一种强化铁还原菌耦合钝化纳米零价铁体系的方法与流程

本发明涉及材料耦合细菌增强反应活性的技术领域，具体涉及的是氧化石墨烯负载纳米零价铁复合材料的制备，及氧化石墨烯介导强化希瓦氏菌耦合钝化纳米零价铁体系方法的构建。

背景技术：

20世纪80年代起，零价铁作为一种有效的脱卤还原剂受到人们广泛关注。近年来研究发现，纳米零价铁作为零价铁的一种特定形态，具有颗粒小、比表面积大的特点，可以对多种有机卤化物进行还原脱卤，包括三氯乙烯(tce)、4-氯酚、五氯酚(pcp)、四溴双酚a(tbbpa)、六溴环十二烷(hbcd)等。

但是由于纳米零价铁表面活性较高，容易被氧化，其表面会生成一层氧化膜，主要成分为三氧化二铁或四氧化三铁，以及少量绿锈等其它铁氧化物阻碍电子传递，使得反应活性降低。传统的螯合剂例如edta(乙二胺四乙酸)、nta(氨三乙酸)与纳米零价铁螯合一经广泛使用可能会导致环境中的二次污染问题，也有专家学者基于异化铁还原菌在厌氧条件下能够还原铁氧化物的前提下提出在纳米零价铁反应器中加入异化铁还原菌解决纳米零价铁表面氧化膜。其中异化铁还原菌利用纳米零价铁表面的fe(ⅲ)氧化物作为最终电子受体进行厌氧呼吸，经生物还原形成次生矿物(针铁矿、赤铁矿、磁铁矿等)。

但由于在异化铁还原菌与纳米零价铁耦合过程中没有通过介导体进行直接接触，纳米零价铁细小的颗粒会快速团聚并增大颗粒尺度，同样会导致反应活性降低，阻碍电子与污染物之间的电子传递。当铁氧化物与铁还原菌无法直接接触时，无法把铁还原菌呼吸链上产生的电子传递到铁氧化物表面，实现铁氧化物还原。

技术实现要素：

本发明的目的是为解决纳米零价铁易团聚、易被氧化问题以及强化铁还原菌与钝化纳米零价铁耦合的技术方法。研究氧化石墨烯介导希瓦氏菌对钝化纳米零价铁表面去钝化以达到对持久性有机污染物的降解去除。

本发明的技术方案是提供了一种强化铁还原菌耦合钝化纳米零价铁体系的方法，其具体包括：

步骤1、完成氧化石墨烯负载纳米零价铁的制备

其中：采用hummers方法制备氧化石墨烯，在250ml三口烧瓶中加入200mg制备完成的氧化石墨烯，再将0.496g七水合硫酸亚铁溶解于60ml水和20ml乙醇的混合溶液中，将混合溶液加入三口烧瓶中并在超声仪上以50khz超声30min；

在机械搅拌器的搅拌和氮气保护的情况下，利用蠕动泵向三口烧瓶中逐滴加入25ml硼氢化钠溶液，反应时间为30min；反应后继续通氮气并搅拌20min，使混合液反应完全；在5000rpm、5min条件下离心收集产物，并依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，放真空干燥箱60℃下烘干，得到氧化石墨烯负载纳米零价铁；

步骤2、使用氧化石墨烯负载纳米零价铁降解4-氯酚

将氧化石墨烯负载纳米零价铁与4-氯酚反应，降解批次实验反应在带有丁腈外翻橡胶塞密封的100ml血清瓶内避光进行，4-氯酚的初始浓度为10mg/l；反应结束后离心收集钝化样品，在真空干燥箱60℃下烘干，将烘干的样品储存于10mlpe管中备用，所得最终样品为氧化石墨烯负载钝化纳米零价铁；

步骤3、进行希瓦氏菌的人工培养

在lb液体培养基中培养希瓦氏菌，在30℃、200rpm条件下振荡培养，16h对数生长末期离心收集菌悬液，并用无机盐培养液洗涤3次得到最终的富集菌液；

步骤4、完成氧化石墨烯介导希瓦氏菌还原钝化纳米零价铁降解4-氯酚

氧化石墨烯介导希瓦氏菌还原钝化纳米零价铁降解4-氯酚的实验在100ml丁腈橡胶密封的血清瓶内避光进行，4-氯酚浓度控制在20μg/l；

将150mg氧化石墨烯负载钝化纳米零价铁加入血清瓶中，20mm乳酸钠作为电子供体，富集希瓦氏菌投加量为3ml，20mmhepes作生物缓冲剂以保持ph在6.9-7.1范围内，剩余体积用无机盐培养基充满，氧化石墨烯、钝化纳米零价铁以及希瓦氏菌共为耦合体系；乳酸钠为唯一碳源，菌悬液的浓度控制在od600＝1.2。

进一步地，步骤3中，低温离心机转速8000rpm，温度4℃，低温离心机工作时间5min。

进一步地，步骤4中，血清瓶用丁腈橡胶密封后置于200r/min，30℃条件下恒温摇床上反应。

本发明的有益效果体现在：

(1)本发明所制备的氧化石墨烯负载纳米零价铁通过氧化石墨烯较大的比表面积与孔隙克服了纳米零价铁易团聚的缺点。

(2)本发明所制备的氧化石墨烯负载钝化纳米零价铁耦合希瓦氏菌通过铁还原菌希瓦氏菌与材料的耦合作用，氧化石墨烯强化了耦合体系、减少了钝化层的形成并提高了体系的反应活性，克服了纳米零价铁易失活的缺点。

(3)本发明所涉及的铁还原菌分布广、耦合方法简单且容易实施。

附图内容

图1为本发明所制备的氧化石墨烯负载纳米零价铁的扫描电镜(sem)图

图2为氧化石墨烯负载纳米零价铁降解4-氯酚的效果图

图3为氧化石墨烯介导希瓦氏菌还原钝化纳米零价铁降解4-氯酚效果图

图4为氧化石墨烯负载钝化纳米零价铁，钝化零价铁经希瓦氏菌还原后以及氧化石墨烯负载钝化零价铁经希瓦氏菌还原后的xrd表征图

图5为降解反应后收集的氧化石墨烯负载钝化纳米零价铁耦合希瓦氏菌的扫描电镜(sem)图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式，对本发明的技术方案进行详细说明。

该实施例提供了一种强化铁还原菌耦合钝化纳米零价铁体系的方法，其具体包括：

步骤1、完成氧化石墨烯负载纳米零价铁的制备

采用hummers方法制备氧化石墨烯，在250ml三口烧瓶中加入200mg制备完成的氧化石墨烯，再将0.496g七水合硫酸亚铁溶解于60ml水和20ml乙醇的混合溶液中，将混合溶液加入三口烧瓶中并在超声仪上以50khz超声30min；

在机械搅拌器的搅拌和氮气保护的情况下，利用蠕动泵向三口烧瓶中逐滴加入25ml硼氢化钠溶液，反应时间为30min。反应后继续通氮气并搅拌20min，使混合液反应完全。在5000rpm、5min条件下离心收集产物，并依次用去离子水和无水乙醇清洗3次，放真空干燥箱60℃下烘干。

收集的样品为新鲜制备的氧化石墨烯负载纳米零价铁。

图1为氧化石墨烯负载纳米零价铁的扫描电镜(sem)表征图，表征结果表明氧化石墨烯作为介导载体具有皱褶以及孔隙结构，由于氧化石墨烯的表面带有负电荷，fe²⁺可以在表面上容易地吸附或与表面含氧官能团形成络合物。随着可溶性fe²的减少，在氧化石墨烯表面层上形成纳米零价铁，其中通过附着于氧化石墨烯表面的低迁移率阻止纳米零价铁的团聚。

步骤2、使用氧化石墨烯负载纳米零价铁降解4-氯酚

在步骤1的反应后将已制备的氧化石墨烯负载纳米零价铁与4-氯酚反应。降解批次实验反应在带有丁腈外翻橡胶塞密封的100ml血清瓶内避光进行，4-氯酚的初始浓度为10mg/l。反应结束后离心收集钝化样品，在真空干燥箱60℃下烘干，将烘干的样品储存于10mlpe管中备用，所得最终样品为氧化石墨烯负载钝化纳米零价铁。

图2为氧化石墨烯负载纳米零价铁降解4-氯酚的效果图，表明降解反应在60h左右基本达到平衡。在反应时间内，纳米零价铁对4-氯酚的降解效率仅为26.2％，由于纳米零价铁在降解反应过程中表面逐渐被氧化形成钝化层，阻碍反应进一步进行，氧化石墨烯负载纳米零价铁提高了纳米零价铁对4-氯酚的降解效果，降解效率达到了37.8％。

步骤3、进行希瓦氏菌的人工培养

本实施例中的希瓦氏菌(shewanellaputrefaciens)为人工培养。在lb液体培养基中培养希瓦氏菌，在30℃、200rpm条件下振荡培养，16h对数生长末期离心收集菌悬液(低温离心机8000rpm，4℃，5min)，并用无机盐培养液洗涤(ph＝6.9-7.1)洗涤3次得到最终的富集菌液。

步骤4、完成氧化石墨烯介导希瓦氏菌还原钝化纳米零价铁降解4-氯酚

氧化石墨烯介导希瓦氏菌还原钝化纳米零价铁降解4-氯酚的实验在100ml丁腈橡胶密封的血清瓶内避光进行，4-氯酚浓度控制在20μg/l。将150mg氧化石墨烯负载钝化纳米零价铁加入血清瓶中，20mm乳酸钠作为电子供体，富集希瓦氏菌投加量为3ml，20mmhepes作生物缓冲剂以保持ph在6.9-7.1范围内，剩余体积用无机盐培养基充满，氧化石墨烯、钝化纳米零价铁以及希瓦氏菌共为耦合体系。乳酸钠为唯一碳源，菌悬液的浓度控制在od600＝1.2。血清瓶用丁腈橡胶密封后置于200r/min，30℃条件下恒温摇床上反应。对照组设置为三组，分别为单独添加4-氯酚的空白组，高温灭菌后的希瓦氏菌菌液以及单独的钝化纳米零价铁(未负载氧化石墨烯，添加量为50mg)。

图3为降解反应后收集的氧化石墨烯负载钝化纳米零价铁耦合希瓦氏菌的扫描电镜(sem)图。扫描电子显微镜表征希瓦氏菌形态需要对其加入2.5％戊二醛固定过夜预处理。氧化石墨烯作为介导体经过与纳米零价铁的反应之后表面原来呈现球状的纳米零价铁钝化后再经由希瓦氏菌生物还原后形成二次矿物，氧化石墨烯犹如针状般的材料即产生的含有fe(ⅱ)的二次矿物。

该结果表明：氧化石墨烯负载纳米零价铁能与希瓦氏菌进行很好的耦合作用，氧化石墨烯的孔隙结构明显且方便希瓦氏菌依附在表面与钝化纳米零价铁反应。图4为xrd表征图，希瓦氏菌还原钝化纳米零价铁以及氧化石墨烯负载纳米零价铁后耦合希瓦氏菌后会产生绿绣和蓝铁矿，从图4可以看出在氧化石墨烯介导下钝化纳米零价铁经过希瓦氏菌的还原作用后转化为蓝铁矿，其特征峰主要在11.83°和23.66°出现，蓝铁矿中含有结合态的fe(ii)，对氯代有机污染物具有一定的降解效果。图5为氧化石墨烯介导希瓦氏菌还原钝化纳米零价铁降解4-氯酚效果图，表明未存在氧化石墨烯条件下，4-氯酚在反应12天后降解效率达到47.3％；在存在氧化石墨烯的体系中，4-氯酚的降解效果显著提高，最终降解效率在89.5％

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，对本发明的范围由权利要求及其等同物限度。