反应器的制作方法

专利名称：反应器的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种反应器，特别涉及一种反应介质为液体的反应器。
背景技术：
在医药工业、食品工业、环保、农业、轻纺工业、化学工业等领域，往往借助于反应器来进行各种反应，其中所述的各种反应大都需要催化剂进行反应。对于在液态介质中进行的反应，为了提高反应效率，反应物和催化剂必须进行有效的接触。催化剂为固体时尤为如此。
在生物、医药工业、食品工业、环保、农业等领域中，酶或含酶的细胞是众多催化剂中比较引人注目的一类催化剂。而且，目前酶或含酶的细胞等多以固定化的形式使用，这是因为固定化酶/固定化胞通常比溶液酶稳定且可从产品中分离回收、重复使用(生物催化工艺学，孙志浩主编，化学工业出版社，北京，2005年)，从而其成本可大幅降低。但大多数包括固定化酶和/或固定化细胞的固相催化剂的催化活力则较相应的溶液酶低。
目前，使用固相催化剂的反应器主要有两种即填充床反应器和搅拌式反应器。一般而言，填充床反应器操作较为简单，其工作方式是预先将颗粒状或片状固相催化剂填充到填充床反应器中，反应时底物溶液流经填充床而使得固相催化剂与底物混合以使反应物和催化剂进行有效接触。搅拌式反应器含有反应罐，该反应罐包括罐体、罐体内的转轴和诸如搅拌桨等搅拌器。该搅拌式反应器的工作方式是先将颗粒状或块状的固相催化剂悬浮在反应罐内的底物溶液中，然后在反应时通过搅拌器进行搅拌或借助于气泡流动而使固相催化剂与底物充分混合以使反应物和催化剂进行有效接触。
尽管上述两种反应器均能实现固相催化剂与底物的混合而使反应物和催化剂进行有效接触，但在实际应用中不可避免地存在下述问题就填充床反应器而言，其存在的问题是[1]底物与固相催化剂之间的交换效率较低；[2]反应过程不易补料和通气体，也不易调节pH值及温度等；[3]不适于粘性或不溶性底物；[4]使用颗粒较小的固相催化剂时，床层压降大，这导致容易出现阻塞。
就搅拌式反应器而言，尽管其可根据需要来调节各种反应条件，但是在搅拌器进行搅拌的过程中，由于固相催化剂悬浮在反应罐内的底物溶液中，因此在固相催化剂颗粒之间、固相催化剂颗粒与搅拌器之间以及固相催化剂颗粒与反应罐罐壁之间均会发生强烈碰撞(酶学，陈石根和周润琦编，复旦大学出版社，上海，2001年；生物反应工程，戚以政和夏杰编着，化学工业出版社，北京，2004年)，因而导致固相催化剂颗粒因碰撞而碎裂和磨损，从而使得固相催化剂活力下降、使用寿命变短，并且固相催化剂因碎裂和磨损会产生碎片或粉渣，而这些碎片或粉渣随反应的进行会流失，这会妨碍反应液的后续处理，如产品的过滤和纯化等。而且，众所周知，悬浮在溶液中的固相催化剂颗粒的密度越大、运动(转速)越快，反应的效率就越高；但与此同时，颗粒受碰撞的强度也随之增大，固相催化剂也就越容易碎裂，其活力的下降也越快。因而，搅拌式反应器的应用范围受到局限，尤为不适用于本身就易碎的固相催化剂颗粒。

发明内容
为克服现有反应器存在的上述缺陷，本实用新型提供了这样一种反应器其能够防止催化剂活力下降、延长催化剂的使用寿命，并具有交换效率高、反应充分以及应用范围广的特点。
本实用新型提供的技术方案为提供一种反应器，包括至少一个反应罐，所述反应罐包括罐体、安装于罐体内可转动的转轴，所述反应罐还包括固定在所述转轴上的用于容纳固相催化剂的容器，所述容器具有外壁，在整个外壁上分布有可通透反应液和气体但不通透所述固相催化剂的孔。
在一个具体的实施方案中，所述外壁具有第一端面、第二端面以及在第一端面和第二端面之间延伸的周壁。所述外壁的第一端面和第二端面设置有用于穿插转轴的孔，所述孔的形状和大小与转轴相匹配。所述孔设置在所述容器的第一端面和第二端面上的中央位置处。
为了避免容器中的固相催化剂直接与转轴接触或为了便于容器安装到转轴上，所述容器还可以包括内筒，所述内筒的内径与转轴的外径相匹配。此外，所述转轴上还可以设有与罐体内外相通的用于输送液体和/或气体的孔道。
所述反应罐的安装方式可以为直立式，也可以为卧式或其它方式。在反应罐中，所述容器与转轴之间可采用螺栓固定方式，或者可采用卡箍固定方式，或者采用单键或花键固定方式等。根据反应的需要，所述容器的容积与反应罐的体积之比可以在1％至95％之间。该体积之比因不同的催化反应和需要而定。一般而言，该体积之比越高，反应进行得越快，故适用于不稳定或易降解的底物和/或产物。但该体积之比过高则会导致催化効率下降；另一方面，该体积之比过小(如少于5％)则降低搅拌効率，从而影响反应速率。
在本实用新型的反应方法中，所述固相催化剂可以是各种各样的固定化酶。一个固相催化剂的具体的例子是固定化酶或固定化细胞。该固定化酶和细胞的形状不受特别的限制，可以为颗粒状，片状，或者为一整块，还可以为由一整片卷绕成的柱体。在本实用新型的具体的实施例中，采用了整块的固相催化剂，该整块的固相催化剂是由酶或表达酶的细胞与开孔的多孔有机泡沫材料制成的，所述有机泡沫材料包括木浆海绵、聚乙烯醇海绵和三聚氰胺海绵。
根据所用固相催化剂的性能及其所催化的反应的要求，所述转轴的转速可以在很宽的范围内，例如可以为20～20,000rpm。当转速低于20rpm，反应液不能充分有效地和催化剂接触，反应效率不高，当转速高于20000rpm，消耗的能量比较大，对于节约成本不利。一般优选的范围为50～10,000rpm，更为优选的范围为100～1,000rpm。
相对于现有技术，本实用新型的有益效果是第一，本实用新型的反应器无需使用单独的搅拌器。在使用固相催化剂的反应器中，由于装有固相催化剂的容器具有离心搅拌功能，所谓离心搅拌是在离心作用下使反应液和气体与容器内的固相催化剂接触，就此而言，其效果类似于搅拌桨等搅拌器的搅拌动作所产生的效果，因此本实用新型提供的反应器无需采用搅拌器。
第二，由于本实用新型提供的反应器中不存在固相催化剂彼此之间、固相催化剂与搅拌器之间以及固相催化剂与反应罐罐壁之间的碰撞，因而，可以避免固相催化剂因碰撞而碎裂和磨损，从而可以避免固相催化剂因碎裂和磨损而导致酶的活力下降和其寿命降低的问题。
第三，本实用新型提供的反应器还可以避免固相催化剂因碎裂和磨损而产生碎片或粉渣，这样也就不会因存在碎片或粉渣而影响反应液的后续处理。
第四，本实用新型的反应器的应用范围广泛。本实用新型提供的反应器可应用于在液态介质中进行的各种反应。并且由于本实用新型提供的反应器中不存在固相催化剂彼此之间、固相催化剂与搅拌器之间以及固相催化剂与反应罐罐壁之间的碰撞，因此本实用新型提供的反应器不仅适用于固相催化剂颗粒较为坚实的情况，也同样适用于固相催化剂颗粒本身就易碎的情况。另外，根据不同的应用场合，本实用新型的反应器以及其中的容器可以采取各种式样，其外形可以是例如圆筒状、球状、棱柱状、方块状等规则形状，也可以是螺旋状、阶梯状等不规则形状。反应器中的容器的安装方式也可以根据实际需要而定，例如可以为卧式、直立式以及倾斜等各种形式。
第五，容纳有固相催化剂的容器随转轴旋转时，进入容器内的反应液在离心作用下沿离心方向贯穿固相催化剂后甩出，同时在固相催化剂内造成负压，而被甩出的反应液随之再循负压流经固相催化剂，如此形成循环回流，从而提高了交换效率。另外，由于反应器中容器的整个外壁上都有孔，因而反应液进出容器的效率更高，进而也提高了交换效率。
第六，容器外壁上的孔的大小不受特别的限制，可以视容器中所容纳的固相催化剂的大小等情况而定，只要该孔能够通透反应液和气体而不通透固相催化剂即可，而无需将其局限为孔径较小的微孔。由此，反应液和气体可以顺畅地与容器内的固相催化剂接触，从而可以提高反应效率，使得反应能够更充分地进行。
第七，本实用新型的反应器便于反应过程中的补料、通气、pH调节及温度调节等操作，从而克服了填充床反应器在此方面的缺陷及应用障碍。
以下结合附图具体实施方式
以及应用实例对本实用新型进行详细说明。


图1是本实用新型的反应器的一种结构的示意图；图2是本实用新型的反应器的另一种结构的示意图；图3是
图1所示的反应器使用状态的结构示意图；以及图4是
图1所示的反应器一个具体实施方式
的结构示意图。
图5显示的是表达载体pRSET-lac-MGI4-35-kan的核苷酸序列。
图6显示的是表达载体表达载体pHS-GHA的核苷酸序列。
图7显示的是表达载体pT7-kan-ACY的核苷酸序列。
具体实施方式
请参阅
图1，本实用新型的反应器包括至少一个反应罐，该反应罐包括罐体51、转轴21和容器53。转轴21安装于罐体51内，其在电机或其它传动装置(未图标)的带动下以一定的转速转动。如图所示，当容器53为圆筒状时，其具有这样的外壁即，包括顶部(也可称为第一端面)531、底部(也可称为第二端面)532以及在顶部531和底部532之间延伸的周壁533。在顶部531、底部532和周壁533上均可开设有能够通透反应液以及通透气体的孔。在顶部531和底部532的中央位置处开设有孔，在此孔边缘处设置有用于将容器53固定在转轴21上的固定装置54，该固定装置54例如可以是带螺栓的钢环等。
使用时，容器53中装入固体物质，例如，包括固相催化剂等固体物质，罐体51内装有反应液等，反应液可通过容器53外壁上的孔进出容器53。当容纳有固体物质的容器53与转轴21一同旋转时，进入容器53内的反应液在离心作用下沿离心方向贯穿固相催化剂等的固体物质，使反应液和气体与容器53内的固体物质中的酶等充分接触。可以看出，本实用新型的反应器中的容器53既起容器的作用，即，用于容纳固体物质；也起搅拌器的作用，即，用于使反应物和固体物质中的酶等充分接触。本申请中，搅拌器包括搅拌桨等各种形式的搅拌部件，只要其搅拌动作和效果类似于搅拌桨即可。
下面具体说明本实用新型的反应器的各个组成部分。
罐体51一般用不锈钢材料制成，当然也可用其它材料制成，其外形与罐内转轴21和容器53的数量和排列有关，例如，当罐内只有一根转轴21时，罐体51的外形可为圆柱形且两端呈圆弧状；当罐内有多根转轴21时，罐体51的外形可为扁的柱形、波浪柱形或其它形状。并且，罐体51具有一个或多个输液管口以及可拆卸的罐盖和/或罐底(未图标)。安装完成的反应罐可为直立式(即，转轴21垂直于罐底)，也可为卧式(即，转轴21平行于罐底)，当然也可为倾斜形式等其它形式。至于本实用新型的反应器中的罐体51的加热、保温以及温度、pH、气体等的检测与调节方式，可以与现有的反应器相同。
转轴21可以具有与罐体51内外相通的纵向孔道，因而其兼具输液功能。转轴21纵穿罐体51，其一端与电机或其它传动装置连接，另一端连接罐外的输液管道。转轴21的支点位于罐体51两端罐壁上，当罐内仅有一根转轴21时，其支点位置优选地位于两端罐壁的中央位置处；当罐内有多根转轴21时，根据实际需要确定转轴21的支点位置。转轴21与罐壁的交联处装有轴承和防止漏液的装置(如油封)。
在实际应用中，转轴21的转速为20～20,000rpm，优选的为50～10,000rpm，更为优选的为100～1,000rpm。
容器53可由塑料、不锈钢或其它材料制成，并且至少有一部分可以拆卸或具有装入固体物质的开口，从而可以向其内装入固体物质。容器53与整个反应罐的体积之比可在1％至95％之间。而且，其外形可以为通常的规则形状，例如圆筒形的圆盘、圆桶，球状，棱柱状，方块状等；也可以为不规则形状，例如螺旋状、阶梯状等各种形状；或者也可以是网兜等容器，只要其能够容纳如上所述的固体催化剂，并且可以固定到转轴21上并随转轴21一同旋转。根据容器53外形的具体形状确定是否需要将外壁划分为容器顶部531、容器底部532和周壁533，以及它们各自的形状。而且，为加强容器53的强度，可在容器53的外壁上设置一个或多个紧固环。并且，孔的开设位置以及分布形式，例如是否需要均匀分布，可以根据容器53的外形以及实际需要而定。例如，当容器53为圆盘时，可以在其整个外壁上开设孔，也可以根据实际需要仅在顶部531和周壁533上开设孔，或者其它开孔形式；而当容器53为球状时，可以在整个外壁上开设孔，或者仅在某些局部位置处开设孔。至于孔的大小，可根据固体物质的大小等实际情况而定，只要保证容器53可通透反应液、通透气体而不通透固体物质即可。并且孔越多、孔径越大，则容器53表面上的孔的总面积越大，也就越有利于反应时的回流。
另外，容器53可以是单层壁也可以是双层壁的结构。就单层壁结构的容器53而言，其顶部531和底部532的中央位置处开设有与转轴21相匹配的孔，用以穿插转轴21。使用时，先将顶部531打开，在容器53内装填固相催化剂等固体物质；然后将容器53套入转轴21，合上顶部531；再将容器53固定于转轴21上；随后将固定有容器53的转轴21插入反应罐内。就双层壁结构的容器53而言，其外壁层及顶部531与单层壁的外壁和顶部531相同，而其内壁层是在单层壁容器53的底部中央隆起一个与外壁层同高的上下开口的圆柱壳，用以套入转轴21并将其固定。双层壁的容器53在使用时，先将固相催化剂装填于容器53的两层壁之间的空腔内，合上并固定顶部531，然后套入转轴21并将其固定。双层壁结构的容器53的优点是便于在一根转轴21上穿套多个容器53。为进一步加强双层壁的容器53的强度，在内、外壁之间也可设置数根或一系列紧固架。此外，无论单层壁还是双层壁结构的容器53，其外壁上均分布有孔。
至于固定装置54并不局限于带螺栓的钢环，可以为其它形式的带有螺栓或销子的固定装置，也可以为卡箍固定装置，还可以为采用单键或花键固定形式、或者采用压配合等固定形式的固定装置，当然还可以采用这样的固定方式即，当容器53易变形时，在容器53中加入在液体中可膨胀的物质，当反应液进入容器53后，该物质迅速膨胀从而使得容器53及其内容物紧紧挤压转轴21，借助于挤压而产生的摩擦力将容器53固定于转轴21上；当容器53不易变形时，在容器53与转轴21之间嵌塞物质或加入在液体中可膨胀的物质，以使得容器53借助于该物质与转轴21紧紧挤压，这样产生的摩擦力就可将容器53固定于转轴21上。
需要指出的是，在本实用新型的反应器的一个反应罐内，可根据需要配置一个容器53或多个容器53。多个容器53可串联或并联在同一根转轴21上，也可并联在不同的转轴21上，并且多个串联的容器53可并列安装于同一反应罐内。而且，在本实用新型的反应器中，可以具有多个反应罐。根据实际需要，这些反应罐可以相互串联或并联，并且，其中一部分反应罐并不仅仅局限于用作反应罐，也可用于其它用途，例如用作预热罐等。
请参阅图2，图中所示结构类似于
图1中的结构，其中各个部分的结构、功能、以及彼此之间的连接作用关系类似于
图1所示反应器，对此不再重复说明，并且与
图1相同的部分采用相同的参考标号。
可以看出，
图1和图2所示结构的不同之处仅在于
图1中，容器53固定在转轴21的两侧或将转轴21包围在其中；图2中，容器53仅固定在转轴21的侧面。除了在容器53和转轴21之间或在容器53内添加物质并通过容器53与转轴21挤压而产生的摩擦力将容器53与转轴21紧紧固定在一起这种方式之外，容器53和转轴21之间的固定方式可以采用如前所述的各种固定装置和固定方式。
可以理解，在图2所示的反应器的一个反应罐内，也可根据需要配置一个容器53或多个容器53。多个容器53可串联或并联在同一根转轴21上，也可并联在不同的转轴21上，并且多个串联的容器53可并列安装于同一反应罐内。
下面参阅图3以包括固定化酶/固定化细胞的固相催化剂(固体物质)为例对本实用新型作进一步的说明。图3所示的反应器的结构与
图1相同，在此不再赘述。
使用时，首先将预先制备的颗粒状、片状或整块的固相催化剂(61)装入容器53，封闭容器53的上盖(顶部531)后将容器53固定在反应罐内的转轴21上，容器53上开设的孔可通透反应液、通透气体而不能通透整块固相催化剂或固相催化剂颗粒(61)。然后，将容器53装入反应罐，关闭罐盖，向罐体51内注入适当温度和体积的反应液。之后，启动电机或其它传动装置以带动转轴21离心旋转。这样，当容纳有整块固相催化剂或固相催化剂颗粒(61)的容器53随转轴21旋转时，进入容器53内的反应液在离心作用下沿离心方向贯穿整块固相催化剂或固相催化剂颗粒(61)，从而使反应液和气体与容器53内的固相催化剂接触。逐步调整转速至最佳反应效率，一般而言，转速越快，上述回流越快，底物与酶分子接触越频繁，而底物/产物与含酶分子等的交换也就越快，反应速度也随之加快。
上述反应可批量、半批量半连续或连续进行。所谓批量反应，指的是反应完成后排放全部反应液，然后注入新的底物溶液进行下一轮反应；所谓半批量半连续，指的是在反应过程中底物连续或批量加入、而产物批量或一次性排出；所谓连续反应，指的是反应进行过程中反应液不断地输入罐内，罐内液体也以同样的流速连续输出，反应持续进行。在实际使用中，也可将多个反应罐串联起来进行连续反应以提高总体反应效率。并且，当有气体参与反应时，反应罐处设有专门的气体排出装置，并可借此调节罐内气体的压力。
顺便说明，上述整块固相催化剂可以这样制成即，采用开孔、多孔有机泡沫材料如木浆海绵、聚乙烯醇海绵和三聚氰胺海绵等作为固定化载体，先将开孔的多孔有机泡沫材料预制成颗粒、片带状、蜂窝块状或其它整体结构的载体，再用多元醛及蛋白质凝絮剂将酶或细胞凝絮交联于载体的三维网壁上，从而得到整块固相催化剂。当然，在实际应用中也可以使用类似的方法来制造其它的固体物质。
请参阅图4，通过一个具体实施方式
对本实用新型反应器的结构作进一步的说明。
在本实施方式中，反应器包括一个反应罐。该反应罐的罐体51由不锈钢材料制成，形状为圆筒形，其内径为11cm，内高为6.4cm；罐壁为双层结构，两层罐壁之间为循环水信道1，罐壁的外层开设有与该信道1相连的循环水输入口2和循环水输出口3，输入口2和输出口3连接恒温水浴。
罐体51底部开设有四个孔，分别通向放料口40、取样口5、输液口6及通气口7。其中，放料口40处设置有放料阀4；通气口7由外向内通向嵌于罐底内表的环形管道8。该环形管道8上有众多的细孔通向罐内。罐体51底部的中央位置处设置有与转轴21相匹配的油封9和下轴承10。
罐体51顶部为圆形罐盖11，罐盖11的中央隆起形成隆起顶部12。隆起顶部12的内表面设置有连接转轴21的上轴承13。罐盖11上开设有三个小孔，分别通向排液口14、补液口15及排气口16。排气口16位于隆起顶部12的中央位置处。罐盖11上另有两孔，分别用于安装pH和温度探测电极17以及进料口螺旋盖18。罐盖11经四个螺丝19与罐口吻合固定，罐口与罐盖11的吻合面有一环形橡胶密封圈(未图标)。
罐内有网盘20和转轴21。转轴21直径约为2cm。网盘20由不锈钢网板制成，直径为10cm，高为5.1cm，网盘20上端为网盘盖22。网盘壁、网盘底及网盘盖22均布满孔，孔直径为2mm，孔分布密度为9个/cm2。在网盘20的中央位置处插入转轴21，网盘盖22和网盘底同转轴21的接合处以固定螺栓23固定；转轴21内有纵向孔道24，此孔道24的顶部、上端25及中下端26分别通向排气口16、罐盖11隆起的内腔及网盘20的内腔。顺便说明，在本实施例中网盘20为前述容器53的一种表现形式。
调速直流电机(例如，DC直流电机，200瓦，VEM MOTORS CO.，LTD.HK)位于罐体51底部中央，电机轴经活动关节与罐内转轴21连接。
需要指出的是，本实施方式的反应器可以利用本实用新型的基本原理对现行常规的搅拌式反应器进行改造而获得。同现行常规的搅拌式反应器相比，本实施方式中的固相催化剂既是催化剂，又是具离心搅拌功能的搅拌器(转子)；固相催化剂搅拌产生的离心力和负压进而强化其所具有的催化作用。并且，在现行的搅拌式反应器中的催化反应中，固相催化剂与底物(反应液)的旋转方向和速度基本相同；而在本实用新型的反应器中，反应液与固相催化剂的旋转方向和速度不同，并且固相催化剂搅拌产生的离心力和形成的负压有利于底物传质和产物传质的回流。此外，反应是不断循环的混匀体系，故易施行补料、通气、温度调节、pH调节等操作。
下面，通过多个应用实例来对本实用新型反应器的原理、结构和有益效果作更为详尽的说明。
实例1.悬浮搅拌对固定化酶载体的损伤采用图4所示的反应器，将目前广泛使用的颗粒状固定化酶树脂载体Sepabeads EC-EP(Grazu V，Abian O，Mateo C，Batista-Viera F，Fernandez-Lafuente R，Guisan JM.Biotechnol Bioeng.2005，90597-605；Grazu V，Abian O，Mateo C，Batista-Viera F，Fernandez-LafuenteR，Guisan JM.Biomacromolecules.2003，41495-1501)以及颗粒状固定化葡萄糖异构酶分别进行网盘搅拌(即，如上所述将颗粒状固定化酶树脂载体和固定化葡萄糖异构酶分别装入容器53内，容器53跟随转轴21作离心旋转而获得的搅拌作用)及悬浮搅拌试验，比较树脂载体的损伤程度。Sepabeads EC-EP购自意大利Resindion S.R.L公司。颗粒状固定化葡萄糖异构酶购自Sigma(St.Louis，MO)。
悬浮搅拌实验采用现有的常规的搅拌型反应器来实现，其中转轴直径约为2cm，该转轴具有不锈钢叶片(转轴上有四个对称的长26mm、宽20mm、厚2.4mm的矩形叶片，叶面平行于转轴，叶片边角圆滑)，并且反应罐可以不具有放料口、通气口、取样口及输液口，具体过程为分别将不同数量的Sepabeads EC-EP或颗粒状固定化葡萄糖异构酶直接加入反应罐；然后将反应罐注满蒸馏水，以不同的转速密闭旋转搅拌1小时；最后，收集搅拌后的Sepabeads EC-EP或固定化葡萄糖异构酶。
网盘搅拌实验采用本实用新型的反应器来实现，所用的反应器与上述的悬浮搅拌式反应器基本一样，只是带有叶片的转轴被固定有网盘的转轴代替。本实用新型反应器的转轴21直径约为2cm。网盘20由不锈钢网板制成，直径为10cm，高为5.1cm，网盘20上端为网盘盖22，下端为网盘底。网盘壁、网盘底及网盘盖22均布满孔，孔直径为2mm，孔分布密度为9个/cm2，在此盘的所有内表面包括底、盖和周壁的内表面上衬有孔径为200目的滤布。网盘20中央插入转轴21，网盘盖22和网盘底与转轴21的接合处以固定螺栓固定。实验的具体过程为首先，分别用不同数量的Sepabeads EC-EP或颗粒状固定化葡萄糖异构酶装填网盘；然后，装填后用海绵将网盘余空填实；再后，将反应罐注满蒸馏水后，以不同的转速密闭旋转搅拌1小时；最后，收集搅拌后的树脂颗粒。
将经网盘搅拌实验和悬浮搅拌实验搅拌后的Sepabeads EC-EP或固定化葡萄糖异构酶以及作为对照的未经搅拌的Sepabeads EC-EP或固定化葡萄糖异构酶烘干，用激光粒径测定仪(LS13320，LaserDiffraction Particle Size Analyzer，LS13320，Beckman)测试其颗粒的直径。结果如表1所示，与未经搅拌的Sepabeads EC-EP树脂载体相比，网盘中的树脂载体经搅拌后其颗粒大小基本不变；而直接加入反应罐的树脂载体经1小时搅拌后有明显破损造成其颗粒直径变小，而且破损程度随树脂载体密度的增大和搅拌速度的加快而增加，例如当Sepabeads EC-EP用量为100克、搅拌速度为800rpm时，仅经1小时的搅拌，其颗粒直径(平均)就大幅减小，减小幅度达13.6％之多，若以体积计，则其体积减小35％(V＝4/3πR3)。故现行工业搅拌反应实际上均无法采用高密度固定化酶。而从本实例可见，高速旋转(类似于剧烈搅拌)对置于网盘内的高密度的树脂载体几乎无损伤。而且，直接搅拌对固定化葡萄糖异构酶的损伤也远远大于置放在网盘中的固定化酶。
表1.搅拌对固定化酶载体的损伤

由此可见，采用本实用新型的反应器可以减少固相催化剂颗粒之间、固相催化剂颗粒与搅拌器之间、固相催化剂颗粒与反应罐罐壁之间的碰撞，彻底解决现行的常规搅拌式反应器所固有的将固定化颗粒碎裂、磨损的通病。
实例2.整块开孔固定化细胞作为搅拌桨连续搅拌反应制备高果糖浆[1]葡萄糖异构酶催化将葡萄糖转化成果糖的反应。表达葡萄糖异构酶的载体pRSET-lac-MGI4-35-kan的制备如下所述。根据pGEMT-Easy(Promega)的序列设计PCR引物，具体为上游引物RBS-NdeI5’-CATATGTATATCTCCTTCTTGTGTGAAATTG-3’；下游引物RBS-AlwNI5’-CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC-3’。以pGEMT-Easy(Promega)为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一755bp产物。PCR条件为50ng pGEMT-Easy(Promega)，0.4μM RBS-NdeI，0.4μM RBS-AlwNI，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μMdGTP，20mM Tris-HCl(pH为8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，2.5 U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水将反应体积调至50μL。PCR扩增反应程序为94℃，5分钟；94℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，4分钟；循环35次；72℃，10分钟。该PCR产物(755bp)在5’端含有NdeI酶切位点和核蛋白体结合位点及在3’端含有AlwNI酶切位点。用0.8％琼脂糖电泳提纯，NdeI和AlwNI酶切后，与经NdeI和AlwNI酶切的pRSETA(Invitrogen)连接，得pRSET-lac。用AlwNI和EcoRI酶切pRSET-lac和pRSET-kan(公布号为CN1680558的中国专利申请)，用0.8％琼脂糖电泳提纯各DNA片段并连接，得pRSET-lac-kan。
按照公开号为CN1702172的中国专利申请所公开的制备葡萄糖异构酶突变体的方法，以pGEMT-MGI-4为模板，分别以T1和87LR、87LF和217GR、217GF和260AR、260AF和T2为引物对(均见表2)，进行PCR合成，得到编码含有F87L、W139F、R182A、F187S、V217G、D260A和T299Q共七个点突变的葡萄糖异构酶突变体的基因MGI4-35。用NdeI和EcoRI酶切MGI4-35后，与经NdeI和EcoRI酶切的pRSET-lac-kan连接，得到pRSET-lac-MGI4-35-kan。所得载体pRSET-lac-MGI4-35-kan的完整核苷酸序列列于图5中。
表2

然后将pRSET-lac-MGI4-35-kan转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。按1％比例接种至LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中，37℃培养该含葡萄糖异构酶突变体MGI4-35的大肠杆菌36小时。离心得湿菌体，并悬浮于5倍菌体重量的蒸馏水中。
将三聚氰胺海绵(珠海天虹特种海绵厂)切割成0.5×5.5×130cm的片带(重2.9克)。按以下操作顺序制备表达葡萄糖异构酶的固定化大肠杆菌细胞a)将海绵片带浸入细胞悬液中，挤压海绵使菌液在海绵中均匀分布，将海绵通过对滚轴，挤压以除去海绵上未被吸附的菌液，调节两对滚轴的间隙使海绵上所吸附的菌液约为100 g；b)向海绵加入250ml含1mM CoCl2、pH为7.0的0.1％的聚乙烯亚胺(PEI，购自Sigma，St.Luis，USA) 溶液，挤压海绵使聚乙烯亚胺分布均匀，海绵再次通过对滚轴以除去未被吸附的液体；c)向海绵加入250ml的0.1％的戊二醛(购自广东汕头市西陇化工厂)溶液，挤压海绵使戊二醛均匀分布并除去未被吸附的液体，静置5分钟；d)重复步骤a)至c)5次，每次重复步骤a)时，调节两对滚轴间的间隙使海绵再次吸附的菌液量约为50g，然后以蒸馏水挤压洗涤1次，挤压除去未被吸附的液体后，置于流动空气中干燥5-10小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞片带25g。从所制备的表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞片带上剪取少量样品，参照公开号为CN1702172的中国专利申请中实施例11所述的方法测定固定化细胞的葡萄糖异构酶比活力。具体为精确称取0.5-2mg按上述方法制备的表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞，加36％(W/V)的葡萄糖溶液(含0.25 mM氯化钴，5mM氯化镁，20mM磷酸盐，pH为6.5)1ml，在75℃振摇反应10分钟，置于冰浴并终止反应。在此条件下每分钟催化1微摩尔葡萄糖转化为果糖所需的酶量定义为一个葡萄糖异构酶活力单位。测得本实例的固定化大肠杆菌细胞的酶比活力为6,069单位/克。
将所制备的表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞片带25g卷绕成卷轴状并插入网盘20，再用细线将片带经网盘的孔与网盘缠绕固定，合上网盘盖22，插入转轴21，拧紧网盘底和网盘盖22与转轴21之间的固定螺栓23，这样固定到转轴21上的装有葡萄糖异构酶固定化细胞的网盘20即可作为随转轴21转动的搅拌桨；然后将固定到转轴21上的装有葡萄糖异构酶固定化细胞的网盘20插入罐内，合上带有密封圈的罐盖11，使网盘20两端露出的转轴21分别与罐底和罐盖11的凹槽良好配合，然后拧紧固定螺丝19使罐盖11与罐体51紧密接合；再后，将连接着可指示温度的PHS-3D型pH计(上海三信仪表厂)的电极17旋进罐盖11，将罐体51上下所有的输液/气口套上硅胶管，用金属夹夹封位于罐底的取样口5、通气口7及位于罐盖11的排气口16和补液口15，关闭放料阀4；将温度设定为76℃的精密循环水浴(THD-0506型，宁波天恒仪器厂)的进、出水管分别与罐体51循环水输入口2和输出口3连接并启动水循环；之后，用恒流泵(HL-1S型，上海青浦沪西仪器厂)将50％(W/V)葡萄糖溶液(含1mM氯化镁及0.2g/L亚硫酸钠，pH为7.5，流动氮气脱氧)从输液口6泵入罐内，至排液口14流出。启动电机，调节转速为600转/分。当pH计温度显示为75℃时，以旋光仪(wzz-2s数字式自动旋光仪，上海精密科学仪器有限公司)监测流出液的果糖含量；此后每4-6小时监测一次流出糖浆的旋光值(22℃)。测得初始流速为6.8克/分钟时，旋光值(22℃)为-10.126(相当于果糖转化率为50.3％)。反应持续98小时，其间流速维持在6.0-6.5克/分钟。反应第98小时时，流速为6.18克/分钟，旋光值(22℃)为-9.323(相当于果糖转化率为49.17％)。观察见产物高果糖浆清澄、整块开孔固定化细胞外形和体积完整，经洗涤并晾干后其重量为24.8克。
实例3.整块开孔固定化细胞作为搅拌桨串联连续搅拌反应制备高果糖浆葡萄糖异构酶固定化细胞片带的制备和活力测定、其在反应罐上的安装、异构反应和反应罐的操作等基本上参照实例2。本实例制备葡萄糖异构酶固定化细胞片带50克，酶活力为5,298单位/克。采用2个如图4所示的反应罐，反应罐I和反应罐II，分别在网盘20中各装填23.5克比活力为5,298单位/克的固定化细胞片带，分别单独反应，其操作与实例2相同。测得反应罐I流速为7.1克/分钟时，旋光值(22℃)为-8.68(相当于果糖转化率为48.68％)；测得反应罐II的流速为7.3克/分钟时，旋光值(22℃)为-8.689(相当于果糖转化率为48.30％)。然后将反应罐I和反应罐II串联，即反应罐I的流出液流入反应罐II，在反应罐II内继续反应后从反应罐II的排液口14流出，流速加大。串联反应流速为14.27克/分钟时，旋光值(22℃)为-11.28(相当于果糖转化率为51.88％)；串联反应流速为18.24克/分钟时，旋光值(22℃)为-10.623(相当于果糖转化率为50.97％)；串联反应流速为24.0克/分钟时，旋光值(22℃)为-8.86(相当于果糖转化率为48.53％)。与实例2比较，本实例结果显示串联反应显著提高反应效率。
实例4.整块开孔固定化细胞作为搅拌桨批量搅拌反应制备高果糖浆本实例中的葡萄糖异构酶固定化细胞片带的制备和活力测定、其在反应罐上的安装、异构反应和反应罐的操作等基本上参照实例2。本实例制备葡萄糖异构酶固定化细胞片带35克，酶活力为6,775单位/克。采用2个如图4所示的反应罐，一个作为反应罐，另一个作为底物预热罐。预热罐罐底高出反应罐的罐盖10cm，两罐的放料阀4之间串联一个三通阀，反应罐下端的循环水输入口2与预热罐上端的循环水输出口3之间以硅胶管连接，恒温水浴的进、出水管分别与预热罐下端的循环水输入口2及反应罐上端的循环水输出口3连接并启动水循环，设定循环水温为76.9℃；在反应罐安装比活力为6,775单位/克的葡萄糖异构酶固定化细胞片带35克，预热罐不加固定化细胞，两罐的通气口7均连接氮气瓶，预热罐始终保持排气口16开放并持续通氮气。在加料前，夹封所有取样口5、输液口6、排液口14及反应罐的通气口7及排气口16，关闭两罐之间所有的阀门，将500g的50％(W/V)的葡萄糖溶液(含1mM氯化镁及0.2g/L亚硫酸钠，pH为7.5)从预热罐的进料口倒入，然后盖上并拧紧进料口螺盖18，启动预热罐电机(转速设定为900转/分)。当预热罐pH计上温度指示为75℃时，开放反应罐的排气口16及通气口7，在反应罐有氮气保护下打开两罐的放料阀4，此时，预热罐内的葡萄糖溶液流向反应罐，糖液排尽后关闭两罐之间的所有阀门及反应罐的通气口7及排气口16，启动反应罐电机(转速设定为600转/分)，并计时。在启动反应罐后向预热罐再次加载500g葡萄糖溶液，同时旋转预热。当反应完成后打开三通阀、反应罐的放料阀4及通气口7，排出反应液(高果糖浆)。排尽液体后，关闭三通阀，调反应罐转速为零，打开两罐的放料阀4及反应罐的排气口16，预热罐内已预热至75℃的葡萄糖溶液再次流入反应罐。如此循环操作，共反应129批，其中3批反应时间为30分钟，5批反应时间为10分钟，其余反应时间均为20分钟。以旋光度法测定其果糖转化率。测得前58批产物(每批反应时间均为20分钟)的旋光值(22℃)不低于-11.82(相当于果糖转化率为52.69％以上)；测得最后10批产物(每批反应时间均为20分钟)的旋光值(22℃)不低于-5.688(相当于果糖转化率为44.1％以上)。观察可见高果糖桨产物清澄、整块开孔固定化细胞外形和体积完整，洗涤并晾干后其重量未变，仍为35克。
由本实例和实例2可知，固相催化剂的使用寿命可得以延长，且生产成本也相应节省。此外，本实用新型的反应器中的容器53可对上述整块固相催化剂起保护作用，避免或减缓整块固相催化剂在离心搅拌中的撕裂。
实例5.整块开孔固定化细胞作为搅拌桨半批量半连续搅拌反应制备高果糖浆在完成实例3后，取出反应罐II中的固定化细胞，将反应罐II用作预热罐，以已经装填23.5克葡萄糖异构酶固定化细胞的反应罐I作为反应罐，按实例4的方法操作。但不同的是每次反应完成后并不将反应液完全排出，而是仅排出200克；同时每次加载预热、新鲜葡萄糖溶液200克。进行4次半批量半连续反应，每次反应时间为10分钟，测得旋光值(22℃)在-3.850(相当于果糖转化率为39.8％)与-3.709(相当于果糖转化率为39.6％)之间。
实例6.整块开孔木浆海绵固定化细胞作为搅拌桨批量搅拌反应制备高果糖浆按实例2所述的方法制备表达葡萄糖异构酶大肠杆菌湿菌体，将细胞悬浮于5倍蒸馏水中。将木浆海绵(珠海天虹特种海绵厂)切成0.3×5.5×150cm(12克)的片带，用蒸馏水洗，干燥后，按以下顺序操作a)将海绵片带浸入细胞悬液中，挤压海绵使菌液在海绵中均匀分布，使海绵上所吸附的菌液约为50g；b)向海绵加入150ml0.1％的聚乙烯亚胺溶液(pH为7.0)，挤压海绵使聚乙烯亚胺均匀分布并除去未被吸附的液体；c)向海绵加入150ml 0.1％的戊二醛溶液，挤压使戊二醛均匀分布并除去未被吸附的液体；d)重复步骤a)至c)5次，每次重复步骤a)时使海绵再次吸附的菌液量约为20g。最后挤压除去未被吸附的液体后，在流动空气中干燥10小时，即得到葡萄糖异构酶固定化细胞片带18.47g。按实例2所述的方法测定固定化细胞的葡萄糖异构酶比活力。测得本实例的固定化大肠杆菌细胞的酶比活力为2,281单位/克。
采用如图4所示的反应罐，将比活力为2,281单位/克的固定化葡萄糖异构酶细胞片带18.47克按实例2所述的方法装入网盘，并按实例4所述方法进行批量反应。投入葡萄糖溶液500g，反应30分钟时，产物旋光值(22℃)为2.19(相当于果糖转化率为33.1％)；反应60分钟时，旋光值(22℃)为-6.70(相当于果糖转化率为45.5％)；反应90分钟时，旋光值(22℃)为-10.383(相当于果糖转化率为50.6％)。产物清澄。
实例7.开孔聚乙烯醇海绵颗粒固定化细胞作为搅拌桨批量搅拌反应制备高果糖浆按实例2所述的方法制备表达葡萄糖异构酶大肠杆菌湿菌体，将细胞悬浮于5倍体蒸馏水中。将干燥的开孔聚乙烯醇海绵(购自浙江省宁海县好帮手日用品有限公司)切成约8mm3的颗粒，取聚乙烯醇海绵颗粒20g置于尼龙纱网袋中，再将网袋置于塑料袋中，将40ml菌液加入海绵颗粒中，反复挤压混合至少3分钟，使得菌液在颗粒上均匀分布；加0.5％(W/V)pH为7.0的聚乙烯亚胺(PEI)溶液40ml，反复挤压混合至少3分钟；加0.5％(V/V)的戊二醛溶液40ml，反复挤压混合至少5分钟，然后将网袋从塑料袋中取出，挤压除去液体，以蒸馏水挤压洗涤3次，除去未被吸附的液体后，在流动空气中干燥5-10小时，即得到表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒25.4g。按实例2所述的方法测定固定化细胞的葡萄糖异构酶比活力。测得本实例的固定化大肠杆菌细胞的酶比活力为1,402单位/克。
采用如图4所示的反应罐，用25g所制备的开孔聚乙烯醇海绵颗粒固定化细胞的干颗粒装填网盘，按实例4所述方法进行批量反应。投入葡萄糖溶液500g，反应30分钟时，产物旋光值(22℃)为9.564(相当于果糖转化率为22.9％)；反应60分钟时，旋光值(22℃)为-0.31(相当于果糖转化率为37.7％)；反应90分钟时，旋光值(22℃)为-6.291(相当于果糖转化率为44.9％)。产物清澄。
实例8.颗粒固定化细胞作为搅拌桨批量搅拌反应制备高果糖浆采用如图4所示的反应罐，用美国Genencor公司生产的比活力为485单位/克的固定化葡萄糖异构酶Spezyme IGI(山东保龄宝生物技术有限公司提供)的干颗粒160g装填网盘，催化搅拌操作同实例4，所不同的是在本实例中离心转速为600RMP。反应液300g，反应20分钟，旋光值(22℃)为-8.097(相当于果糖转化率为47.48％)。产物清澄。
实例9.整块开孔D-氨基酸氧化酶固定化酶作为搅拌桨批量搅拌反应制备戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7-ACA)D-氨基酸氧化酶将头孢菌素C转化成戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7-ACA)。按下列方法制备BL-HS-GHA[含有重组D-氨基酸氧化酶GHA的E.coli BL21(DE3)pLysS]大肠杆菌菌体。
BL-HS-GHA的来源根据已知的Thermoanaerobacterium saccharolyticum glucoseisomerase DNA序列(GenBank L09699)，设计PCR引物，具体为上游引物GI-NdeI5’-AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGA下游引物GI-EcoRI5’-ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATAC以Thermoanaerobacterium saccharolyticum(购自ATCC，USA)DNA为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一1,376bp产物。PCR条件为50 ng T.saccharolyticum DNA，0.4μM GI-NdeI，0.4μMGI-EcoRI，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH为8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，2.5 U Platinum Taq High Fidelity DNA聚合酶(Invitrogen)，用无菌水将反应体积调至50μL。PCR扩增反应程序为95℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，3分钟，循环35次；72℃，10分钟。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，利用TA克隆方法，与pGEMT-Easy(Promega)连接，得pGEMT-Easy-GI。用NdeI和EcoRI酶切pGEMT-Easy-GI，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和EcoRI酶切的pRSET-lac-kan连接，得pRSET-lac-GI-kan。根据已知hok/sok基因片段序列(GenBank X05813)设计10条引物(见表3)。PCR基因构造根据Kikuchi，M.et al.，1999，Gene236159-167所述，惟具体步骤有变更。PCR条件为20ng各个引物，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mMTris-HCl(pH为8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水将反应体积调至50μL。PCR扩增反应程序为95℃，4分钟；94℃，1.5分钟，50℃，1.5分钟，72℃，5分钟，循环30次；72℃，10分钟。取PCR扩增反应混合物5μL作模板，引物1和10，依上述条件再次PCR扩增，得PCR产物长为580bp，在其5’和3’端分别含有AscI及EcoRI酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，AscI及EcoRI酶切后，与经AscI及EcoRI酶切的pRSET-lac-GI-kan连接，得pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。
表3


用NdeI和BglII酶切质粒pRSET-kan-DAOGHA(公开号为CN1680558的中国专利申请)，得一1,074bp基因片段(内含D-氨基酸氧化酶突变体GHA基因)，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-lac-GI-hok/sok-kan得到的长片断连接，得pHS-GHA，其完整核苷酸序列列于图6中。将pHS-GHA转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-HS-GHA。
制备BL-HS-GHA[含有重组D-氨基酸氧化酶GHA的E.coliBL21(DE3)pLysS]菌体的方法如下所述。
从卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上挑取单菌落大肠杆菌BL-HS-GHA，接种到2×5 mL含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养8小时(摇床转速为250转/分钟)，再接种至2×50mL含卡那霉素(100g/mL)和氯霉素(40μg/mL)的种子培养基，在30℃培养16小时(摇床转速为400转/分钟)。
玉米浆1的制备将300g玉米浆(购自华北制药康欣有限公司)溶于300mL的蒸馏水中，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆1。沉淀物留用。
玉米浆2的制备将上述沉淀物再溶于600mL的蒸馏水中，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆2。
50mL种子培养基中各成分重量如下玉米浆14mL玉米浆24mL酵母浸膏 0.2g硫酸铵0.075g磷酸氢二钠0.25g磷酸二氢钾0.04g氯化钠0.075g将各成分溶于50mL的蒸馏水中，以10N氢氧化钠将pH值调至7.15，高温消毒。
种子过夜发酵后，将全部100mL的种子接种至含卡那霉素(50μg/mL)的2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Fermentor，KLF2000)。
2L发酵培养基中各成分重量如下玉米浆1 160mL玉米浆2 160mL酵母浸膏 8g硫酸铵3g磷酸氢二钠10g磷酸二氢钾1g氯化钠3g将各成分溶于1.9L的蒸馏水中，以10N氢氧化钠将pH值调至7.15，于2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Fermentor，KLF2000)高温消毒。
将12.5g葡萄糖溶于50mL的蒸馏水中，高温消毒；将1.25g硫酸镁溶于50mL的蒸馏水中，高温消毒。
发酵前把已消毒的葡萄糖和硫酸镁放进2L发酵罐中。
补料的制备将250mL玉米浆1和250mL玉米浆2混合，以10N氢氧化钠将pH值调至7.25，高温消毒。
将2.25g硫酸铵、7.56g磷酸氢二钠、1.2g磷酸二氢钾、2.25g氯化钠溶于60mL的蒸馏水中，高温消毒。
将15g酵母浸膏溶于100mL的蒸馏水中，高温消毒。
将70g葡萄糖溶于140mL的蒸馏水中，高温消毒。
将30mL甘油混合10mL的蒸馏水中，高温消毒。
将20g硫酸镁溶于30mL的蒸馏水中，高温消毒。
将所有溶液混合，加入卡那霉素直至浓度为50μg/mL，加入2mL的消泡剂。
在35℃生长，在初始的6小时，pH值由6.9自然上升至7.2，开始补料(50mL/小时)。在平衡条件下(以5 N氢氧化钾将pH值维持在7.2，溶氧水平pO2不大于0.5％)，继续生长26小时。
在发酵罐发酵后，细菌在4℃经离心机分离(5,000g，8分钟)，弃上清液，取沉淀，将沉淀重悬于600mL的磷酸钠缓冲液(50mM，pH为7.5)中。用珠磨法裂解细菌，以50mL/分钟的速度把细菌重悬液送进珠磨机(DYNO-MILL TYP KDL，直径为0.2mm的玻璃珠，WA Bachofen)内，最后再以800mL的磷酸钠缓冲液(50mM，pH为7.5)把细菌残留冲洗出来。将细菌裂解液在55℃水浴中浸泡30分钟，以高速离心(10,000g，30分钟)，取上清液，即为粗纯的重组D-氨基酸氧化酶GHA。D-氨基酸氧化酶的纯化基本上按Alonso，J.，Barredo，J.L.，Diez，B.，Mellado，E.，Salto，F.，Garcia，J.L.，Cortes，E.(1998，Microbiology 1441095-1101)所述。提取的粗纯重组D-氨基酸氧化酶GHA，加入甘油至最终浓度为10％，用5N氢氧化钠将pH值调至8，离心(13,000g，30分钟)，取上清液。按产品供货商所述制备法制备DEAE-纤维素离子交换树脂(Sigma，D-0909)。按每1mL粗纯酶混合0.5mL DEAE-纤维素离子交换树脂，在4℃搅拌5小时(100转/分钟)，用滤斗(Buchner filter funnel，120 mm P1)将酶液滤去。以3倍于DEAE-纤维素离子交换树脂体积的40mM的磷酸二氢钠缓冲液(含10％甘油)冲洗DEAE-纤维素离子交换树脂，再用2倍于DEAE-纤维素离子交换树脂体积的400mM的磷酸二氢钠缓冲液将重组D-氨基酸氧化酶GHA洗脱出来。按每1L洗脱的重组D-氨基酸氧化酶GHA，加入262g硫酸铵，在室温搅拌15分钟(100转/分钟)。离心(13,000g，15分钟)，弃上清液，保留沉淀物。将沉淀物溶于20mM磷酸二氢钠缓冲液(pH为7.5)后，以MilliporeYM30滤膜超滤除去剩余硫酸铵，将酶液浓缩至25mg/ml。用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。取酶液20ml，加牛血清白蛋白3g，蒸馏水90ml，搅拌均匀，得到稀释酶液110ml。将三聚氰胺海绵切割成5.5cm厚的板状，再穿刺海绵使之具有均匀密布的穿透孔道(孔的密度为6个/cm2、孔径为0.2cm，所有孔道平行且与海绵穿刺表面呈45度角)；然后，将海绵切割成直径为8.5cm、高为3cm的圆盘柱状，并于圆盘中央留一直径为2cm、穿透并垂直于圆盘面的孔道。之后，按以下顺序操作a)在海绵载体上加32ml稀释酶液，挤压使酶液在海绵中均匀分布；B)向海绵加0.05％的聚乙烯亚胺(PEI)溶液(pH为7.0)260ml，反复挤压海绵至挤出液由混变清，再次挤压并除去未被吸附的液体；c)向海绵加入0.05％的戊二醛溶液260ml，挤压使戊二醛分布均匀并除去未被吸附的液体。d)重复步骤a)至c)5次。流动空气干燥24小时后，得重9.2克的蜂窝状固定化D-氨基酸氧化酶块。
采用如图4所示的反应罐。将蜂窝状固定化D-氨基酸氧化酶块插入网盘中，按实例2所述方法操作反应罐，但以pH控制器(Biotech-2020，上海保兴生物设备有限公司)代替pH计，将pH控制器的蠕动泵输出端连接罐底的补液口15，将pH控制器的蠕动泵吸液口插入15％的氨水溶液中。加料前，关闭取样口5、输液口6、排液口14及放料阀4，排气口16保持开放；将氧气从通气孔7通入罐内，调节气流量为2.17L/min；将300ml 75mM头孢菌素C钠盐水溶液(pH为7.5)从罐盖进料口加入罐内，然后盖上并旋紧进料口螺盖18，启动电机并计时，调节转速为600转/分；将温度设定为25℃；启动pH控制器以15％的氨水维持反应液pH为7.5±0.1；在不同时间(10、20、30、40、50分钟)取样，参照公布号为CN1680558的中国专利申请中实例5所述，以HPLC法(色谱柱DiamonsilTMC18,250×4.6mm；流动相含50mM K2HP04/KH2PO4及5％乙腈，pH为7.0；柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为260nm)测定固定化D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7-ACA)的活力和转化率。一单位酶活力定义为在上述反应条件每分钟转化一微摩尔头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸的酶量。共进行7次反应，99％头孢菌素C均在50分钟之内被转化完毕；本实例测得固定化D-氨基酸氧化酶初始10分钟的酶活力不低于265单位/克。
实例10.整块开孔固定化细胞作为搅拌桨批量搅拌反应制备7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶将戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7-ACA)转化成7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)。戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶表达载体pT7-kan-ACY的构建根据已知的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶DNA序列(Matsuda，A.etal.，1987，J.Bacteriol.169，5821-5826)，设计PCR上游引物NdeI-ACY5’-CATATGAACGCTCCCGTCCCCGTCCC-3’，和PCR下游引物BglII-ACY5’-AGATCTTCAGATGGTGAAGCGGGCAC-3’。以假单孢菌SE83DNA为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一1,676bp产物。PCR条件为50ng假单孢菌SE83 DNA，0.4μM NdeI-ACY，0.4μMBglII-ACY，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH为8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100，2.5 U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。
PCR扩增反应程序为95℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，3分钟，循环35次；72℃，10分钟。该PCR产物(1,676bp)在5’和3’端分别含有NdeI和BglII酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，NdeI和BglII酶切后，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-kan连接，得pT7-kan-ACY，其具体核苷酸序列示于图7中。将pT7-kan-ACY转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-T7K-ACY。
以含卡那霉素(50mg/L)的20L LB液体培养基，在37℃培养大肠杆菌BL-T7K-ACY 24小时，离心收集菌体，得到湿菌体细胞。
将湿菌体细胞悬浮于4倍菌体重量的蒸馏水中。将三聚氰胺海绵切割成0.5×5.5×150cm(3.3g)的片带状，按以下操作顺序制备表达戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的大肠杆菌固定化细胞a)将海绵片带浸入细胞悬液中，挤压海绵使菌液在海绵中均匀分布，将海绵通过对滚轴挤压除去海绵上过多的菌液，调节两对滚轴的间隙使海绵上所吸附的菌液约为100g；b)向海绵加入300ml的0.1％的聚乙烯亚胺(pH为7.0)，挤压海绵以使聚乙烯亚胺均匀分布，海绵再次通过对滚轴以除去未被吸附的液体；c)向海绵加入300ml的0.1％的戊二醛溶液，挤压海绵以使戊二醛均匀分布并除去过多的液体；d)重复步骤a)至c)5次，每次重复步骤a)时，调节两对滚轴之间的间隙以使海绵再次吸附的菌液量约为70g，然后以蒸馏水挤压洗涤3次，通过挤压除去未被吸附的液体后，在流动空气中干燥10小时，得到戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶固定化细胞片带26g。
采用如图4所示的反应罐。将26g戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶固定化细胞片带卷绕成卷轴状并插入网盘中，按实例9所述方法操作反应罐，但不通氧气。关闭取样口5、通气口7、排气口16、输液口6、补液口15、排液口14及放料阀4；将实例9制备的戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸溶液从罐盖11上的进料口加入罐内，盖上并旋紧进料口螺盖18，启动电机并计时，控制温度为25℃，调节转速；启动pH控制器以5N NaOH维持反应液pH为8.0±0.1；在不同时间(10、30、60分钟)从取样口5取样，参照Binder，R.et al.，(1994，Appl.Environ.Microbiol.60，1805-1809)所述的方法，以HPLC法(色谱柱DiamonsilTMC18，250×4.6mm；流动相含50mM的K2HPO4/KH2PO4及5％的乙腈，pH为7.0；柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为260nm)测定戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶转化戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸为7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)的活力。一单位戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶活性定义为在上述反应条件每分钟转化一微摩尔戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸至7-氨基头孢霉烷酸的酶量。测得四次不同转速的实验中初始10分钟的酶活力，结果如表5所示。
表5

实例11.整块开孔固定化细胞作为搅拌桨批量搅拌反应制备高浓度7-氨基头孢霉烷酸使用实例10所用的戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶固定化细胞片带，并如实例10所述进行催化搅拌反应制备7-氨基头孢霉烷酸，惟使用320ml的高底物浓度(97.7mM)的戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸溶液以及搅拌转速为900rpm。如实例10所述测定戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的活力和转化率。测得初始10分钟的活力为61.78单位/克固定化细胞；10、20、30及40分钟的转化率分别为70.7％、87.40％、92.0％及93.36％。与实例10的数据相比，底物浓度提高26％之后，酶活力也相应提高约20％。
实例12.颗粒固定化酶作为搅拌桨批量搅拌反应按实例10发酵大肠杆菌BL-T7K-ACY24，然后4℃经离心机分离细菌(5,000g，8分钟)，弃上清液，得到湿细菌。将细菌重悬于400mL的磷酸钠缓冲液(50mM，pH为8)中。用珠磨法裂解细菌，以50mL/分钟的速度把细菌重悬液送进珠磨机(DYNO-MILL TYPKDL，直径为0.2mm的玻璃珠，WA Bachofen)内，再以600mL的磷酸钠缓冲液(50mM，pH为8)把细菌残留冲洗出来。将细菌裂解液放在55℃水浴中浸泡15分钟，高速离心(10,000g，30分钟)后取上清液，即为粗纯假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶。
固定化假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的制备参照载体供货商德国Rhm公司的说明进行，其中具体步骤有变更。取50g Eupergit C250L湿载体与1,900mL(蛋白浓度为3mg/ml)的如上所述制备的粗纯假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶混合，在室温下搅拌(300转，72小时)，静置片刻。然后过滤，用蒸馏水在室温下搅拌洗涤(300转，2分钟)，用3号砂芯漏斗抽干，重复洗涤步骤8次直至过滤液中的蛋白量少于0.1mg/mL，即得到202克固定化戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶颗粒。
采用如图4所示的反应罐，将200克固定化戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶颗粒装入网盘20中，将网盘20的内表面(底、盖、周)衬以200目的滤布，以防颗粒漏出。之后，反应条件、检测方法及反应罐的操作等与实例10基本相同，只是转速为800rpm，底物为300mL浓度为75mM的戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸制备方法参见Shibuya，Y.et a1.，1981，Agric.Biol.Chem.45，1561-1567)，取样时间为5、15、30和60分钟。如实例10所述测定戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的转化率。测得5、15、30及60分钟戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸转化为7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)的转化率分别为49.16％、62.23％、79.33％及93.49％。
实例13.对苯醌的还原用定性滤纸102(杭州新华纸业有限公司)将10％Pd/C催化剂20克(BDH Laboratory Suppliers Poole，England)包成3cm×3cm小包，再用450目滤布包裹固定在图4所示的反应器网盘内壁。将5克对苯醌(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)溶于500毫升甲醇，加入6 M HCl一滴。将对苯醌甲醇溶液注入图4所示的反应罐中，参照实例2操作反应罐。转速控制在500rpm；通入氢气，氢气流量控制在为2L-3L/min。用754型紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)在435nm处测定反应液的OD值，计算对苯醌的还原率。测定结果如表6所示表6

实例14.丹参酮II A的还原所用催化剂、反应罐及其操作均参照实例13所述。底物溶液为含406毫克丹参酮II A(中山大学古练权教授提供)的乙醇溶液(500毫升)。将丹参酮II A乙醇注入反应器中，开启反应器，转速控制在500rpm；通入氢气，氢气流量控制在为2L-3L/min。用754型紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)在435nm处测定反应液的OD值，计算对苯醌的还原率。测定结果如表7所示表7

通过上述应用实例可见，与现行的反应器相比，本实用新型采用整块的固相催化剂或使用网盘/网桶大量装载固相催化剂，反应罐内固相催化剂的密度可远远超过现有的搅拌式反应器，达到罐体总容量的95％或以上，反应速度可因之提高，反应时间则相应缩短。这对容易降解的底物或产物尤为有利。高密度的固相催化剂用量更可提高反应时底物的浓度，进而加快反应速度，并有助于产物的纯化、结晶等和提高产率。而且反应时，网盘/网桶20内的固相催化剂相对于转轴21保持静态，也不直接与反应罐罐壁相撞，由此避免了搅拌式反应器中固相催化剂与搅拌器、固相催化剂与罐壁、以及固相催化剂之间的碰撞而造成的破裂和磨损，从而延长固相催化剂的使用周期，也减少反应液中催化剂、酶蛋白、固定化载体碎片及细胞碎片等杂质，便于产物纯化。另外，在反应时，由于离心作用，反应液与固相催化剂表面之间的传质加快，因此相对于填充床反应柱，本实用新型反应的催化效率大大提升。
本专利申请中参照的各种文献的全部公开内容，无论是专利文献还是非专利文献，全部以引用方式并入本文。另外，本实用新型不受上述具体实施方式
和应用实例的限制。本实用新型可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变也在本实用新型的范围之内。
权利要求1.一种反应器，包括至少一个反应罐，所述反应罐包括罐体、安装于罐体内可转动的转轴，其特征在于所述反应罐还包括固定在所述转轴上的用于容纳固相催化剂的容器，所述容器具有外壁，在整个外壁上分布有可通透反应液和气体但不通透所述固相催化剂的孔。
2.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述外壁具有第一端面、第二端面以及在第一端面和第二端面之间延伸的周壁。
3.根据权利要求2所述的反应器，其特征在于所述外壁的第一端面和第二端面设置有用于穿插转轴的孔，所述孔的形状和大小与转轴相匹配。
4.根据权利要求3所述的反应器，其特征在于所述孔设置在所述容器的第一端面和第二端面上的中央位置处。
5.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述容器还包括内筒，所述内筒的内径与转轴的外径相匹配。
6.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述反应罐为直立式。
7.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述容器的容积与反应罐的体积之比在1％至95％之间。
8.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述转轴具有与罐体内外相通的用于输送液体和/或气体的信道。
9.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述容器与转轴之间采用螺栓固定方式。
10.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述容器与转轴之间采用卡箍固定方式。
11.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述容器与转轴之间采用单键或花键固定方式。
12.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述固相催化剂为颗粒状。
13.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于所述固相催化剂为整块的。
14.根据权利要求1所述的反应器，所述固相催化剂为固定化酶/固定化细胞。
15.根据权利要求12所述的反应器，所述颗粒状固相催化剂为固定化酶/固定化细胞。
16.根据权利要求13所述的反应器，其特征在于所述整块的固相催化剂为固定化酶/固定化细胞。
17.根据权利要求15或16所述的反应器，其特征在于所述固相催化剂是由酶或表达酶的细胞与开孔的多孔有机泡沫材料制成的。
18.根据权利要求17所述的反应器，其特征在于所述有机泡沫材料包括木浆海绵、聚乙烯醇海绵和三聚氰胺海绵。
专利摘要本实用新型公开一种反应介质为液体的反应器，该反应器包括至少一个反应罐，所述反应罐包括罐体、安装于罐体内可转动的转轴，所述反应罐还包括固定在所述转轴上的容器，所述容器具有外壁，在整个外壁上分布有可通透反应液和气体的孔。本实用新型提供的反应器能够防止催化剂活力下降、延长催化剂的使用寿命，并具有交换效率高、反应充分以及应用范围广的特点。
文档编号B01J8/10GK2899927SQ200620001730
公开日2007年5月16日 申请日期2006年1月24日 优先权日2006年1月24日
发明者王骏, 金彩科 申请人:百瑞全球有限公司