专利名称：一种水体中类固醇污染物的降解方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。本发明涉及微生物环境修复方法，更具体涉及一种水体中类固醇污染物的降解方法。
背景技术：
环境激素(environmental hormone EH)是指人类在生产、生活过程中释放到环境中的某些有毒化学物质，它们与人和动物体内的激素具有类似的化学结构，发挥着类似激素的作用，它们进入体内，扰乱了激素的正常分泌，使人和动物的生理程序发生紊乱，导致生殖、免疫等功能发生障碍。对机体、后代或种群引起可逆性或不可逆性生物学效应的外源性化学物质，也称为“外源性内分泌干扰物”。类固醇激素(Steroid hormone)是环境激素中的主要一类。在众多的环境激素物质中，类固醇类化合物的激素活性大大高于其他环境激素类物质，在极低的浓度条件下就会显示出较强的干扰分泌作用。类固醇激素的污染主要是指类固醇雌激素的污染，天然雌激素(主要是E2和El)和人工合成雌激素(EE2) 是水环境中具有内分泌干扰效应的主要物质，即雌酮、雌二醇、雌三醇等。睾丸酮丛毛单胞菌(Ο/ 浙i^tosterfwi)是一种严格需氧、非发酵的革兰氏阴性杆菌，有极端丛生鞭毛，属于丛毛单胞菌属(Cbffl3MWM)的一个种。在自然界中分布非常广泛，该菌具有降解多种难降解化合物的能力，能够以芳香化合物和类固醇类化合物作为唯一碳源和能源。睾丸酮丛毛单胞菌降解酶基因3 α羟类固醇脱氢酶(3 α _HSD)在降解消化类固醇物质中起关键作用，研究这个基因的调控机理，初步确定3 α -HSD是许多C19-C27类固醇分解代谢途径中的起始酶之一。但利用睾丸酮丛毛单胞菌株降解污染水体中类固醇物质的研究鲜见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水体中类固醇污染物的降解方法，以解决水体中该类物质的污染问题。为了实现上述目的，本发明的水体中类固醇污染物的降解方法采取的技术方案如下
将睾丸酮丛毛单胞菌改良的工程菌株Ρ8制成菌悬液，接种到含有类固醇污染物的水体中，使水体中类固醇污染物降解；所述工程菌株Ρ8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2008年1月25日，保藏号为CGMCC Ν0. 2365。所述降解方法的具体步骤如下
(1)细菌培养取出保存于一 80 °C的工程菌株P8，吸取200 PL加入到装有4 mL LB 液体培养基的灭菌试管中，在30 180 r/min培养条件下恒温摇床12 16h ；将活化的菌株转接到含有抗生素的LB液体培养基中，其中抗生素为添加60 yg/mL Amp，在30。C， 180 r/min条件下恒温摇床培养12 16h ；(2)菌悬液的制备工程菌株P8经培养后，调节其菌液的OD6tltl值为0.95-1. 05，然后在 2000 rpm/min下离心5 min,收集菌体悬浮于重量比为0. 85%的NaCl中制成菌悬液；
(3)调节污染水体的pH值为7.0士0. 5，污染水体的温度25 30°C ；按污染水体体积的0. 5%接种菌悬液，同时进行搅拌或振荡，使水体中的类固醇污染物降解。其中水体中类固醇污染物的浓度需> 0. lng/L。本发明使用的工程菌株P8是tei/P基因高效表达菌，该菌株是在野生菌株 Comamonas testosteroni iei/P基因的上游加入了 iac强启动子，高效表达iei/P基因，与此同时能够大量诱导而-//5 /议的表达；可以从转录调控水平进行定向调控，提高睾丸酮丛毛单胞菌对类固醇化合物和多环芳香烃等环境化学物质的降解能力。本发明的降解方法在接种P8菌株后48士 1 h对类固醇污染物的降解率可以达到 68. 32% 70. 22%。且接种工程菌密度呈指数下降，随着时间的推移活细胞数量越来越少， 最终可达10-100 cfu/L。本发明的优点是成本低、操作简单、降解效率高、适应性强，适用于各种天然水体和人工水体中环境类固醇污染物的降解去除，在类固醇污染环境的生物修复方面具有良好的应用前景。
图1为工程菌株P8对雌酮的降解； 图2为工程菌株P8对雌二醇的降解； 图3为工程菌株P8对雌三醇的降解。
具体实施例方式以下本发明的具体实施例子，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1
1.细菌培养取出保存于一 80 °C的工程菌菌种，吸取200 μ L加入到装有4 mL LB液体培养基的灭菌试管中，在30 180 r/min培养条件下恒温摇床过夜。将活化的菌株转接到含有抗生素的LB液体培养基中(添加60 yg/mL Amp)，在30 °C，180 r/min条件下恒温摇床过夜培养。细菌悬浮液的制备过夜培养的工程菌株，调节其菌液的0D_值为1.0，2000 rpm/min离心5 min,收集菌体悬浮于0. 85%的NaCl中制成菌悬液。对检测到的类固醇污染物富集最低浓度> 0. lng/L的污染水体，调节其pH值为 7. 0士0. 5，按污染水体体积的0. 5%取相应体积的菌悬液，接种工程菌并搅拌或振荡体系， 使水体中类固醇污染物降解。2.闽江福州段污染水体中类固醇物质的降解
2010年5月在闽江福州段洪山桥附近排污口取水样5 L，按上述试验步骤投放P8菌株对水体中类固醇物质进行降解，每隔12 h取样检测水体中雌二醇、雌酮、雌三醇的含量。如图1、图2和图3所示，48 士 1 h后工程菌P8对类固醇污染物主要成分(雌酮、雌二醇、雌三醇)的降解率可以达到68. 32% 70. 22%。
权利要求
1.一种水体中类固醇污染物的降解方法，其特征在于将睾丸酮丛毛单胞菌改良的工程菌株P8制成菌悬液，接种到含有类固醇污染物的水体中，使水体中类固醇污染物降解； 所述工程菌株P8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2008 年1月25日，保藏号为CGMCC NO. 2365。
2.根据权利要求1所述的水体中类固醇污染物的降解方法，其特征在于所述降解方法的具体步骤如下(1)细菌培养取出保存于一80 °C的工程菌株P8，吸取200 μ L加入到装有4 mL LB 液体培养基的灭菌试管中，在30 180 r/min培养条件下恒温摇床12 16h ；将活化的菌株转接到含有抗生素的LB液体培养基中，其中抗生素为添加60 yg/mL Amp，在30。C， 180 r/min条件下恒温摇床培养12 16h ；(2)菌悬液的制备工程菌株P8经培养后，调节其菌液的OD6tltl值为0.95-1. 05，然后在 2000 rpm/min下离心5 min,收集菌体悬浮于重量比为0. 85%的NaCl中制成菌悬液；(3)调节污染水体的pH值为7.0士0. 5，污染水体的温度25 30°C ；按污染水体体积的0. 5%接种菌悬液，同时进行搅拌或振荡，使水体中的类固醇污染物降解。
3.根据权利要求1所述的水体中类固醇污染物的降解方法，其特征在于水体中类固醇污染物的浓度需> 0. lng/L。
全文摘要
本发明提供了一种水体中类固醇污染物的降解方法。所述方法包括将睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)改良的工程菌株P8制成降解菌悬液，接种到含有类固醇污染物的水体中。所述的水体中类固醇污染物的浓度需≥0.1ng/L，pH值为7.0±0.5，温度25～30℃。接种后并搅拌或振荡水体系，使水体中类固醇污染物降解，48±1h后降解率可以达到68.32%～70.22%，且接种工程菌密度呈指数下降，随着时间的推移活细胞数量越来越少，最终可达10-100cfu/L。本发明具有成本低、操作简单、降解效率高、适应性强等优点。
文档编号C02F3/34GK102211823SQ20111009525
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者周以飞, 方盼, 朱秋强, 潘大仁 申请人:福建农林大学