强化植物修复土壤重金属污染的光合菌制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明是属于一种功能性微生物制剂与农业和环境污染治理技术领域，具体的说 是涉及到一种用于强化植物修复土壤重金属污染的复合光合菌制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 由于重金属在土壤中难降解、难迁移、危害期长，土壤重金属污染已成为国内外普 遍关注的环境问题之一，世界各国对重金属污染及其治理给予了高度重视。但常用的化学 和物理化学修复方法一般投资昂贵、设备复杂且易导致土壤结构破坏；而植物提取修复技 术则因为超积累植物通常矮小、生长缓慢、生物量低，对固定的相的铅、镉无法吸收富集等 缺点而限制了在实际生产中的应用。
[0003] 生物修复是利用微生物或植物的生命代谢活动，对土壤中的重金属进行富集或提 取。生物修复技术主要包括植物修复和微生物修复。植物修复是指用植物吸收土壤中的重 金属，最终达到清除土壤中重金属的一类技术总称，植物修复法具有成本低，绿色净化、不 破坏土壤生态环境、无需进行二次处理等优点，是未来修复技术的主要发展方向。用来进行 植物修复的植物可以包括高等植物界的一切植物，如草、树木、作物等。其中，有一类植物的 重金属吸收明显超过其他普通植物，即超富集植物。
[0004] 植物修复也具有一定的缺陷，例如：重金属富集植物通常生物量低，生长比较慢； 对金属有先择性，不适合多种重金属复合污染的治理；植物对重金属的吸收能力往往受到 土壤环境和气候条件的限制；此外污染物可能通过落叶重新回到土壤中。提高重金属的有 效性，从而提高修复效率是解决这一个问题的关键，这些都限制了植物修复技术在重金属 污染土壤治理方面的应用。为了，研究人员考虑采用多种方式来弥补其不足之处。近几年， 采用重金属抗性微生物来提升植物对重金属的吸收能力逐渐成为国内外研究的热点，微生 物强化植物对重金属的吸收，其原理主要基于以下两个方面：一是促进植物营养吸收，增强 植物抗逆性，借助增加生物量的手段提高修复能力。如菌根真菌可以溶解转运土壤中的无 机矿物元素；根瘤菌进行生物固氮等促进植物营养吸收；根部多种微生物的存在所形成的 稳定根部微环境，增强了植物抗逆性等，这些都直接或间接地增加了植物的生物量，提高了 植物修复能力。二是增加植物根部重金属浓度，促进重金属的吸收或固定。微生物不仅通 过其自己身的组成成分如菌根外菌丝、几丁质、色素类物质，EPS等吸附重金属，而通过其分 泌的各种有机酸或特殊物质来活化重金属，增加其在植物根部浓度。通过某些植物体内存 在的对特定重金属具有转运作用的蛋白，将富集在植物根部的重金属转运到植物体内；或 使土壤中重金属吸附于根际，降低其流动性，从而减少其进入食物链的可能，并且在移除植 物体时降低土壤中重金属的浓度，借此达到植物吸收和固定的目的。因此，采用根际接种耐 镉微生物的方式，促进植物对镉的吸收能力，强化其土壤修复效果是一种可能行的方式，具 有极大的开发潜力。
[0005] 桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌单个细胞外通常有一层粘的荚膜，为多糖物质，能 够耐受较高浓度的重金属离子；桃红荚硫菌是一种硫氧化细菌，可通过直接作用和间接 作用两种方式对重金属活性产生影响：通过其分泌的胞外多聚物直接吸附在金属硫化物 (MS)表面，通过细胞内特有的氧化酶系统直接氧化金属硫化物，生成可溶性的硫酸盐：硫 与还原硫化物被微生物氧化为硫酸，降低溶液pH值，改变重金属的有效性。
[0006] 桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌属于光合细菌的一种，作为菌肥，桃红荚硫菌与荚 膜红假单日胞菌能促进土壤物质转化，改善土壤结构，提高土壤肥力，促进作物生长。如四 川大学的冯甦对紫硫细菌中的桃红荚硫菌在农业上的应用进行了研究，他认为桃红荚硫菌 对青菜生长发育有明显的促进作用，也可明显提高青菜的品质。但要投入实际运用，首要 要解决的问题是，该菌的生长速度缓慢，一般要培养两周以后才会有明显的生长趋势，培养 20-40天才能做为菌剂使用，且0D650的值不高于1，活菌含量低于1亿/毫升，较长的生长 周期不利于大规模的应用。而到目前为止，还未见有关桃红荚硫菌制备方法技术方案公开。 也未见有关桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌混合发酵的技术方案公开，也未有其强化植物修 复土壤重金属的技术方案进行公开。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明提供一种桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌混合培养， 菌体生长速度快，菌体含量高，培养时间短，菌肥活性高、稳定性高、具有强化植物修复土壤 重金属的复合光合细菌制剂及其制备方法。该复合光合菌制剂可以用于强化植物修复土壤 重金属污染，桃红荚硫菌作为硫氧化细菌，能氧化比较稳定的重金属的硫化物，促进土壤硫 循环，降低土壤PH，提高重金属在土壤中的活性，桃红荚硫菌与荚膜红假单胞菌作为菌肥， 能够促进土壤物质转化，改善土壤结构，提高土壤肥力，促进作物生长，提高富集重金属植 物的生物量，从而强化植物修复土壤重金属的效率。
[0008] 为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是： 采用紫硫光合细菌中的桃红荚硫菌菌种与紫色非硫光合细菌中的荚膜红假单胞菌按 以下步骤进行培养： :、桃红荚硫菌半固体种子活化培养：将桃红荚硫菌种穿刺在半固体桃红荚硫菌培养 基中，25_30°C光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的桃红荚硫菌 种； 〇)、荚膜红假单胞菌平板活化：将荚膜红假单胞菌菌种在平板上划线活化，温度 25-35°C活化培养3-5天，挑取大个菌落作为活化种子； 1?、桃红荚硫菌种子培养：将活化的菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度 25-35°C，光照强度为：1000-30001ux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的0D650彡1.2,活 菌数> 6亿个/毫升即为种子培养液； 出、荚膜红假单胞菌种子培养：将挑取大个荚膜红假单胞菌菌落作为活化种子接种到 种子培养基中，温度25-35°C，光照强度为：1000-30001ux，光照静置培养3-5天，检测种子 的0D660 > 2,活菌数> 15亿个/毫升即为种子培养液； 6)、发酵培养：将桃红荚硫菌种子培养液与发酵培养基以I :3_1 :5的接种量接种，同 时将荚膜红假单胞菌种子培养液与发酵培养基按I :10-1 :20的接种量接入，在光照培养罐 中厌氧培养，培养温度25-35°C，光照强度为：1000-40001ux，搅拌速度为120转/分钟，待 培养至第二天，开始流加100 g/L的硫代硫酸钠至硫代硫酸钠的浓度至1-2 g/L，培养5-7 天，待检测其OD650 > 6,活菌数> 50亿个/毫升，其中桃红荚硫菌不低于25亿/毫升，荚 膜红假单胞菌不低于20亿/毫升，即可放罐，灌装，包装成品。
[0009] 其中，所述的半固体桃红荚硫菌培养基为：硫酸铵l_2g/L，磷酸二氢钾0. 5-lg/L， 二水氯化钙0. 05-0. 2g/L，硫酸镁0. 1-0. 5g/L，醋酸钠2-5 g/L，果糖2-5g/L，九水硫化钠 0. Ι-lg/L，琼脂8-10g/L，氯化钠0. 5-4g/L，121°C灭菌15分钟，用苹果酸调PH至7. 0-7. 2， 其中九水硫化钠先配制成0. lg/mL单独灭菌 其中，所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：硫酸铵l_2g/L，磷酸二氢钾0. 5-lg/L， 二水氯化钙0. 05-0. 2g/L，硫酸镁0. 1-0. 5g/L，醋酸