专利名称：一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用。
背景技术：
水体富营养化已成为全球范围内严重影响水体质量的问题之一。在我国，已发生 富营养化的湖泊面积达5000平方公里，具备发生富营养化条件的湖泊面积达14000平方公 里。因此，对于富营养化的治理已经成为国内外研究学者重点攻克的技术难关之一。大量研究表明，磷是引发水体富营养化的限制性因子。2008年8月，加拿大和美国 的科学家基于长达37年的湖沼学实验研究，在美国《国家科学院院刊》(PNAS)上联合发表 文章，提出了对淡水湖泊富营养化的治理无需控氮而只需控磷的观点。目前针对、污水的除磷方法基本有三种(1)吸附法，利用某些多孔或大比表面积的固体物质对水中磷酸根离子的亲和力 来实现除磷的过程。但吸附法除磷在吸附剂的抗干扰性、溶解损失和再生等方面还存在诸 多问题。由于传统吸附剂吸附容量较低，吸附法作为单独除磷手段目前尚未得到广泛应用， 经常作为辅助手段与其它除磷方法结合使用。(2)化学法，主要是通过投加金属盐化学药剂形成不溶性磷酸盐沉淀物，然后通过 固液分离将其从污水中去除。化学法除磷的优点是除磷效率较高，且稳定可靠，但它的主要 问题是药剂价格昂贵、运行费用较高、产生大量化学污泥、污泥处置的难度大，易造成二次 污染，另外，化学沉淀法除磷的极限值是0. 04mg/L,不能实现对磷的完全去除。(3)生物法，目前生物法除磷主要是通过以下两种独立的机制来完成一种是微 生物和植物同化吸收磷；另一种是活性污泥中的聚磷微生物过量摄磷。生物除磷由于高效且环保，具有巨大的应用前景，但由于对微生物除磷机理的了 解不够，对活性污泥中微生物的组成也不清楚，经常出现运行不稳定的问题，所以目前的生 物除磷技术有待进一步的改进。而且，我国出水中的总磷含量为0. 5或1. 0mg/L(国家废水 排放一级A类及B类排放标准)，远远超过发生富营养化，即“水华”暴发时水体中总磷浓度 的临界值0. (X3mg/L，严重影响生态平衡以及居民的生产和生活。以聚磷菌为主导的生物除磷法具有操作简单、可节约成本、不产生二次污染等的 优点，是研究的热点。由于聚磷菌可以分泌生物酶，在吸收无机磷的同时能够分解污水中的 有机磷而加以吸收，所以具备将出水中总磷含量降至低于0. 03mg/L的潜力。但是，目前分 离得到的聚磷菌种还非常少，利用高效的菌种进行除磷的方法还处于探索阶段，仍远远不 能满足实际应用的需要。而且，对低浓度磷1.0mg/L)的去除在国内外仍未得到足够的 关注，所以利用定性定量方法筛选得到用于低浓度磷去除的高效聚磷菌株，探索其在磷的 进一步去除中的应用具有重要的理论及现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用。
菌株YG46分离自江苏省无锡市太湖的富营养化水体区域的表层沉积物，经鉴定 为施氏假单胞菌O^seudomonas stutzeri)，已于2010年8月18日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号)，菌种保藏号为 CGMCC No. 4093。施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) YG-26CGMCC No. 4093环境适应能力很强，可在较广的温度、pH与盐度范围内生长。施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri) YG-26CGMCC No. 4093 可用于水体除磷。 施氏假单胞菌O3SeudomonaS stutzeri) YG-26CGMCC No. 4093可用于富营养化水体(富营 水体)处理和/或污水处理。施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) YG-26CGMCCNo. 4093 可用于制备污水处理剂和/或富营养化水体处理剂。本发明还保护一种污水处理剂和/或 富营养化水体处理剂，它的活性成分为施氏假单胞菌O^seudomonasstutzeriHGjeCGMCC No.4093。用海藻酸钠和聚乙烯醇包埋施氏假单胞菌O^seudomonas stutzeri) YG-26可得到 固定化菌体。用海藻酸钠与聚乙烯醇(PVA)包埋的固定化菌体有效解决了菌体与污水不易 分离的实际问题，较好地保持了除磷效率并提高了菌体对环境PH的耐受范围。所述固定化 菌体可用于水体除磷。所述固定化菌体可用于富营养化水体处理和/或污水处理。所述固 定化菌体可用于制备污水处理剂和/或富营养化水体处理剂。本发明还保护一种污水处理 剂和/或富营养化水体处理剂，它的活性成分为所述固定化菌体。以上任一所述水体的总磷浓度可为0. 03mg/L以上，具体可为0. 03-1. Omg/L。本发明的的有益效果(1)菌株YG46为一种新的适于低浓度除磷的高效菌种，可 以丰富现有的聚磷菌资源；( 利用固定化菌体进行低浓度磷的去除，固定化小球可多次 使用，在一定程度上节约生产成本，有利于实际应用；(3)菌株YG46最适于去除低浓度磷 (对低浓度磷的去除率菌达97%以上)，环境适应能力强，具有应用到实际污水处理的巨大 潜力；(4)应用菌株YG46进行水体除磷，避免了化学法除磷中由于金属离子的加入而引起 的二次污染，是一种环保高效的除磷方法。菌株YG46及其固定化菌体可以最大限度的去除污水中的磷，从而有效防控水体 富营养化的发生。应用本发明的菌株或固定化菌体进行水体处理，去除率高、方法操作简 单、成本低廉、经济环保、可广泛应用于污水的进一步处理，具有重大的经济、环境和社会效益。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。YG固体培养基(筛选培养基)pH6. 5 ；由水和溶质组成；溶质及其浓度为葡萄糖 (1. Og/L)、酵母浸膏(1. Og/L)、K2HPO4 (0. 3g/L)、KH2PO4 (0. 25g/L)、MgSO4 · 7H20 (0. 2g/L)。YG液体培养基(种子液培养基)pH6. 5 ；由水和溶质组成；溶质及其浓度为葡萄 糖(1. Og/L)、酵母浸膏(1. Og/L)、K2HPO4 (0. 3g/L) ,KH2PO4 (0. 25g/L)、MgSO4 · 7Η20(0· 2g/L)。MOPS 培养基(IOX) :mops 8. 370g，tricine 0. 717g，定容到 44mL，lOmol/L KOH调pH 至 7. 4,0. 01mol/LFeS04lmL，按下列顺序加溶液=NH4Cl (1. 9mol/L)5mL，K2SO4 (0. 276mol/ L) ImL, CaCl2 · 2H20(0. 02mol/L)0. 025mL, MgCl2 · 6H20(2. 5mol/L)0. 21mL, NaCl (5mol/ L) IOmL,微量元素混合液0. 02mL,葡萄糖0. lg，X-Pi 5mg,微量thiamine溶液，定容到 lOOmL。限磷筛选培养基取50mL10XM0PS培养基，置于三角瓶中，加入0. 0087g Κ2ΗΡ04。过磷筛选培养基取50mL10XM0PS培养基，置于三角瓶中，加入0. 173g Κ2ΗΡ04。人工废水pH为6. 5 ；由水和溶质组成；溶质及其浓度为无水乙酸钠(0. 5g/L)、 (NH4)2S04 (0. 2g/L)、MgSO4 · 7H20(0. 4g/L)、CaSO4 (0. 08g/L)、FeSO4 · 7H20(0. 002g/L)、牛肉膏 (0. 22g/L)，按实验需求的初始总磷浓度(磷元素浓度)添加不同量的ΚΗ2Ρ04。液体总磷浓度的测定方法为过硫酸钾消解钼酸铵分光光度法(GB11893-89)。实施例1、施氏假单胞菌G^seudomonas stutzeri) YG-26的发现一、菌株的分离2008年9月采集江苏省无锡市太湖水域样品(表层沉积物)，途中将样品置于 40C以下的冰盒中，带回实验室后称取5g样品放入装有45mL无菌水的三角瓶中，于28 V， ISOrpm摇床振荡lh，待样品均勻分散到无菌水中之后，吸取0. 5mL悬液于装有4. 5mL无菌 水的试管中，混勻，制成浓度分别为IO-1UO-2UO-3UO-4UO-5UO-6的菌悬液，从各浓度悬液 中分别吸取100 μ L涂布于YG固体培养基平板上，每个样品三个重复，恒温培养箱培养 3d。将形态不同的菌落划线纯化，并依次标记为YG-1，YG-2等。将从YG平板上分离纯化后的菌株活化，分别接到限磷和过磷筛选培养基上，300C 培养5d，两种平板上均呈蓝斑的菌落即为初筛的聚磷菌。再将初筛到的聚磷菌接入初始总磷浓度为lmg/L的人工废水中，，180r/min 摇床振荡培养Mh，得到的菌悬液以8000r/min的转速离心lOmin，取上清液测定总磷浓度， 与初始总磷浓度对照，计算除磷率。除磷率=(初始总磷浓度-培养24h后的总磷浓度)/ 初始总磷浓度X100%，其中除磷率最高的菌株YG-26即为目标高效聚磷菌。二、菌株的鉴定YG-26的主要生物学特性革兰氏阴性(G_)，菌体为杆状，兼性厌氧；接触酶、硝酸 盐还原、葡萄糖发酵、反硝化、柠檬酸盐、丙二酸盐反应为阳性，氧化酶、吲哚反应、硫化氢反 应、甲基红实验为阴性。YG-26可在温度为4-37°C的条件下生长，并且可以耐受较广的pH(5. 5-9. 0)与盐 度(0-5% )范围，环境适应能力很强；对数生长末期除磷率最大，可去除初始总磷浓度为 1. Omg/L的水体中97%以上的磷量(处理后水体中的总磷浓度低于引发水体富营养化的极 限值 0. 03mg/L)。YG-26的16S rRNA基因部分序列如序列表的序列1所示。基于YG-26的生理生化分析及16S rRNA基因的同源性比对结果，将YG46鉴定为 施氏假单胞菌O^eudomonas stutzeri)。将YG46保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4093。三、菌株的保存YG16可采用如下两种方式保存(1)利用脱脂牛奶做成冻干管，-70°C保存。
(2)20%甘油保存于-20°〇保存。实施例2、固定化施氏假单胞菌YG46对天然废水的除磷能力一、固定化施氏假单胞菌YG-26的制备海藻酸钠购自国药集团化学试剂公司，目录号301644 ，分子量为222。聚乙烯 醇(PVA)购自国药集团化学试剂公司，目录号30153083，平均聚合度(DP)为M00-2500。 溶液甲(pH6.5)由水和溶质组成；溶质及其浓度为海藻酸钠lg/100mL，聚乙烯醇 2g/100mL。溶液乙(pH6.5):由水和溶质组成；溶质及其浓度为CaC124g/100mL，硼酸 5g/100mL (体积百分含量)。1、将施氏假单胞菌YG46接入YG液体培养基，下ISOrpm振荡培养至对数期 (OD600 = 0.幻。2、取20mL菌液，离心(6000rpm，IOmin)收集菌体，用去离子水清洗两遍。3、将菌体与20mL溶液甲混合，用注射器将混合液勻速滴入4°C预冷的溶液乙中， 然后4°C交联M小时，形成直径3-4mm的小球，用去离子水冲洗小球。二、固定化施氏假单胞菌YG46对人工废水的除磷能力将20g步骤一制备的小球(固定化施氏假单胞菌YG-26)接入200mL人工废水(初 始总磷浓度为1. Omg/L)中，28°C下ISOrpm摇床培养Mh，取上清液检测总磷浓度。进行三次重复实验；每次重复实验中设置10个重复处理，结果取平均值。三次重 复实验中，总磷浓度的结果分别为0. 024mg/L,0. 028mg/L、0. 025mg/L，均低于0. 03mg/Lo三、固定化施氏假单胞菌YG46的重复使用性能1、将20g步骤一制备的小球(固定化施氏假单胞菌YG-26)接入200mL人工废水 (初始总磷浓度为1. Omg/L)中，28°C下ISOrpm摇床培养Mh，取上清液检测总磷浓度。2、将步骤1中的小球回收，用去离子水冲洗小球，然后将小球接入200mL人工废水 (初始总磷浓度为1. Omg/L)中，28°C下ISOrpm摇床培养Mh，取上清液检测总磷浓度。3、将步骤2中的小球回收，用去离子水冲洗小球，然后将小球接入200mL人工废水 (初始总磷浓度为1. Omg/L)中，28°C下ISOrpm摇床培养Mh，取上清液检测总磷浓度。4、将步骤3中的小球回收，用去离子水冲洗小球，然后将小球接入200mL人工废水 (初始总磷浓度为1. Omg/L)中，28°C下ISOrpm摇床培养Mh，取上清液检测总磷浓度。5、将步骤4中的小球回收，用去离子水冲洗小球，然后将小球接入200mL人工废水 (初始总磷浓度为1. Omg/L)中，28°C下ISOrpm摇床培养Mh，取上清液检测总磷浓度。设置10个重复处理，结果取平均值。步骤1的上清液的总磷浓度为0. 019mg/L,步 骤2的上清液的总磷浓度为0. 026mg/L,步骤3的上清液的总磷浓度为0. 025mg/L,步骤4的 上清液的总磷浓度为0. 027mg/L,步骤5的上清液的总磷浓度为0. 028mg/L。结果表明，固 定化施氏假单胞菌YG46连续对人工废水除磷五次，均可使其中的磷浓度低于0. 03mg/L。实施例3、固定化施氏假单胞菌YG46对天然湖水的除磷能力天然湖水取自太湖，总磷浓度为0. 2mg/L0一、固定化施氏假单胞菌YG-26的制备海藻酸钠购自国药集团化学试剂公司，目录号301644 ，分子量为222。聚乙烯 醇(PVA)购自国药集团化学试剂公司，目录号30153083，平均聚合度(DP)为M00-2500。 溶液甲(pH6.5):由水和溶质组成；溶质及其浓度为海藻酸钠lg/100mL，聚乙烯醇2g/100mL。溶液乙(pH6.5):由水和溶质组成；溶质及其浓度为CaC124g/100mL，硼酸 5g/100mL (体积百分含量)。1、将施氏假单胞菌YG46接入YG液体培养基，下ISOrpm振荡培养至对数期 (OD600 = 0 . 4)。2、取IOmL菌液，离心收集菌体，用去离子水清洗两遍。3、将菌体与20mL溶液甲混合，用注射器将混合液勻速滴入4°C预冷的溶液乙中， 然后4°C交联M小时，形成直径3-4mm的小球，用去离子水冲洗小球。二、固定化施氏假单胞菌YG46对天然湖水的除磷能力将IOg步骤一制备的小球接入IOOmL天然湖水中，28°C下180rpm摇床培养Mh，取
上清液检测总磷浓度。进行三次重复实验，每次重复实验中设置10个处理，结果取10个处理的平均值。 三次实验中，总磷浓度的结果分别为0. 018mg/L、0. 022mg/L,0. 02;3mg/L，均低于0. 03mg/Lo实施例4、施氏假单胞菌YG46游离菌体对天然湖水的除磷能力湖水样本甲取自太湖湖区污染较严重的10#标准采样位点，初始总磷浓度为 0. 15mg/L。湖水样本乙取自太湖湖区污染较严重的16#标准采样位点，初始总磷浓度为 0.17mg/L。将湖水样本甲和湖水样本乙分别进行如下处理1、将施氏假单胞菌YG46接入YG液体培养基，下ISOrpm振荡培养至对数期 (0D600 = 0. 4)。2、取IOmL菌液，离心收集菌体，用去离子水清洗两遍。3、将0. Ig湿菌体接入IOOmL天然湖水中，28°C下180rpm摇床培养Mh，取上清液 检测总磷浓度。每个样本进行三次重复实验，每次重复实验中设置10个处理，结果取10个处 理的平均值。湖水样本甲的三次实验中，总磷浓度的结果分别为0. 015mg/L、0. 018mg/L、 0. 016mg/L，均低于0. 03mg/Lo湖水样本乙的三次实验中，总磷浓度的结果分别为0. 013mg/ L、0. 01mg/L、0. 012mg/L，均低于 0. 03mg/L。结果表明，施氏假单胞菌YG46具有应用于污水除磷的巨大潜力。
权利要求
1.施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri) YG-26，其保藏编号为 CGMCC No. 4093。
2.施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri) YG-26CGMCC No. 4093在水体除磷中的应用。
3.施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri) YG-26CGMCC No. 4093在富营养化水体处理 和/或污水处理中的应用。
4.一种污水处理剂和/或富营养化水体处理剂，它的活性成分为施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri)YG-26CGMCC No. 4093。
5.施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri) YG-26CGMCC No. 4093在制备污水处理剂和 /或富营养化水体处理剂中的应用。
6.用海藻酸钠和聚乙烯醇包埋施氏假单胞菌O^seudomonasstutzeri) YG-26CGMCCNo. 4093得到的固定化菌体。
7.权利要求6所述固定化菌体在水体除磷中的应用。
8.权利要求6所述固定化菌体在富营养化水体处理和/或污水处理中的应用。
9.一种污水处理剂和/或富营养化水体处理剂，它的活性成分为权利要求6所述固定 化菌体。
10.权利要求6所述固定化菌体在制备污水处理剂和/或富营养化水体处理剂中的应
全文摘要
本发明公开了一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用。本发明提供的菌株为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YG-26，其保藏编号为CGMCC No.4093。用海藻酸钠与聚乙烯醇包埋的YG-26可得到固定化菌体。菌株YG-26及其固定化菌体可以最大限度的去除污水中的磷，从而有效防控水体富营养化的发生。应用本发明的菌株或固定化菌体进行水体处理，去除率高、方法操作简单、成本低廉、经济环保、可广泛应用于污水的进一步处理，具有重大的经济、环境和社会效益。
文档编号C02F3/34GK102061275SQ201010538869
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月10日 优先权日2010年11月10日
发明者李宝珍, 李海峰, 杨金水, 袁红莉 申请人:中国农业大学