度(g/L) =1.271 X0De。。XVi/V2。
3、 根据权利要求1所述的一种固定化硝化细菌去除养殖废水亚硝酸盐的工艺，其特 征在于所述的均匀固定纱布反应包中是指将混合物以100g的量装入200mmX200mm的 单层医用纱布袋中，将布袋缝合，再将混合物在袋中铺平，将布袋缝为16个相当大小的方 格。
4、 根据权利要求1所述的一种固定化硝化细菌去除养殖废水亚硝酸盐的工艺，其特征在于所述的反应包与增氧机连接并依靠浮力固定在离增氧机直径2 4m的范围的表层 水中。
5、根据权利要求1所述的一种固定化硝化细菌去除养殖废水亚硝酸盐的工艺，其特征 在于所述步骤(5)纱布反应包经过10 15天使用后，反应包处理能力有减弱的情况时， 将反应包取下洗净后放入硝化细菌培养基中通气活化1 2天后继续使用。
全文摘要
本发明公开了一种固定化硝化细菌去除养殖废水亚硝酸盐的工艺。该工艺包括硝化细菌浓缩液的制备、硝化细菌固定化颗粒的制备、硝化细菌固定化颗粒的活化、硝化细菌固定化颗粒反应包的制备以及反应包去除养殖废水亚硝酸盐；其中，硝化细菌固定化颗粒的制备是将聚乙烯醇、海藻酸钠和二氧化硅的水混合物加热充分溶解、混匀后制成包埋液，冷却至室温后向包埋液中加入包埋用硝化细菌浓缩液，混匀后滴入到交联剂中，交联剂由氯化钙溶液和饱和硼酸溶液按1∶1～1∶3的体积比例混合，用纱布滤出固定化颗粒。该工艺亚硝酸盐降解效果快速、持续、稳定、可以长时间维持高的生物活性、反应包可反复使用、反应包制作方法简单、成本低，有可观的应用前景。
文档编号C02F1/58GK101348306SQ20081019830
公开日2009年1月21日 申请日期2008年8月31日 优先权日2008年8月31日
发明者崔华平, 朱雅楠, 林炜铁, 罗剑飞 申请人:华南理工大学