本发明属于PAHs(多环芳烃)污染土壤修复领域，涉及一种利用化学氧化-厌氧微生物联合方法降解土壤中PAHs(多环芳烃)污染物的方法，属于化学氧化-微生物原位修复技术。
背景技术：
PAHs(多环芳烃)是工业场地常见的持久性有机污染物，因其具有致癌、致畸和基因毒性而被美国国家环境保护署列入优先控制污染物清单。原位化学氧化主要是通过向地下水或土壤注入化学氧化剂(如臭氧、高锰酸盐、Fenton(类)试剂和活化的过硫酸盐等)，发生反应从而降解目标污染物。PAHs(多环芳烃)污染土壤的化学氧化降解因修复效率高，对污染物的类型不敏感等优点而被广泛应用。
其中，Fenton(类)试剂处理是修复PAHs(多环芳烃)污染土壤常用的方法。但是单独应用Fenton氧化会造成一系列的后续问题：由于土壤与含水层的非均质导致反应物输送不均匀，未氧化的PAHs(多环芳烃)与反应中间产物仍然残留于土壤环境中。现场应用这一方法时为了满足修复目标需要注入大量的化学药剂，这样不仅使修复成本大幅度提高，而且过量的氧化剂对土壤环境的破坏导致植物与微生物生长困难，土地利用困难。目前，许多基于 Fenton试剂的联合方法(如生物(微生物)-Fenton)因其能够以较低成本、较低扰动的方法降解PAHs(多环芳烃)而被广泛研究，并成功应用于修复PAHs(多环芳烃)污染场地。
然而这些研究方法主要集中于化学氧化与好氧微生物的联合应用，而不是厌氧降解。但是PAHs(多环芳烃)污染主要蓄积在深层土壤中，深层土壤往往处于厌氧或缺氧状态，PAHs (多环芳烃)的厌氧降解在深层土壤中的作用不可忽视。
技术实现要素：
本发明针对化学氧化或者微生物修复技术单独使用、以及化学氧化与好氧微生物的联合修复技术等方法的局限性，提供一种化学氧化-厌氧微生物联合方法修复PAHs(多环芳烃) 污染土壤的方法。
本发明的技术方案如下：
一种利用化学氧化-厌氧微生物联合方法降解土壤中多环芳烃污染物的方法，包括如下步骤：
(1)对PAHs(多环芳烃)污染土壤进行化学预氧化处理；
(2)对经过化学预处理的PAHs(多环芳烃)污染土壤进行厌氧微生物培养。
其中，步骤(1)以类Fenton试剂为氧化剂进行土壤氧化预处理，优选的，以过氧化氢为氧化剂进行土壤氧化预处理，优选的，所述氧化剂的剂量为150mL过氧化氢(10％，w/w) /100g土壤。
其中，步骤(2)中，还包括向污染土壤中添加电子受体和/或营养盐。
其中，步骤(2)中电子受体为硝酸盐，优选的，所述电子受体为NO3-(NaNO3)。
其中，在步骤(1)之后，对于经过化学预氧化处理的PAHs(多环芳烃)污染土壤，以原场地经过多年自然驯化的土著微生物为接种微生物，进行微生物扩增，利用土著微生物降解土壤中的PAHs(多环芳烃)污染。
本发明的修复方法结合了化学氧化与厌氧微生物降解两种方法的优势，首先在较短时间内将土壤中高浓度PAHs(多环芳烃)降解，其次在较温和的条件下降解PAHs(多环芳烃)，解决化学氧化后土壤中污染物的拖尾问题。联合修复方法在降低修复费用的同时能够获得比这两种方法单独使用更高的修复效率。且其中所用电子受体为NO3-(NaNO3)，应用于现场修复时不会对污染场地的土壤造成巨大扰动，有很好的应用前景。
附图说明
图1是厌氧培养后土壤中三环PAHs(多环芳烃)的保留率图；
图2是厌氧培养后土壤中四环PAHs(多环芳烃)的保留率图；
图3是厌氧培养后土壤中五环和六环PAHs(多环芳烃)的保留率图；
图4是各处理组中PAHs(多环芳烃)总量化学预氧化与厌氧微生物降解效果图；
图5是硝酸盐和营养盐对14种PAHs(多环芳烃)化学预氧化与厌氧微生物降解效果图。
具体实施方式
本发明采用的一个具体技术实施方案包括如下步骤：
1)实验土壤的采集与准备：选取某一典型焦化场地，采集地下3-4米处土壤，过2mm筛后密封保存于4℃条件下备用。
2)用过氧化氢氧化土壤样品：取100g土壤和150mL(10％，w/w)过氧化氢放置于1L烧杯中，并用磁力搅拌器搅拌使土壤充分氧化，得到氧化的土壤样品。
3)接种微生物：氧化后的土壤样品中添加10％(w/w)未氧化土壤，并混合均匀，得到接种的土壤样品。
4)土壤厌氧装样：在充满氮气的手套箱(厌氧环境)中，将氧化后土壤和接种后土壤转移至配有聚四氟乙烯衬里的丁基橡胶塞和铝制密封盖的50mL血清瓶中，添加电子受体和营养盐后立即压盖、密封。
5)土壤恒温厌氧培养：将血清瓶从手套箱中移出，并转移至恒温培养箱中恒温(30℃) 避光培养。
6)土壤样品分析测试：在第0天和180天分别测试土壤中PAHs(多环芳烃)的含量以评估PAHs(多环芳烃)的降解效果。其中，测试所用设备为气相色谱-质谱仪(安捷伦 7890B-5977A)。色谱条件：载气：高纯氦气，流速1.2mL/min；检测器进样口温度290℃；分流进样(分流比10∶1)。升温程序：起始温度40℃，进样后保持2min，随后的程序加热以2 个梯度完成升温，第一梯度以10℃/min升温至240℃，保持3min；第二梯度以5℃/min升温至320℃，保持10min；溶剂延迟8.00min。质谱条件：电子轰击(EI)离子源，电子轰击能量70eV，离子源温度290℃。
在上述实验步骤，以NO3-(NaNO3)为电子受体，研究过氧化氢预处理后土壤中PAHs (多环芳烃)降解情况，结果如图1-5所示，实验中对接种土壤和未接种土壤分别设置4个处理：
1)CK：土壤+去离子水；
2)CY：土壤+营养盐；
3)CN：土壤+去离子水+硝酸根(2000mgkg-1)；
4)YN：土壤+营养盐+硝酸根(2000mg kg-1)。
每个处理重复6次，第0天和180天随机取3瓶进行土壤中PAHs(多环芳烃)测试分析。
图1是厌氧培养后土壤中三环PAHs(多环芳烃)的保留率图。
图1说明过氧化氢预处理后土壤中的PAHs(多环芳烃)在不采取任何措施(例如，增加微生物数量或提供电子受体)的情况下，在较短的时间尺度内(如180天)难以厌氧降解。且单独添加营养盐或电子受体不能显著促进这些PAHs(多环芳烃)的降解。然而，在同时添加营养盐和电子受体的处理中，对于未接种土壤，三环PAHs(多环芳烃)除了蒽(图1(d)) 发生了显著降解；对于接种土壤，三环PAHs(多环芳烃)均发生了显著降解。这说明同时添加营养盐和电子受体(NO3-)就能够促进三环PAHs(多环芳烃)的降解，且接种微生物能够进一步提高三环PAHs(多环芳烃)的降解率。
图2是厌氧培养后土壤中四环PAHs(多环芳烃)的保留率图。
图2表明部分四环PAHs(多环芳烃)(荧蒽和芘)的降解规律与三环PAHs(多环芳烃) 类似。同时添加电子受体和营养盐的土壤中荧蒽和芘发生了明显的降解，且接种微生物进一步提高了这两种PAHs(多环芳烃)的降解率。其余的四环PAHs(多环芳烃)(苯并[a]蒽和屈)均未发生明显的降解，且各个处理之间无明显差异(P＜0.05)。
图3是厌氧培养后土壤中五环和六环PAHs(多环芳烃)的保留率图。
图3表明厌氧培养180天后，五环和六环PAHs(多环芳烃)均未发生明显的降解，且各个处理之间无显著差异(P＜0.05)。说明化学氧化-厌氧微生物联合方法不能促进氧化后土壤中五环和六环PAHs(多环芳烃)的降解。
图4是各处理组中PAHs(多环芳烃)总量化学预氧化与厌氧微生物降解效果图。
从图中可以看出，过氧化氢处理后土壤中PAHs(多环芳烃)降解了60％左右。经过180 天的厌氧培养后，接种土壤中PAHs(多环芳烃)去除率进一步提高(15％左右)，且同时添加营养盐和电子受体(NO3-)的土壤中PAHs(多环芳烃)降解最明显。
图5是硝酸盐和营养盐对14种PAHs(多环芳烃)化学预氧化与厌氧微生物降解的效果图。
图5表明厌氧培养结束后，三环PAHs(多环芳烃)发生了明显的降解，降解率在12.15％和18.02％之间；部分四环PAHs(多环芳烃)(荧蒽和芘)也发生了明显的降解(＜19％)；然而，五环和六环PAHs(多环芳烃)并未发生显著降解。