专利名称：净化重金属污染的芽胞杆菌mk3-1及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株对二价锰离子具有氧化作用的芽胞杆菌MK3-1的筛 选及其在净化重金属污染方面中的用途。
背景技术：
重金属一般以天然浓度广泛存在于自然界中，但由于人类对重金属的开釆、冶炼、加工及商业制造活 动日益增多，造成不少重金属如锰、砷、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染。其 中，锰污染在重金属污染中较为常见。
针对锰污染，早在建国初期我国科技部门就确立了 "地下水除铁除锰"这一具有重要社会及经济意义 的课题，其理论及应用先后出现了①自然氧化法包括曝气、氧化反应、沉淀、过滤等一系列复杂的流程。 这一方法对于去除铁较为有效，而对于除锰，仅靠曝气难以将地下水的pH值提高到自然氧化除锰所需的 pH>9.5的较高水平，需投加碱(如石灰)以提高水中pH值，使工艺流程更加复杂，处理后的水pH值太高， 需要酸化后才能正常使用，进一步增加了管理难度及运行费用；②接触氧化法主要是将地下水经过曝气 后进入滤层，使高价的锰化合物吸附在滤料表面形成滤膜。这种滤膜具有接触催化作用，水体中的溶解态 的锰离子被吸附到滤膜上后能被氧化形成新的活性滤膜，是一个自催化的过程。这种方法存在的缺陷是所 需时间长，成本高，且形成的滤膜不稳定，效率不高；③生物氧化法利用微生物将可溶的二价猛(Mn2+) 氧化为不可溶的锰氧化物沉淀从而过滤去除。另外，生物锰氧化法在去除环境中锰污染的同时，生成的生 物锰氧化物对其他重金属(如As、 Ni、 Cu、 Co、 Cd、 Cr等)具有很强吸附、置换和沉淀作用，还可以将毒 性强的As(III)氧化成毒性弱的As(V)后吸附去除(因为As(III)不带电荷，As(V)带负电)。因此，生物锰氧化 在水、土壤重金属污染的治理和修复中具有很高的应用价值。
猛在自然界中以II,III，IV三种价态存在，在无氧及低pH条件下，Mn (II)化学活性很强，相反，在 有氧及高pH值条件下，三价及四价锰的化学活性高。二价锰是主要的溶解形态，在溶液中通常以 MnCl2，MnOH+等形式存在。本发明的芽胞杆菌MK3-1可以将二价锰离子氧化成不溶的锰氧化物沉淀，从 而将锰及其它重金属从污水中去除，而且还可以配合新兴的微生物包埋技术，达到对锰、砷及其他重金属 污染环境的有效净化。
发明内容
本发明目的在于克服现有环境重金属污染净化技术的缺陷，分离得到一株锰氧化菌(芽胞杆菌)。该菌株可以将环境中可溶水的二价锰离子氧化成不溶的锰氧化物沉淀，从而将其从污水中去除，生成的生物 锰氧化物对其他重金属也具有吸附、置换或氧化作用，可应用于净化锰重金属污染的水体。 本发明通过以下技术方案实现-
本发明人分离、筛选到一株锰氧化菌(芽胞杆菌)，该菌株被命名为MK3-1，属芽胞杆菌(5aa7/^sp), 该芽胞杆菌菌株(5a"7/wsp) MK3-1于2008年11月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO: M208237。
本发明的芽胞杆菌MK3-1的筛选方案参见附图1所示。先采取中国天津市西青区玛钢厂锰原料仓库的表 层土壤样品，加一定浓度(见后面的详细描述，下同)MnC12进行富集培养，再对富集培养的土样进行稀 释并涂布含20 mmol/L羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N，-a-hydroxythylpiperazine-N，- ethanesulfanic acid ,简称 HEPES,调pH至7.5)和0.15 mmol/L MnCl2的K固体培养基平板(参照文献:L. G. van Waasbergen et al. Genetic analysis of the marine manganese-oxidizing 5。c/〃us sp. strain SG-1: protoplast transformation, Tn917 mutagenesis, and identification of chromosomal loci involved in manganese oxidation. J Bacteriol' 1993， 175:7594-7603)， 28'C温^f培养一周。挑取表面为棕褐色的菌落划线得单克隆，再用LBB法(W. E. Krumbein et al. A new method for the detection and enumeration of manganese oxidizing and reducing microorganisms. Helgol. Wiss. Meeresunters. 1973, 25:347-356)检测以确定是否为锰氧化菌，再对检测出的锰氧化菌做16S核 糖体RNA基因(16SrDNA)、形态学和功能基因等相关鉴定工作，最终得到芽胞杆菌MK3-1 。
更详细的技术步骤见《具体实施方式
》的举例。 本发明的积极效果是
目前，由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如锰、砷、 汞、镉、钻等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染。本发明分离筛选到的芽胞杆菌MK3-1可以 将二价锰离子氧化成锰氧化物沉淀去除。还可以配合新兴的微生物包埋法治理锰污染。且生物锰氧化物对 其他重金属有很强的吸附、置换和沉淀作用，甚至还可以将毒性强的As(III)氧化成毒性弱的As(V)后吸附 去除(因为As(III)不带电荷，As(V)带负电)。因此，生物锰氧化在水、土壤重金属污染的治理和修复中具有 很高的应用价值。本发明分离的猛氧化菌MK3-1具有潜在的去除其它重金属的能力，且该菌是在锰污染 环境中分离筛选到的，对锰污染环境具有较强的适应性，有望在净化锰污染方面发挥重要作用。
图1:是本发明的技术路线图。
图2:是本发明的芽胞杆菌MK3-1用LBB法鉴定其锰氧化性的结果照片'图中a:蒸馏水+LBB; b:未
接菌的培养基+LBB; c:接芽胞杆菌MK3-1的培养基+LBB。 图3:是本发明的芽胞杆菌MK3-1的扫描电镜照片，放大倍数和比例尺在图中已标明'图中a: 5a"7/w5sp.MK3-l细胞，b:吸附着生物锰氧化物的&d〃船sp.MK3-l细胞。 图4:是本发明的芽胞杆菌MK3-1的菌落形态照片，图中a:在K培养基中；b:在0.15 mmol/L K培养
基中
图5:是本发明的芽胞杆菌MK3-1锰氧化曲线图，图5-a : Sac"/us sp. MK3-1在K培养基中对Mn(II)的 氧化/去除曲线；图5-b制成包埋菌剂的5ac'7/us sp. MK3-1在0.15 mmol/L的MnC12水溶液中Mn(II) 的氧化/去除曲线。注图5-a: + :培养集中剩余的Mn(II)含量；培养集中被吸附的Mn(II) 含量；+锰氧化物中的Mn(II)含量；空白(未接菌的0.15 mmol/L的MnC12 K培养基)；图 5-b MK3-1的菌体浓度；+ : 0.15 mmoI/L MnC12水溶液中剩余的Mn(II)的浓度；+: pH; 空白(未接菌的0.15mmol/L的MnC12水溶液)
具体实施例方式
实施例l:从锰污染土壤中分离并鉴定锰氧化芽胞杆菌MK3-1
(1) 样品采取2007年6月下旬采集中国天津市两青区玛钢厂锰原料仓库的表层土壤样品。
(2) 样品富集取100g的土样，向土样中添加无菌MnCl2溶液使其终浓度为989.55 mg/Kg，轻轻搅匀置 28'C温箱中培养一周，注意补加无菌水，确保样品湿度。
(3) 锰氧化菌分离精确称取经MnCl2富集过的土样10g于装有90ml无菌生理盐水的三角瓶中，置28 t:摇床中振荡半小时，再依次取lml加入到9tnl无齒生理盐水中逐步稀释至10—2, 10—3， IO"4，分别取O.l ml涂布含20 0 1101/1^羟乙基呱嗪乙硫磺酸(]^'4-1^<11"( 3^17^ 6『321加-1^- ethanesulfanic acid ，简称HEPES， 调pH至7.5)和0.15 mmol/L MnCl2的K固体培养基平板(参照文献L. G. van Waasbergen et al. Genetic analysis of the marine manganese-oxidizing sp. strain SG-1: protoplast transformation, Tn917 mutagenesis, and identification of chromosomal loci involved in manganese oxidation. J Bacteriol， 1993, 175:7594-7603)，每个稀释度涂布3个平板，置28'C温箱中培养一周，将表面为棕褐色的菌落定为疑似锰 氧化菌，将平板置4'C冰箱中待用。K固体培养基配方如下酵母膏0.5g，蛋白胨2g，琼脂15g,，人工海 水750mL，补充蒸馏水至1L (人工海水NaCl 17.53g, KC1 0.75g， MgS04*7H20 12.32g， CaCl2 l.llg,补 充蒸馏水至1 L)。
(4) 划线分离将歩骤(3)中得到的疑似锰氧化菌挑取不同的菌落划线，确保得到单克隆，划线用K培 养基平板，待菌长出后放4。C冰箱中待用并用甘油冷冻管保存一份于-8(TC冰箱。
(5) 菌株锰氧化性质鉴定将步骤(4)中得到的单克隆转接到含20mmol/LHEPES(pH7.5)和0.15mmol/L MnCl2K液体培养基中，置28'C摇床中振荡培养'待培养基颜色变为棕褐色时用Berbelin blue-I (LBB, N.N'-Dimethylamino-p,p'-triphenyhnethane-o"-sulphonicacid)按培养基与LBB体积比为l: 3的比例反应检测其 氧化性。若溶液颜色没有变化则说明该菌没有锰氧化性，若颜色由浅蓝色变为深亮蓝色则说明该菌有锰氧化性(见附图2)。 (LBB是氧化还原剂的染色剂，Mn+3 + LBB(reduced) > Mn+2 + LBB(oxidized)，被氧化的 LBB为深亮蓝色)。K液体培养基配方同K固体培养基，只是不含琼脂。LBB的配制方法如下用100ml的 40 mmol/L醋酸水溶液4。C暗处过夜溶解40mg的LBB。
(6)锰氧化菌的分类鉴定 一是利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物 27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')做PCR (PCR具体方法 参见华中农业大学授权发明专利(专利号ZL 200510120584.7,发明名称 一种土壤总DNA小量快速提 取方法)。扩增其16SrDNA并测序，再与国际NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库比对， 核苷酸同源性为98%,鉴定为芽胞杆菌5ac77/"s; 二是利用扫描电镜形态鉴定(见附图3)、革兰氏染色分 析和生长特性鉴定。
菌学特征如下菌体直杆状，长约1.94pm,宽约L29nm，革兰氏阳性菌，适宜生长温度28-30'C，适 宜pH7.6-7.S,在不含MnCl2的K固体培养基上，菌落成圆形，乳白色，凸起，表面湿润，边缘不整齐。 在含0.15mmol/L的MnCl2K培养基上，菌落表面为棕褐色(见附图4);三是与锰氧化相关的多铜氧化酶 基因鉴定，用简并PCR(Chris A. et al. Enzymatic manganese(II) oxidation by metabolically dormant spores of diverse 5aci//us species. Appl Environ Microbiol, 2002,68:874-880)分离出 一段903 bp的基因，将该序列递交 到NCBI GenBank数据库，其注册号为FJ389508。 本发明的芽胞胞菌MK3-1的保藏方法
芽胞胞菌MK3-1可以在K液体或固体培养基(配方同上)上28'C培养，培养后可在4'C下作短期保藏。 若长期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管(参见赵斌，何绍江.微生物学实验.第一版.科学出版社.2002: 202—205)保藏菌株比较合适。 实施例2:芽胞杆菌MK3-1的锰氧化曲线
准备MnCh浓度分别为0 mmol/L和0.15 mmol/L的K培养基各三瓶，接种后28°C, 150 r/min摇床培 养。样品处理步骤如下①每隔24 h取10 mL菌液，12000 r/min离心10 min，上清液用0.2 jxm的滤膜过 滤，滤液中的Mn(II)为培养基中剩余的锰；②离心后菌体用40 mmol/L的CuCP处理10 h以上，待Cu2+ 彻底置换菌液中吸附的Mn2+后'定容到10mL， 12000 r/min离心10 min，将上清用0.2 "m的滤膜过滤， 该滤液中的Mn(II)为被吸附的锰；③离心后沉淀用20 mmol/L的盐酸羟胺处理10h以上'盐酸羟胺将锰氧 化物中的锰还原成Mn2+,定容到10 mL后12000 r/min离心10 min，将上清用0.2 nm的滤膜过滤，此时 滤液中的Mn(II)是锰氧化物中的锰；④原子吸收法测定各滤液中锰含量。绘制的芽胞杆菌MK3-1的锰氧 化曲线见附图5-a。由图5-a显示了 Bacfflw sp. MK3-1在培养基中的除锰能力。该菌锰氧化在第一天就开 始，67.53±2.04%的锰在第4天被去除，其中50.51%±1.67%生成了锰氧化物。在第7天时'除锰量达到最 大值，去除了培养集中96.80%±2.64%的锰，其中77.56%±2.64%是锰氧化物'培养集中锰的终浓度为
60.48mg/L±0.02，已符合《电解金属锰行业清洁生产评价指标体系(试行)》(中华人民共和国国家发展与改 革委员会公告2007年第63号)和《清洁生产标准电解锰行业》(HJ/T357-2007)相关要求。而空白实验中， 培养基中锰含量没有明显变化，说明该实验锰氧化是微生物作用的结果。 实施例3:包埋的芽胞杆菌MK3-1在模拟锰污染水体中锰氧化能力的测定
包埋菌剂(MK3-1)除锰能力测定操作步骤①麸皮预处理麸皮烘干后按与水l:l(w/v)混合，灭菌; ②菌体(MK3-1)按l。/。(g/nl)接种量接到麸皮中(即10g干麸皮接l mL， 1 OD的菌液)，28'C静置培养24 h， 5(TC低温干燥得到固体菌剂；③用聚丙烯(PP)无纺布制成10 cmX20 cm的长方形包埋袋，按实际需要装入 固体菌剂，制成包埋菌剂；④包埋菌剂置20cmX25cmX30cm规格的玻璃缸中，缸内为IO L， 0.15 mmol/L 的MnCl2水溶液，实验在28'C恒温室中进行； 每隔24 h取一次水样，测定锰含量、pH和菌含量。绘制的 去除曲线见附图5-b。由图5-b中可以看出^d//^ sp. MK3-1用含麸皮的PP无纺布包埋制成的包埋菌剂，在 0.15mmol/L的MnCl2水溶液中除锰能力依然稳定，且除锰速度随着细菌量的增加而加快。在第4天去除量 达到峰值，84.80%±0.31%的锰被去除。使水溶液的锰终浓度为0.87 mg/L±0.02,符合《电解金属锰行业清 洁生产评价指标体系(试行)》(中华人民共和国国家发展与改革委员会公告2007年第63号)和《清洁生产 标准电解锰行业》(HJ/T357-2007)相关要求。综上所述，固定的菌体(MK3-1)锰氧能力稳定，能有效去 除水溶液中锰。此外，该方法不仅有效地固定菌体，并且固体菌剂中麸皮残余有机质可以使菌体在投入水 体后仍能增殖，因而这种包埋法可以节省菌剂使用量。本发明中所选用的聚丙
权利要求
1、一株净化重金属污染的芽胞杆菌(Bacillus sp)MK3-1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NOM208237。
2、 权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征是利用所述的芽胞杆菌(5fld//^ sp) MK3-1将二价锰氧化成锰氧化物沉淀，所述的菌株是芽胞杆菌(Bfl"7/w sp)MK3-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO: M208237。
3、 权利要求1所述的芽胞杆菌MK3-1在净化重金属水体污染方面的应用。
4、 权利要求1所述的芽胞杆菌MK3-1在将二价锰氧化成锰氧化物沉淀方面的应 用。
全文摘要
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株具有锰氧化能力的芽胞杆菌MK3-1及其在净化锰污染方面的应用。本发明的特征是从锰污染的土壤中分离得到一株对可溶二价锰有氧化作用的芽胞杆菌MK3-1。该菌株可以将锰污染环境中的二价锰离子氧化成不溶于水的锰氧化物沉淀，从而去除环境中的锰。本发明菌株被命名为芽胞杆菌(Bacillus sp)MK3-1，属于一种锰氧化细菌，其保藏号为CCTCC NOM208237。初步研究表明，本发明的菌株在治理环境重金属水体污染方面具有良好的应用前景。
文档编号C02F3/34GK101429486SQ20081019790
公开日2009年5月13日 申请日期2008年11月27日 优先权日2008年11月27日
发明者刘颜军, 涂书新, 王革娇 申请人:华中农业大学