一种粘土矿物与腐殖酸协同促进生物还原硝基苯的方法与流程

本发明属于污染物生物处理技术领域，提供了一种应用粘土矿和腐殖酸协同促进微生物还原硝基苯的方法。

背景技术：

硝基苯是苯环上的一个氢原子被硝基取代而生成的化合物，分子式为C6H5NO2，又名密斑油、苦杏仁油。通常作为染料、炸药、橡胶、农药等有机物合成中间体或制作苯胺的原料而广泛存在于染料、农药、医药、石油化工等行业的废水中。硝基苯属于难降解有机化合物，化学性质稳定，对生物具有致癌性和致突变性，在进入环境后造成对水体和土壤持久性的污染。因此，硝基苯废水的污染治理一直受到人们的关注。

目前，处理硝基苯废水的主要途径包括生物法、化学法、物理法及其组合工艺。微生物在厌氧条件下可以还原转化硝基苯生成苯胺，而后在好氧条件下进一步实现完全矿化。

腐殖酸作为一种天然有机质广泛地存在于自然环境中，并且易于从水体、土壤以及底泥中提取出来。研究表明，腐殖酸能够促进细菌胞外电子传递，显著提高微生物还原硝基苯等污染物的速率。Liu G等在2013年World Journal of Microbiology and Biotechnology第29卷第1723-1730页、Cervantes FJ等在2012年Applied Microbiology&Biotechnology第97卷第2671-2679页、Liu G等在2011年Applied Microbiology&Biotechnology第91卷第417-424页以及Luan F等2010年在Environmental Science&Technology第44卷第184-190页发表的论文都报道了在腐殖酸存在条件下，偶氮染料、硝基苯等污染物的生物还原得到促进。

粘土矿物广泛存在于土壤和沉积物中，是一种重要的含铁矿物。不同于铁(氢)氧化物矿物，蒙脱石等粘土矿物中的三价铁存在于矿物的层间结构中，并且能够被异化金属还原菌等微生物还原为二价铁。Luan F等2015年在Environmental Science&Technology第49卷第1418-1426页报道了含铁粘土矿物的加入能够促进硝基苯的生物还原。

综上，腐殖酸和含铁粘土矿物各自都可作为强化介体促进硝基苯的生物还原。Luan F等2010年在Environmental Science&Technology第44卷第184-190页发表的论文报道了腐殖酸和铁氧化物赤铁矿协同促进生物还原硝基苯。然而，微生物还原赤铁矿产生的二价铁以Fe²⁺形态游离在溶液中，极易消耗和流失，难以重复利用。而生物还原粘土矿物所产生的二价铁主要存在于粘土矿物的层状结构中，不会轻易释放，有望被持续循环利用。根据Wang K等2005年在Journal of Environmental Quality第34卷第3420-349页发表的论文中报道，粘土矿能够吸附腐殖酸。通过粘土矿对腐殖酸的吸附作用，有望减缓腐殖酸流失，提高促进效果的稳定性。目前，尚未见有关腐殖酸和粘土矿物协同促进微生物还原硝基苯的报道。

采用粘土矿物与腐殖酸协同促进生物还原硝基苯，进一步强化生物还原硝基苯速率，效果稳定并可多次循环使用。粘土矿物与腐殖酸皆为天然土壤组分，分布广泛，价廉易得，便于在实际中推广应用。

技术实现要素：

为解决生物处理硝基苯废水效率低下以及腐殖酸和Fe²⁺等强化介体易流失、循环利用率低等问题，本发明提供一种应用粘土矿物和腐殖酸协同促进生物还原硝基苯的方法。相比于粘土矿物和腐殖酸各自单独作用的情况，该方法对硝基苯生物还原的促进效果更佳，且两种物质具有分布广泛，价廉易得，循环利用率高等特点。

本发明的技术方案：

一种粘土矿物与腐殖酸协同促进生物还原硝基苯的方法，步骤如下：

(A)微生物的培养：采用异化金属还原菌Shewanella oneidensis MR-1作为还原硝基苯和含铁粘土矿物的微生物；

(B)向10-20mmol/L哌嗪-N,N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲溶液中加入10-20mmol/L乳酸钠，乳酸钠作为电子供体，转移至玻璃血清瓶中，同时调节pH至6.8-7.2；然后通入氮气曝气至血清瓶顶空及水溶液中的氧气排尽，灭菌，冷却，转移至厌氧状态；

(C)在厌氧状态下，将硝基苯添加到血清瓶中，超声至硝基苯分散均匀，硝基苯在混合溶液中的浓度为30mg/L；

(D)在厌氧状态下，将10g/L的粘土矿物添加至血清瓶中，粘土矿物的浓度为0.1g/L；所述的粘土矿物为绿脱石类粘土矿物；

(E)用1mol/L的NaOH将腐殖酸溶液的pH调节至6.8-7.2，并通过0.45μm滤膜过滤，得到滤液；在厌氧状态下，将除氧后的腐殖酸溶液加入至血清瓶，腐殖酸的浓度为50mg/L；将血清瓶放入150rpm、30℃恒温摇床中震荡24h以上，使粘土矿物与腐殖酸混合均匀，吸附平衡；

(F)收集培养至对数期末期的微生物细胞，并转移至血清瓶中，使微生物细胞的浓度为0.25g/L；然后，将血清瓶放入150rpm、30℃恒温摇床中，避光反应1-3d；

(G)待硝基苯还原完全后，在厌氧状态下，补加硝基苯至浓度为30mg/L，探究粘土矿物与腐殖酸协同促进生物还原硝基苯的循环应用效果。

本发明所述的粘土矿物经过研磨过筛后，在使用前将矿物颗粒于0.01M NaCl溶液中充分搅拌，使其均匀分散，同时使粘土矿物Na⁺饱和，提高其对腐殖酸的吸附性能。

本发明的有益效果是粘土矿物和腐殖酸共存体系能够协同促进硝基苯的生物还原，表现优于粘土矿物和腐殖酸各自单独存在时的促进效果，且具有良好的重复利用性，强化了对硝基苯的生物处理。本方法所使用的粘土矿物和腐殖酸成本低廉、来源广泛，便于在实际中推广应用。

附图说明

图1是粘土矿物和腐殖酸分别单独存在及两者共存条件下对生物还原硝基苯的影响。

图2是不同体系中生物还原硝基苯的准一级动力学拟合。Ct和C0:分别代表t时刻和零时刻体系中的硝基苯浓度。

图3是重复利用性实验中实验组和对照组各循环周期初始12h硝基苯还原速率的比较。

图4是重复利用性实验中实验组和对照组各循环周期60h时硝基苯还原程度的比较。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1

粘土矿物NAu-2与腐殖酸ESHA协同促进微生物还原硝基苯：

(1)微生物的培养：采用大豆培养基培养S.oneidensis MR-1作为还原硝基苯的菌种。在121℃的条件下高压蒸汽灭菌培养基溶液。在无菌操作台内将S.oneidensis MR-1接种至大豆培养基，接种比例为1:100；接种后的培养基在30℃，150rpm恒温摇床中培养24h，得到对数生长期末期的S.oneidensis MR-1菌液备用。

(2)配制10mmol/L PIPES缓冲溶液，加入10mmol/L乳酸钠，并转移至50mL血清瓶中，同时调节pH至6.8-7.2。通氮气曝气将血清瓶顶空及水溶液中的氧气排尽，并放入厌氧箱中以确保厌氧状态。

(3)在厌氧箱中，取0.03g硝基苯加入PIPES缓冲溶液中，定容至100mL以制备硝基苯贮备液。将贮备液超声震荡，使硝基苯分散均匀。用移液枪吸取3mL硝基苯贮备液加入血清瓶中，反应体系中硝基苯浓度为30mg/L。

(4)称取0.1g粘土矿物NAu-2加入10mL PIPES缓冲溶液中，充分搅拌制成粘土矿物贮备液。在厌氧箱中转移0.3mL NAu-2贮备液至血清瓶中，反应体系中粘土矿物浓度为0.1g/L。

(5)称取0.03g腐殖酸ESHA溶解于60mL水中，充分搅拌制成腐殖酸贮备液，并调节pH至6.8-7.2。吸取3mL腐殖酸贮备液，在厌氧箱中转移至血清瓶，反应体系中所含腐殖酸浓度为50mg/L。将血清瓶放入150rpm，30℃恒温摇床中震荡24h，使粘土矿物与腐殖酸混合均匀，吸附平衡。

(6)收集培养至对数期末期的MR-1细胞，并转移至血清瓶中，使细菌细胞浓度达0.25g/L。然后，将血清瓶放入150rpm，30℃恒温摇床中，避光反应60h。每12h取样一次，采用高效液相色谱法检测硝基苯浓度变化。所有实验均平行开展3次，同时分别设置只有MR-1细胞及仅加入粘土矿物和仅加入腐殖酸的生物还原硝基苯对照实验。

图1是实施例1中实验组和对照组硝基苯还原结果。结果表明未加粘土矿物和腐殖酸或仅加入粘土矿物、仅加入腐殖酸的对照组，反应12h后硝基苯浓度分别减少了7.8、9.8和13.9mg/L；反应60h后硝基苯浓度基本稳定，硝基苯去除率分别为66％、76％和93％。粘土矿物或腐殖酸的加入均会不同程度促进生物对硝基苯的还原。而在粘土矿物与腐殖酸共存的实验组，反应12h后硝基苯浓度减少了19.2mg/L，相比于仅加粘土矿物或腐殖酸的对照组分别提升了96％和38％，优势明显。

图2是实施例1中实验组和对照组生物还原硝基苯的准一级动力学拟合。MR-1细胞直接还原硝基苯和单独加入粘土矿物或腐殖酸的对照组一级反应速率常数kobs分别为1.8×10^-2h^-1(r²＝0.972)、4.2×10^-2h^-1(r²＝0.983)和2.6×10^-2h^-1(r²＝0.973)；而粘土矿物和腐殖酸共存的实验组的kobs为5.1×10^-2h^-1(r²＝0.992)，分别是三个对照组的2.8倍、1.2倍和2.0倍，还原反应速率显著提高。

实验结果表明粘土矿物与腐殖酸共存体系对S.oneidensis MR-1还原硝基苯有明显的促进作用，且表现优于仅加入粘土矿物或仅加入腐殖酸条件下的生物还原效果。

实施例2

利用粘土矿物与腐殖酸协同促进生物还原硝基苯的循环应用。

(1)配制10mmol/L PIPES缓冲溶液，加入10mmol/L乳酸钠后转移至50mL血清瓶中，并调节pH至6.8-7.2。通氮气曝气将血清瓶顶空及水溶液中的氧气排尽，并放入厌氧箱中以确保厌氧状态。

(2)在厌氧箱中，用移液枪吸取3mL硝基苯贮备液(制备方法见实施例1)加入血清瓶中，反应体系中硝基苯浓度为30mg/L。

(3)在厌氧箱中吸取粘土矿物贮备液0.3mL转移至血清瓶，反应体系中粘土矿物浓度为0.1g/L。

(4)在厌氧箱中吸取3mL腐殖酸贮备液转移至血清瓶，反应体系中腐殖酸浓度为50mg/L。而后将血清瓶放入150rpm，30℃恒温摇床中震荡24h，使粘土矿物与腐殖酸混合均匀，吸附平衡。

(5)收集培养至对数期末期的微生物细胞，并转移至血清瓶中，使细菌细胞浓度为0.25g/L。

(6)将血清瓶放入150rpm，30℃恒温摇床中，避光反应60h。每12h取样一次，采用高效液相色谱法检测硝基苯浓度变化。所有实验均平行开展3次，同时分别设置仅有MR-1细胞及仅加入粘土矿物和仅加入腐殖酸的生物还原硝基苯对照实验。

(7)待实验组硝基苯还原反应完全后，根据液相色谱法检测的残余硝基苯浓度，在厌氧箱中向反应体系重新补充加入硝基苯，使其浓度恢复至30mg/L。每隔12h取样测定硝基苯浓度。重复步骤(6)、(7)，循环3个周期。

图3是实施例2中实验组和对照组各循环周期中初始12h硝基苯还原速率的比较。结果表明，粘土矿物和腐殖酸共存体系各周期生物还原硝基苯的初始还原速率始终比仅加入粘土矿物和仅加入腐殖酸的对照组高64％-94％和14％-37％，重复促进效果稳定。

图4是实施例2中不同循环周期实验组和对照组中60h时硝基苯还原程度的比较。结果表明，各循环周期中粘土矿物和腐殖酸共存体系硝基苯的还原率均达到80％以上，有良好的重复利用性。且相比仅加入粘土矿物和仅加入腐殖酸的对照组，粘土矿物和腐殖酸共存体系对硝基苯还原程度的提升效果随着循环次数的增加而愈发显著。

实验表明粘土矿物与腐殖酸的共存体系具有稳定的循环促进效果，，可重复应用于促进生物还原硝基苯。