专利名称：一种水溶性壳低聚糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种水溶性壳低聚糖的制备方法，尤其是制备聚合度为8至200的水溶性壳低聚糖的方法。
背景技术：
壳聚糖作为一种天然多糖，尤其氨基的大量存在，是一种碱性多糖，因而具有一些独特的功能性。研究揭示聚合度大于6的水溶性甲壳低聚糖和壳低聚糖比相应的寡糖具有更好的抗肿瘤作用和免疫促进作用。通常所说的甲壳素(脱乙酰度小于20％)和壳聚糖(脱乙酰度大于70％)聚合度大于7时，因其水溶性不好而直接影响在体内的消化与吸收；为此，许多研究者致力于高聚合度水溶性壳低聚糖的研究，发现脱乙酰度随机分布约为50％左右的壳聚糖可水溶。目前高聚合度水溶性壳低聚糖是通过先将甲壳素高度脱乙酰化，再将壳聚糖降解到一定的聚合度，然后用醋酸酐来部分乙酰化的方法制备的，工艺比较繁琐。
发明内容
本发明提出了一种工艺较简单的水溶性壳低聚糖的制备方法。
本发明提供的技术方案是一种水溶性壳低聚糖的制备方法，取脱乙酰度为50～85％的壳聚糖，用稀酸溶液溶解，用碱调溶液pH为5-6，控制溶液温度为40-55℃，加酶液催化降解壳聚糖，然后滤除不溶物，所得滤液用超滤膜超滤，得到所需水溶性壳低聚糖。
在上述方法中，将滤除不溶物所得滤液用10kDa的超滤膜超滤，未通过的溶液煮沸除酶后，得到聚合度为60-200的水溶性壳低聚糖；通过10kDa超滤膜的溶液进一步用3kDa超滤膜分级得到聚合度为30-60的水溶性壳低聚糖，通过3kDa超滤膜的溶液用1kDa超滤膜分级得到聚合度为8-30的水溶性壳低聚糖，最后用1kDa超滤膜分离聚合度小于8的寡糖。如果将各组分的溶液冷冻干燥后得到壳低聚糖盐。如果将各组分的溶液真空浓缩后用NaOH调pH 8-9，乙醇沉降，乙醇洗涤，真空干燥分别得到壳低聚糖(自由氨基形式)。
上述酶为为壳聚糖酶、半纤维素酶或溶菌酶，以及前述两种酶的混合物。
上述稀酸溶液为醋酸或乳酸。
上述超滤膜指工业中使用的各种超滤膜。
本发明利用酶对不同糖苷键的识别能力和切断能力的差异，和乙酰氨基在壳聚糖原料中的不均匀分布来制备水溶性壳低聚糖。因而工艺比较简单，在制备壳寡糖的同时，通过超滤膜分离的方法得到聚合度为8至200的水溶性壳低聚糖。实验表明所得产品有抗肿瘤作用和免疫促进作用。对Sacroma180实体瘤的抑制实验显示，本发明制得的水溶性壳低聚糖有较好的抑瘤活性，腹腔注射抑瘤率大于40％，最高达64％。口服抑瘤率达33.7％。
具体实施例方式
实施例1取脱乙酰度80.2％的蟹壳壳聚糖100克，用2升2％的醋酸溶液溶解后，用饱和氢氧化钠调溶液pH 5.5，控温47℃，加入10毫升半纤维素酶粗酶液催化降解壳聚糖。当反应液滴入2％氢氧化钠溶液中无浑浊后，用NMWL 10kDa超滤膜超滤除酶，通过10kDa超滤膜的溶液进一步用3kDa和1kDa超滤膜分级得到三个组分的溶液。CHU10-3是通过10kDa膜，未通过3kDa膜的组分；CHU3-1是通过了3kDa膜，未通过1kDa膜的组分。滤液真空浓缩后，用NaOH调pH液8-9，乙醇沉降，乙醇洗涤，真空干燥分别得到CHU10-3，CHU3-1和CHU1水溶性壳低聚糖。
表1.10kDa、3kDa和1kDa超滤膜分级产物壳低聚糖平均聚合度分散度 脱乙酰度 收率(％)CHU10-3 432.357.9 12.2CHU3-1 163.271.5 6.8当采用示差检测器检测时，可以检测出聚合度8以下的壳寡糖。实验测试中六聚糖和更低的聚合度的壳寡糖标样均可以检测出。样品CHU10-3中没有检测出六聚体及更低的寡糖，而CHU3-1中只含有少量的六聚体和更高的聚合度的壳寡糖。
实施例2脱乙酰度71.2％的虾壳壳聚糖50克加入用2升2％的醋酸溶液中搅拌8小时后过滤，调溶液pH 5.0，控温40℃，加溶菌酶催化降解壳聚糖。24小时后，先微滤，再用NMWL 1kDa超滤膜超滤分离寡糖部分。未通过的组分溶液用饱和氢氧化钠调溶液pH 8-9，离心分离，清液真空浓缩后，后乙醇沉降，乙醇洗涤，干燥后得水溶性壳低聚糖产物，收率38.7％，平均聚合度21，分散度2.65。
实施例3取脱乙酰度73％的虾壳壳聚糖25克加入用1升2％的乳酸溶液中搅拌8小时后过滤，调溶液pH 5.5，控温45℃，加入含壳聚糖酶与半纤维素酶的复合酶催化降解壳聚糖，当反应液滴入2％氢氧化钠溶液中无浑浊后，用NMWL 10kDa超滤膜超滤除酶，通过10kDa超滤膜的溶液进一步NMWL 1kDa超滤膜超滤分离寡糖部分。通过了10kDa膜，未通过1kDa膜的组分，冷冻干燥后得到壳低聚糖乳酸盐样品，收率23％，平均聚合度25，分散度2.85；未通过10kDa超滤膜的溶液煮沸杀酶后，50℃真空干燥后得壳低聚糖乳酸盐样品，收率5.3％，平均聚合度82，分散度2.1。
权利要求
1.一种水溶性壳低聚糖的制备方法，取脱乙酰度为50～85％的壳聚糖，用稀酸溶液溶解，用碱调溶液pH为5-6，控制溶液温度为40-55℃，加酶液催化降解壳聚糖，然后滤除不溶物，所得滤液用超滤膜超滤，得到所需水溶性壳低聚糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将滤除不溶物所得滤液用10kDa的超滤膜超滤，未通过的溶液煮沸除酶后，得到聚合度为60-200的水溶性壳低聚糖；通过10kDa超滤膜的溶液进一步用3kDa超滤膜分级得到聚合度为30-60的水溶性壳低聚糖，通过3kDa超滤膜的溶液用1kDa超滤膜分级得到聚合度为8-30的水溶性壳低聚糖，最后用1kDa超滤膜分离聚合度小于8的寡糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于将用超滤膜分级得到的各组分的溶液冷冻干燥后得到壳低聚糖盐。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于将用超滤膜分级得到的各组分的溶液真空浓缩后用NaOH调pH8-9，乙醇沉降，乙醇洗涤，真空干燥分别得到自由氨基形式的壳低聚糖。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述的酶为壳聚糖酶、半纤维素酶或溶菌酶，以及前述两种酶的混合物。
6.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述的稀酸溶液为醋酸或乳酸。
7.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所用超滤膜为工业中使用的各种超滤膜。
全文摘要
本发明涉及一种水溶性壳低聚糖的制备方法，本发明利用酶对不同糖苷键的识别能力和切断能力的差异，和乙酰氨基在壳聚糖原料中的不均匀分布来制备水溶性壳低聚糖。因而工艺比较简单，在制备壳寡糖的同时，通过超滤膜分离的方法得到聚合度为8至200的水溶性壳低聚糖。实验表明所得产品有抗肿瘤作用和免疫促进作用。对Sacroma180实体瘤的抑制实验显示，本发明制得的水溶性壳低聚糖有较好的抑瘤活性，腹腔注射抑瘤率大于40％，最高达64％。口服抑瘤率达33.7％。
文档编号B01D71/00GK1544479SQ200310111450
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年11月25日
发明者杜予民, 覃彩芹, 肖玲, 李瑾 申请人:武汉大学