专利名称：：因子Ⅷ和冯威勒布兰特因子的亲和吸附剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及化合物和它们用作亲和配体的用途。
背景技术：
：因子VIII(之前称为抗血友病因子)是在循环血浆中发现的~200ng/mL水平的糖蛋白。天然存在的成熟单链蛋白由于糖基化而具有265270kDa的不同分子量，但是由于在体内的等位变异、糖基化、诱发变异和片段化而在血浆中观察到170-280kDa较宽范围分子量的蛋白。许多重组因子VIII产物是可以得到的，并且在蛋白结构和分子量上变化很大。血浆因子VIII具有额外的复杂因子，其以与冯威勒布兰特因子(vWF)紧密结合的形式存在，复杂的多聚蛋白也涉及凝块。vWF本身，单独地或与因子VIII结合，具有治疗应用。在vWF/FVIII转化为纤维蛋白的过程中，因子VIII促进了复杂凝块级联达到顶点，并形成纤维蛋白凝块。因子VIII产生过程中的遗传异常导致A型血友病，主要表现为由于凝块形成的减少或缺乏而导致的重复性出血事件。A型血友病及其症状(比如不可控的出血)可以用从血浆得到的或重组的因子VIII处理。使用适当的给药法，预防性地应用因子VIII可以显著地降低出血事件的次数和严重程度，包括在外科手术过程中观察到的那些。从血浆中纯化因子VIII/vWF或从重组源中纯化因子VIII是复杂的过程，通常包括许多色谱和/或沉淀和/或病毒灭活步骤。从血浆中纯化通常还包括初始的冷冻沉淀和重组步骤。这些复杂的纯化步骤和内在的蛋白不稳定性结合，导致不良的纯化产物收率。已经描述了免疫亲和色谱，但是除了其本身的昂贵性以外，所用的色谱材料也缺乏稳定性和可清洁性，导致重复利用非常受限。基于肽配体的介质作为免疫亲和介质具有类似的问题，没有被广泛接受。获得能够从许多源以迄今不可能的产率、纯度和成本有效性分离因子VIII或因子Vlll/冯威勒布兰特因子的色镨材料将是所希望的。WO97/10887公开了用作亲和吸附剂的式I的基于三,的化合物:其中&是H、烷基、羟烷基、环己基、NH2、苯基、萘基、1-苯基吡唑、丐l唑、苯并噢唑、苯并D恶唑或苯并咪唑，任意的这些芳基可以被烷基、烷氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、NH2、OH、C02H、磺酰基、氨基曱酰基、M磺酰基、烷基磺酰基和卤素中的一个或多个取代；一个X是N，另一个是N、C-C1或C画CN;Y是O、S或NR2;Z是O、S或NR"R2和R3各自是H、烷基、羟烷基、苯甲基或p-苯乙基；Q是苯、萘、苯并逸唑、苯并P恶唑、l-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R4、Rs和R6各自是H、OH、烷基、烷氧基、氨基、NH2、酰氧基、酰氨基、C02H、磺酸、氨基甲酰基、氨基磺酰基、烷基磺酰基或卤素；!i是0-6^p是0-20;和A是载体基体，任选地通过间隔基连接到三嗪环。式I的化合物公开为对于蛋白比如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素具有亲和性。相关结构的化合物公开在WO00/67卯0和WO03/097112中。它们对于内毒素具有亲和性。
发明内容意外地，已经发现某些化合物可用于vWF/FVIII基于亲和性的分离，这些化合物中有许多是新的。这些化合物具有式II:A<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中X、Y、Z、n和A如上式I定义的；R7是在中性pH下带有正电荷的基团；W是任选的连接基；V是如上对于Q所述的，但是作为替代方案可以为节结构；和Rs和R9为如对于R4、Rs和R6定义的，但还包括环状结构，或R8和R9连接以形成这种环状结构。另外，本发明的化合物包括相应的配体，其中A被官能团代替，直接地或间接地连接到三嚷环，其可以固定在载体基体上。下文中，术语"配体"和"吸附剂"可互换地使用。具体实施例方式WO97/10887、WO00/67900和WO03/0971127〉开了如何可以在固体载体上建立配体的组合库。它们的公开内容，包括实施方案的实施例和与本发明相同的步骤，通过参考引入本发明中。在用作为原料的人血浆池筛选这些组合库组期间，许多配体确定为能够选择性地结合和洗脱人vWF/FVin。可以通过本领域技术人员已知的方法制备用于本发明的式II的化合物。这种方法记载于上述3个PCT公开中；它们可以容易地适用于新化合物的制备。WO97/10887给出了A的实例，包括间隔基或连接基L,通过其三唤环可连接到固体载体M。如WO97/10887所述，这种载体包括琼脂糖，琼脂糖凝胶，二氧化硅，纤维素，右旋糖酐，淀粉，藻酸盐，角叉菜聚糖，合成聚合物，玻璃和金属氧化物。在反应以形成本发明的吸附剂以前可以活化这种材料。L例如可以为-T+V1-V2)m-，其中T是O、S或-NR、；m是0或1jV1是任选地取代的2~20个C原子的烃基；和V2是O、S、-COO画、誦CONH國、國NHCO-、-P03H-、-NH-亚芳基SO;rCH2-CH2-或-NR8國；和R7和R8各自独立地为H或d-6烷基。在本发明的化合物中，R7优选是式NRk)Ru的仲胺或例如更优选的叔胺，其中R^和Ru各自独立地为d-6烷基(比如乙基)，或NRgR9形成环，或R^和Rn之——起形成环，或与连接基W中的原子一起形成环。连接基W可以为烷基、芳基或芳烷基连接基，例如具有2~7,优选34个链原子，其本身可被取代，例如被OH基团取代。另一个"臂"即z-B-D的性质可以是较不关键的。在本发明的一个优选实施方案中，通过结构III表示结合vWF/FVin的吸附剂。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>III在本发明的另一个优选实施方案中，结合vWF/FVIII的吸附剂由结构IV表示(在生理pH时质子化)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>iv在本发明的一个最优选实施方案中，通过如下所示的结构V表示结合vWF/FVIII的吸附剂<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>本发明中记载的结合vWF/FVIII的配体和吸附剂可用于从复杂混合物纯化vWF/FVIII，所述复杂混合物包括但不限于人血浆和重组发酵上清液。这些应用在以下实施例4中说明，使用人血浆池进行色镨实验。术语"vWF/FVIII"在本发明中是指vWF/FVIU本身以及具有vWF/FVIII功能特点的类似物，例如，就对于本发明中记载的给定化合物的亲和性而言。因此，所述分析物可以是作为vWF/FVIII功能片段的蛋白，或具有所有相同结合位点中的一个、多个的结构类似物，或融合蛋白。以下实施例说明本发明。二氯三嗪基-(R)-1-(3-甲氧基苯基)-乙胺的合成将溶于丙酮(35mL)中的氰尿酰氯(5.0g)冷却到0'C，之后在冷却下用30分钟逐滴加入溶于丙酮(50ml)中的(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺(4.1g)，以确保温度不超过5。C。然后慢慢地加入10M氢氧化钠(2.71mL)。45分钟之后，在搅拌下将反应混合物加入到冰水(20g)中。将油状产物萃取到二氯曱烷(150mL)中，用无7K硫酸镁干燥，蒸发得到黄色油状产物(7.96g)。实施例1吸附剂V的合成向氨基-SepharoseCL-4B(475g重，沉降在水中-16nmol/g取代)中加入二甲基甲酰胺(DMF)(475mL)。加入二异丙基乙胺(4.37mL),搅拌混合物15分钟，之后将溶于DMF(250mL)中的二氯三嚷基-(R)-l-(3-曱氧基苯基)-乙胺(7.57g)加入到反应混合物中。搅拌该混合物3小时，之后用70。/。含水DMF(4x500mL)、50%含水DMF(2x500mL)和水(llx500mL)洗所述凝胶。在60'C将150g(沉降的)该材料在水(75mL)中浆化，并分批加到N,N-二乙基-1，3-丙二胺(3.8mL)在7JC(75mL)中的溶液中。加入之后，再次温热所述混合物到60。C，并在该温度下搅拌19小时。然后滤出凝胶并用水(12x150mL)洗，之后存储在20%含水乙醇防腐剂中。实施例2吸附剂III的合成在60'C在水(75mL)中浆化来自实施例2的中间凝胶产物(150g沉降的)，并分批加入到2-(2-氨乙基)-1-曱基吡咯烷(3.5mL)在水(75mL)中的溶液中。加入之后，再次温热所述混合物到60'C，并在该温度下搅拌19小时。然后滤出凝胶并用水(12x150mL)洗，之后存储在20%含水乙醇防腐剂中。实施例3吸附剂IV的合成将氨基-SepharoseCL-4B(100g重，沉降在水中-16^111101/§取代)悬浮在1MpH7.0的磷酸钾(100mL)中，然后排水。然后向该凝胶中加入1MpH7.0的磷酸钾(25mL)和RO水(250mL)。剧烈搅拌所述浆，同时加入丙酮(50mL)。在冰/盐浴中冷却30分钟之后，一次性加入在冷丙酮(25mL)中的氰尿酰氯(2.5g)。在(TC搅拌该混合物1小时，然后用50%含7^丙酮(5x100mL)、RO7JC(5xl00mL)、50。/o含水丙酮(5x100mL)和RO水(10xl00mL)洗。然后在室温下，用含有2-氨基丁醇(lg)的50"/o含水DMF(100mL)浆化该沉降的凝胶4小时。过滤浆，然后用50%含水DMF(5x100mL)和RO7jC(10x100mL)洗。然后用含有4-氨基-a-二乙基氨基-o-甲酚二盐酸盐(4.2g)的50%含水DMF(100mL)浆化所述沉降的凝胶，并用氢氧化钠(IOM)调节至pH9,并;60。C搅拌过夜。过滤浆，然后用50%含7&DMF(5x100mL)和RO7jC(i0x100mL)洗。将该凝胶在40'C在最终浓度0.5M的NaOH/25。/。乙醇中培养3天，然后用0.5MNaOH/25。/o乙醇(5xl00mL)洗，然后用RO水(10x100mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入1.0MNaOH(100mL)，并在40'C培养所述混合物3天。然后用0.5MNaOH(5xl00mL)洗所述凝胶，然后用RO水(10xl00mL)洗。所述凝胶用pH7.0的0.1MPBS(3xl00mL)洗后，再次用RO水(10xl00mL)洗，之后在冷室中在4。C在20%v/v含水乙醇中存储。实施例4用吸附剂V对人血浆进行色镨分析的实施例使用低压色镨系统(Kipp&Zonen平床图表记录器，Gilsonminipuls3蠕动泵和GilsonUV检测器)，使用20mL柱容积的1.6cmi径XK16/20柱进行色镨实验。用5柱容积的20mMTris.HCI、20mM柠檬酸钠、140mM氯化钠pH7.5，以80cm/小时平衡所述柱。用20mMTris.HCl和100mM氯化钠(最终浓度)处理人源血浆。lOpm过滤200mL经处理的血浆，然后以80cm/小时加入。加入后，用20mMTris.HCl、20mM柠檬酸钠和140mM氯化钠pH7.5洗至基线吸收度。然后用20mMTris.HCl、20mM柠檬酸钠、3mMCaC12、30。/。乙二醇和500mM氯化钠和0.01%Tween80pH7.5洗脱所述柱。洗脱后，用8M脲pH7.0对柱进行消毒。随后用0.5M氢氧化钠清洗所述柱。通过浊度测定法、vWFELISA和因子VIII显色活性试验分析加入的、未结合的和洗脱的级分，以确定回收率。还进行SDSPAGE以研究纯度。回收率列于表l中。来自吸附剂V色镨分析的vWF/FVIII的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通过显色活性试验(COATESTVIII:C/4，由Chromogenix提供)确定因子VIII结果。结果以国际单位(IU)表示，其中正常人血浆每mL含有1国际单位的因子VIII活性。由ELISA确定vWF结果。权利要求1.亲和吸附剂用于分开、除去、分离、纯化、表征、鉴别或量化因子VIII、冯威勒布兰特因子或作为二者任一种的类似物的蛋白的用途，其中所述亲和吸附剂是式II的化合物其中一个X是N，另一个是N、C-Cl或C-CN；A是载体基体，任选地通过间隔基连接到所述三嗪环；Y是O、S或NR2；Z是O、S或N-R3；R2和R3各自是H、C1-6烷基、C1-6羟烷基、苯甲基或β-苯乙基；B和W各自是含有1～10个碳原子的任选地取代的烃键；D是H、OH或伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵、咪唑、胍基或脒基；或B-D是-CHCOOH-(CH2)3-4-NH2；和R7是在中性pH下带有正电荷的基团。2.权利要求1的用途，其中R7是仲胺或叔胺。3.权利要求2的用途，其中所述胺形成环的一部分。4.前述权利要求任一项的用途，其中B或W包括芳基。5.权利要求1的用途，其中所述吸附剂具有式III。6.权利要求1的用途，其中所述吸附剂具有式IV。7.权利要求1的用途，其中所述吸附剂具有式V。8.前述权利要求任一项的用途，其中所述吸附剂与血浆样品接触。9.一种新型化合物，其具有前述权利要求任一项中所定义的式II。10.—种化合物，其是根据权利要求9的化合物的前体，其中A被官能团代替，直接地或间接地连接到所述三溱环，这允许所述前体固定在固体载体上。全文摘要为分开、除去、分离、纯化、表征、鉴别或量化因子VIII、冯威勒布兰特因子或作为二者任一种的类似物的蛋白，使用亲和吸附剂，其是式(II)的化合物，其中一个X是N，另一个是N、C-Cl或C-CN；A是载体基体，任选地通过间隔基连接到三嗪环；Y是O、S或NR<sub>2</sub>；Z是O、S或N-R<sub>3</sub>；R<sub>2</sub>和R<sub>3</sub>各自是H、C<sub>1-6</sub>烷基、C<sub>1-6</sub>羟烷基、苯甲基或β-苯乙基；B和W各自是含有1～10个碳原子的任选地取代的烃键；D是H、OH或伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵、咪唑、胍基或脒基；或B-D为-CHCOOH-(CH<sub>2</sub>)<sub>3-4</sub>-NH<sub>2</sub>；以及R<sub>7</sub>是在中性pH下带有正电荷的基团。文档编号B01J20/32GK101171076SQ200680015918公开日2008年4月30日申请日期2006年5月9日优先权日2005年5月9日发明者巴尔德夫·辛格·贝纳斯,詹森·理查德·贝特利申请人:普罗米蒂克生物科学有限公司