利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法，涉及微生物生态修复技术。本方法是：①将耐镉真菌分离纯化；②将耐镉真菌鉴定；③确定耐镉真菌最适生长条件；④耐镉真菌修复基质制备；⑤修复镉污染土壤。本发明利用镉污染地区优势植物的根际土壤作为耐镉微生物筛选的来源，克服了筛选出的耐镉微生物对修复地土壤环境的适应性问题；应用既有一定能力耐镉性，又与耐镉真菌有兼容性的狗牙根，克服了植物-微生物间的排斥作用；将耐镉真菌接种到锯末中进行施用，确保了微生物生长的养分供应，有效利用了废弃物；成本低廉、操作简便，微生物生长迅速，可大规模繁殖。
【专利说明】利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物生态修复【技术领域】，尤其涉及一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法。
【背景技术】
[0002]镉是毒性最强的重金属元素之一，危害极其严重。土壤中过量的镉会抑制植物的正常生长，在可食部分的残留还会通过食物链影响到人体健康。近年来，镉污染事件频发，广东北江、广西龙江、湖南株洲、湖南浏阳以及日本镉污染大米等事件令人触目惊心。对镉污染土壤的治理也引起了国内外的广泛关注。
[0003]采用工程、物理和化学方法修复镉污染土壤具有一定的局限性，难以大规模处理，并且会导致土壤结构破坏，生物活性下降和土壤肥力退化。农业生态措施其周期太长，效果也不显著。作为新兴的高效生态修复技术——生物修复，以其良好的社会、生态综合效益，易被大众接受，具有广阔的应用前景。其中微生物在修复重金属污染土壤方面具有独特的作用。其主要的作用原理为:微生物可以吸附重金属；微生物可通过改变根际微环境，降低土壤中重金属的毒性或提高植物对重金属的吸收。
[0004]微生物修复具有下列优点:
①不破坏植物生长的土壤环境；
②不会形成二次污染或导致污染物的转移；
③可最大限度地原地降解污染物；
④费用低廉；
⑤操作简便，有效避免操作人员受污染物直接影响；
⑥高效，修复时间短，对周围环境干扰少。
[0005]目前，微生物在修复重金属污染土壤中也存在下列不足之处:
①微生物对土壤的适应性较差；
②微生物与植物的兼容性较低；
③微生物存活率低。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法。
[0007]本发明的目的是这样实现的:
1、基本思路
对镉污染土壤优势植物的根际土壤中的微生物进行耐镉筛选，选取耐镉性最强的微生物进行分离纯化，再将其添加到镉污染土壤中，以提高其耐镉性。
[0008]2、本方法包括下列步骤:
①将耐镉真菌分离纯化； ②将耐铺真囷鉴定；
③确定耐镉真菌最适生长条件
A、生长曲线绘制；
B、最适生长温度确定；
C、最适pH的确定；
④耐铺真菌修复基质制备；
⑤修复镉污染土壤。
[0009]本发明具有下列优点和积极效果:
①利用镉污染地区优势植物的根际土壤作为耐镉微生物筛选的来源，克服了筛选出的耐镉微生物对修复地土壤环境的适应性问题；
②应用既有一定能力耐镉性，又与耐镉真菌有兼容性的狗牙根，克服了植物-微生物间的排斥作用；
③将耐镉真菌接种到锯末中进行施用，确保了微生物生长的养分供应，有效利用了废弃物；
④成本低廉、操作简便，微生物生长迅速，可大规模繁殖。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例详细说明:
一、方法
①将耐镉真菌分离纯化
选取IOg中国株洲重金属污染区狗牙根根际土壤置于三角瓶中，无菌条件下，加入适量玻璃珠和90ml无菌水，在旋转式摇床150rpm、30°C振荡30min，以使微生物从土壤中充分洗脱，然后静置20min，吸取上清液用无菌水稀释100倍，即为土壤菌悬液；取Iml上清液均匀涂布到镉浓度为50mg/L的固体平板上(牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏琼脂培养基、高氏一号培养基)，待菌落长成后，利用平板划线分离法接种到镉浓度为100、150、200mg/L的固体培养基中，30°C培养；将耐镉能力最强的菌落选出，对其单菌落连续4次采用平板划线分离法进行纯化；
②将耐镉真菌鉴定
将耐镉能力最强的菌株接种至装有30ml液体培养基(马丁氏琼脂培养基)的离心管中(50ml)振荡培养一天，8000rpm离心IOmin,倒掉上清液并加入无菌水重复离心2次后取出沉淀，在无菌条件下利用真菌DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，提取产物利用PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶产物切割回收并纯化后利用真菌ITS序列测序，测序结果提交至Gene Bank并利用BLAST进行序列比对，利用序列相似性确定真菌的种属关系；
③确定耐镉真菌最适生长条件
采用比浊法测定菌悬液浓度来确定生长曲线、最适生长温度及最适pH值；
具体步骤为:
A、生长曲线绘制
将Iml菌悬液接种到新配制并灭菌的25ml马丁氏液体培养基中，加入无菌的镉溶液(CdN03形式)，使其最终浓度为1.5mM,以不加镉为对照，分别于2、4、8、12、24、48、60、72h取样5ml，用紫外-可见分光光度计于600nm波长测定吸光度值，每个样品重复三次，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线；
B、最适生长温度的确定
将Iml菌悬液接种到新配制并灭菌的25ml马丁氏液体培养基中，分别于15、20、25、30、35、40°C下振荡培养36h,取样5ml,三次重复,测定吸光度值,最终确定该真菌菌株最适生长温度为30°C ；
C、最适pH的确定
将Iml菌悬液接种到新配制并灭菌的25ml马丁氏液体培养基中，精确调整培养液pH值至4、5、6、7、8，在30°C下振荡培养36h，取样5ml，三次重复，测定吸光度值，最终确定该真菌菌株最适PH值为pH6.0 ；
④耐镉真菌修复基质制备
采用浇灌法将耐镉真菌-棘孢曲霉接种到锯木屑中培养，调节pH值至6.0，在30°C培养两天，然后再次浇灌棘孢曲霉接种液，以确保接种成活率；
⑤修复镉污染土壤
将接种有棘孢曲霉的锯末施入镉污染土壤；
可有效降低土壤中镉对植物的毒害以及促进镉在狗牙根根部积累，减少向地上部的运输。
[0011]二、实施例1、实施例一
将狗牙根种植在已高温高压灭菌、未受镉污染的土壤中，30°c培养，每隔2天用耐镉微生物(棘孢曲霉)菌悬液浇灌，共浇灌7次，并以不接种微生物为对照。研究发现，土壤中棘孢曲霉为优势菌群大量存在，接种棘孢曲霉后，狗牙根植株和根系与对照相比无显著差异，未出现病变现象，且生长和蒸腾速率均未受到影响，同时发现在接种5次后蒸腾速率高于对照，表现出一定的生长促进作用。
[0012]2、实施例二
将狗牙根种植于已高温高压灭菌、未受镉污染的土壤中，用2mM CdSO4(由l/2Hoagland营养液配置)溶液浇灌，接种棘孢曲霉真菌菌株，在可控条件下(30°C )培养7天，测定土壤中微生物数量，狗牙根生长速率、蒸腾速率、草坪质量、叶绿素含量等指标；然后继续提高胁迫浓度至4mM，培养7天后测定上述指标，依次类推(每次递增2mM)直至胁迫浓度达到IOmM ；结果发现，在5个浓度的土壤中棘孢曲霉均为优势菌群，数量显著多于其他微生物；随着胁迫浓度的递增，狗牙根生长速率、草坪质量、叶绿素含量等指标略高于对照，未达到显著水平；镉含量分析表明:土壤中有效镉含量降低，狗牙根根部镉含量上升，地上部镉含量下降。
[0013]3、实施例三
将狗牙根种植于已高温高压灭菌、未受镉污染且添加有耐镉真菌修复基质的土壤中，用2mM CdSO4 (由0.5xHoagland营养液配置)溶液浇灌，接种棘孢曲霉真菌菌株，在可控条件下(30°C )培养7天，测定土壤中微生物数量，狗牙根生长速率、蒸腾速率、草坪质量、叶绿素含量等指标；继续提高胁迫浓度至4mM，培养7天后测定上述指标，依次类推(每次递增2mM)直至胁迫浓度达到IOmM ;结果发现，在5个浓度的土壤中棘孢曲霉均为优势菌群，数量显著多于其他微生物；随着胁迫浓度的递增，狗牙根的生长速率、草坪质量、叶绿素含量等指标均显著高于对照；镉含量分析表明:土壤中有效镉含量降低，狗牙根根部镉含量上升，地上部镉含量下降。
【权利要求】
1.一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法，其特征在于: ①将耐镉真菌分离纯化； ②将耐铺真囷鉴定； ③确定耐镉真菌最适生长条件 A、生长曲线绘制； B、最适生长温度确定； C、最适pH的确定； ④耐铺真菌修复基质制备； ⑤修复镉污染土壤。
2.按权利要求1所述的一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法，其特征在于所述的步骤①: 选取IOg中国株洲重金属污染区狗牙根根际土壤置于三角瓶中，无菌条件下，加入适量玻璃珠和90ml无菌水，在旋转式摇床150rpm、30°C振荡30min，以使微生物从土壤中充分洗脱，然后静置20min，吸取上清液用无菌水稀释100倍，即为土壤菌悬液；取Iml上清液均匀涂布到镉浓度为50mg/L的固体平板上，待菌落长成后，利用平板划线分离法接种到镉浓度为100、150、200mg/L的固体培养基中，30°C培养；将耐镉能力最强的菌落选出，对其单菌落连续4次采用平板划线分离法进行纯化。`
3.按权利要求1所`述的一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法，其特征在于所述的步骤②: 将耐镉能力最强的菌株接种至装有30ml液体培养基的离心管中振荡培养一天，8000rpm离心IOmin,倒掉上清液并加入无菌水重复离心2次后取出沉淀,在无菌条件下利用真菌DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，提取产物利用PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶产物切割回收并纯化后利用真菌ITS序列测序，测序结果提交至Gene Bank并利用BLAST进行序列比对，利用序列相似性确定真菌的种属关系。
4.按权利要求1所述的一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法，其特征在于所述的步骤③: 采用比浊法测定菌悬液浓度来确定生长曲线、最适生长温度及最适pH值； 具体步骤为: A、生长曲线绘制 将Iml菌悬液接种到新配制并灭菌的25ml马丁氏液体培养基中，加入无菌的镉溶液，使其最终浓度为1.5mM,以不加镉为对照，分别于2、4、8、12、24、48、60、72h取样5ml，用紫外-可见分光光度计于600nm波长测定吸光度值,每个样品重复三次，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线； B、最适生长温度的确定 将Iml菌悬液接种到新配制并灭菌的25ml马丁氏液体培养基中，分别于15、20、25、30、`35、40°C下振荡培养36h,取样5ml,三次重复,测定吸光度值,最终确定该真菌菌株最适生长温度为30°C ； C、最适pH的确定 将Iml菌悬液接种到新配制并灭菌的25ml马丁氏液体培养基中，精确调整培养液pH值至4、5、6、7、8，在30°C下振荡培养36h，取样5ml，三次重复，测定吸光度值，最终确定该真菌菌株最适PH值为pH6.0。
5.按权利要求1所述的一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法，其特征在于所述的步骤④: 采用浇灌法将耐镉真菌-棘孢曲霉接种到锯木屑中培养，调节pH值至6.0，在30°C培养两天，然后再次浇灌棘孢曲霉接种液，以确保接种成活率。
6.按权利要求1所述的一种利用耐镉真菌在镉污染土壤中进行生态修复的方法，其特征在于所述的步骤⑤: 将接种有棘孢曲霉的锯末施入镉污染土壤。
【文档编号】B09C1/10GK103551379SQ201310538617
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】傅金民, 罗宏基, 娄燕宏 申请人:中国科学院武汉植物园