专利名称：能够降解二噁烷的黄色杆菌d7及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株能够降解二噁烷的新菌株一黄色杆菌D7及其应用。 背景技术：
二噁烷(l，4-DioXane)亦称1，4-二氧六环、双乙酐，是一种具有乙醚味的可燃性液体，毒性较大，被美国环保署列为B2级(可能的)人类致癌物。二噁烷作为一种重要的有机化工溶剂，在医药、化妆品、香料等特殊精细化学品制造以及科学研究中作为溶剂、反应介质、萃取剂使用。另外，许多表面活性剂也含有二噁烷，这些表面活性剂常被用于各种消费产品，如各种家用洗涤剂。二噁烷溶解能力强，而且相关研究表明，二噁烷是一种细胞色素酶P450的抑制剂，可通过呼吸道、消化道、皮肤进入机体。低浓度时对皮肤和粘膜有麻醉和刺激作用；并且会在体内蓄积。如接触大量蒸气将引起眼和上呼吸道刺激，且伴有头晕、 头痛、嗜睡、恶心、呕吐等症状。另外，二噁烷可致肝、皮肤损害，甚至发生尿毒症。二噁烷的广泛应用使其对地下水及大气的污染日益严重，因此急需寻求一种有效的方法对其进行去除。二噁烷是含有两个相对称醚键的环状有机化合物，这种化学结构使其具有高水溶性和高耐生物降解性，因而二噁烷曾一度被认为“不可生物降解”。随着 Dmitreko等于1987年从反应器中分离到了能利用二噁烷的混合菌株ArthrcAacter sp.、 Pseudomonas sp.和Bacillus sp.，越来越多的研究者开始了生物法处理二噁烷的研究。 1993年，Sock等在连续流附着式反应器中，培养出以二噁烷为唯一碳源和能源的混合菌群。Roy研究表明，经过32天的适应期，活性污泥填充反应器可完全降解150mg/L的二噁烷，但高浓度的二噁烷不能被完全降解，可能是由于有毒副产物的抑制作用。另外一些研究者已经证明了纯菌可以降解二噁烷。Bernhardt和Diekman等学者分离的Rhodococcus sp.可矿化高浓度(880mg/L)的二噁烷，但能否持续生长却不得而知。同时，他提出了二噁烷的生物降解途径可能是先经过羟基化，而后再开环。1993年，Burtack和Perry分离出了具有降解二噁烷的MyccAacterium vaccae,但该菌株降解二噁烷的能力是有限的，且不能持续生长。1994 年，Parales 分离的 Nocardioform actinomycetes CB1190 可以二噁烧为唯一碳源和能源物质，并持续生长，最终将其矿化，其降解速率是0. 3;3mg/(mg蛋白· min)。 Nakamiya等分离出的真菌Cordyaps sinensis也能以二噁烷为唯一碳源和能源生长。目前国内对二噁烷的研究较少。浙江大学陈红研究了厌氧条件下，铁还原菌-Fe (III)-腐殖酸生物/非生物协同作用和在腐殖酸还原菌生物/非生物协同作用两个体系下的二噁烷降解情况。研究表明，铁还原菌-Fe(II)-腐殖酸生物非生物协同作用， 40天二噁烷去除率达到了 90. 47%，加入不同量的氧化铁对二噁烷降解影响不大，但是增加溶解态狗(III)加入量却对二噁烷的氧化降解效率有一定提高。而腐殖酸还原菌-腐殖酸-Fe (III)生物/非生物协同作用，40天内二噁烷基本降解完全。迄今尚未有黄色杆菌降解二噁烷的报道。
发明内容
本发明一株能够降解二噁烷的新菌株——黄色杆菌D7及其应用。本发明采用的技术方案是能够降解二噁烷的黄色杆菌(Xanthobacter sp. )D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2010年09月09日，保藏编号CCTCC NO :M 2010225。本发明所提供的二噁烷降解菌D7来源于浙江某化工厂污水处理池的活性污泥， 经人工驯化、富集、分离得到。该菌是一株革兰氏阴性菌，菌落特征如下菌体呈短杆状，大小为(0.5 0.7) μ mX (0.8 1.0) μ m，无芽孢；菌落呈小圆状、黄色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；氧化酶、柠檬酸盐为阳性；接触酶、V. P.反应、M.R.反应、吲哚反应为阴性；糖发酵实验阴性，革兰氏染色阴性。本发明还涉及所述的黄色杆菌D7在微生物降解二噁烷中的应用。可按照本领域常规方法，将黄色杆菌D7接种至含二噁烷的废水中，或者将含二噁烷的废气通入黄色杆菌 D7菌液中，对废水或废气进行处理。优选的，所述降解在pH 4. 0 10、25°C 40°C下进行。Xanthobacter sp. D7能利用二噁烷作为唯一碳源和能源生长繁殖，将二噁烷矿化成(X)2和H20。在纯培养条件下，该菌在48h内能将无机盐培养基中100mg/L的二噁烷完全降解。所述无机盐培养基(BSM)每IOOOmL 含有Νει2ΗΡ04 · 12Η20 0· 1 6. Og/L、KH2PO4 0· 1 4. Og/L、(NH4)2SO4 0· 1 3. 0g/L、MgSO4 · 7Η20 0. 05 0. 6g/L、CaCl2 · 2H20 0. 01 0. lg/L，微量元素母液0. 5 5mL，二噁烷0. 01 5mM，pH 4. 0 10. 0。微量元素母液浓度组成=FeSO4 · 7H20 1. 0g/L、CuSO4 · 5Η200· 02g/L、H3BO3 0. 014g/L、MnSO4 · 4H20 0. 10g/L、 ZnSO4 · 7H20 0. 10g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 0. 02g/L，溶剂为水。所述黄色杆菌D7降解二噁烷不需要经过诱导阶段，即可稳定有效地降解二噁烷。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一株二噁烷的高效降解菌，该菌株为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能够以二噁烷为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物；并且该菌株不需要经过诱导阶段，可稳定的降解底物二噁烷。本发明为生物法净化含二噁烷废水及废气的工程应用奠定了基础。
图1为黄色杆菌D7的透射电镜照片；图2上为黄色杆菌D7的菌体生长、二噁烷降解和有机碳含量曲线图；图3为不同pH下黄色杆菌D7对二噁烷降解率的影响；图4为不同温度下，黄色杆菌D7菌体生长和二噁烷浓度的变化情况；图5为黄色杆菌D7经过不同培养基预培养后转接入含二噁烷的新鲜BSM培养基中，菌体对二噁烷的降解情况；-■ -R2A/BSM表示在R2A溶液中预培养菌体接种至新鲜BSM 中的二噁烷降解情况；-· "BSM/BSM表示在BSM培养基上培养后收集菌体接种至新鲜BSM 中的二噁烷降解情况。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 Xanthobacter sp. D7 的分离与鉴定(1)样品采集及驯化现场采集浙江某化工厂污水处理池的活性污泥，以二噁烷为唯一碳源和能源，进行驯化、富集。数月后，将活性污泥接种到含50mL BSM培养基的250mL密封盐水瓶中，以二噁烷作为唯一碳源和能源，继续培养、富集。实验需恒温(30士 1°C)，并保持在好氧条件下进行。BSM 按如下组成配制:4. 5g Na2HPO4 · 12Η20、1· Og KH2PO4U. 5g NH4CUO. 2g MgSO4 · 7H20、0. 023g CaCl2, ImL 微量元素母液，水补足至 1000mL。微量元素母液浓度组成=FeSO4· 7H20 1. Og/L、CuSO4 · 5H20 0. 02g/L、H3BO3 0. 014g/L、MnSO4 ·4Η20 0. lOg/L, ZnSO4 · 7H20 0. lOg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 02g/L, CoCl2 · 6H20 0. 02g/L，溶剂为水。(2)菌株分离与鉴定将在盐水瓶中经过多次传代富集的混合菌液，进行稀释涂布，依据菌体群落的差异性，挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接至以二噁烷为唯一碳源和能源的 BSM中，测试降解活性。选择具有二噁烷降解能力的纯菌，进一步分离纯化，获得有二噁烷降解活性的菌株D7。菌株D7细胞呈短杆状，大小为(0. 5 0. 7) μ mX (0. g 1· 0) μ m，无芽孢；菌落
呈小圆状、黄色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。D7的生理生化特征为好氧，氧化酶反应为阳性，柠檬酸盐为阳性；接触酶、 V. P.反应、M.R.反应、吲哚反应为阴性；糖发酵实验阴性，革兰氏染色阴性。上述特征与文献(《常见细菌鉴定手册》)编录的黄色杆菌的生理生化性状相吻合。该菌株经16S rDNA同源性分析，结合以上生理生化的菌学特征，将其鉴定为黄色杆菌属(Xanthobacter sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO =M 2010225。实施例2 :Xanthobacter sp. D7 (CCTCC NO :M 2010225)降解二噁烧的性能种子液制备D7接种于R2A斜面中培养3天，再从斜面接种至含100mg/L 二噁烷的BSM培养基中培养2天，1200rpm/min离心5min，弃去上清液，用生理盐水润洗菌体2次， 配成菌悬液，即为实验的种子液。以二噁烷作为Xanthobacter sp. D7的唯一碳源，从种子液中接菌体至50mL BSM 培养基，使初始菌体浓度(以OD计)为0. 01 ；加入二噁烷使初始二噁烷浓度为100mg/L。 放入温度为30°C、转数为160r/min的摇床中培养，每隔一段时间取一次样，结果见图2。随着时间的延长，菌体浓度逐渐增大，至4 时，菌体浓度达到0. 178 (以OD计)。本实施例说明降解菌Xanthobacter sp. D7可利用二噁烷作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有稳定高效降解二噁烷的能力。用lmol/L NaOH或 HCl 溶液调节 BSM 培养基为不同 pH值(4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、 6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5、10. 0)，在初始二噁烷浓度为100mg/L的条件下，接入种子液，使各平行样中的初始菌体浓度(以OD计)为0.01。将样品于3(TC、160r/min恒温摇床里振荡培养，培养40h后取样，测菌体及反应液中残余二噁烷的浓度。实验过程中，设计 3个平行样和一个空白对照(下同)，结果见图3。可见，在pH4. 0 10. 0，微生物均能降解二噁烷并伴随细胞浓度的增加；随着pH 从4. 0增大到10. 0，菌体浓度及二噁烷降解率均先增大后减小，Xanthobacter sp. D7降解二噁烷的较适宜的PH值为7. 0。本研究表明菌株D7在pH4. 0 10. 0均能不同程度地降解二噁烷，为其在不同PH环境的应用提供了保证。在初始二噁烷浓度为100mg/L的BSM培养基中，接入种子液，使各平行样中的初始菌体浓度为0. 01 (以OD计)。将各个样品分别置于温度为25°C、30°C、37°C、40°C摇床中恒温振荡培养(摇床转数均为160r/min)，定时取样，测菌体及反应液中残余二噁烷的浓度。 由图4可知，在25°C 40°C温度范围内，Xanthobacter sp. D7均能生长，但温度在37°C以上时，D7的生长明显较低温的缓慢。当温度为37°C，细胞生长速率最快，3 即达稳定期， 菌体浓度(以OD计)达0. 180，体系中的二噁烷被完全降解，去除率达到100%。随着温度的进一步下降，菌株的生长和降解能力开始下降。将Xanthobacter sp. D7分别接种于R2A液体培养基和BSM培养基中进行预培养后收集菌体制成悬浊液作为种子液。于50mL BSM培养基中加入100mg/L底物二噁烷，分别接入Xanthobacter sp. D7种子液使初始浓度达到0. 4 (以OD计)，于30°C、160r/min的摇床中进行降解实验。结果如图2所示，在高浓度菌液下，经过R2A液体培养基预培养的 Xanthobacter sp. D7较BSM培养基稍慢，但在降解底物二噁烷的初期没有明显的停滞期。 可初步判定Xanthobacter sp. D7不需要经过诱导阶段，即可达到降解二噁烷的目的。该研究有利于进一步扩大生产，使其应用于生物法净化含二噁烷废水及废气的工程。实施例3 =Xanthobacter sp. D7净化二噁烷废水在生物滴滤塔中接种Xanthobacter sp. D7菌液连续处理浓度为100mg/m3的二噁烷废气。经过25天的挂膜启动后，生物滴滤塔二噁烷废气的净化效率达93%以上，此后系统能一直稳定运行。
权利要求
1.能够降解二噁烷的黄色杆菌(Xanthobactersp.)D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2010年09月09日，保藏编号CCTCC NO: M 2010225。
2.如权利要求1所述的黄色杆菌D7，其特征在于所述黄色杆菌D7菌落特征如下菌体呈短杆状，大小为(0.5 0.7) μ mX (0.8 1.0) μ m，无芽孢；菌落呈小圆状、黄色、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长；氧化酶、柠檬酸盐为阳性；接触酶、V. P.反应、 M.R.反应、吲哚反应为阴性；糖发酵实验阴性，革兰氏染色阴性。
3.如权利要求1或2所述的黄色杆菌D7在微生物降解二噁烷中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解在pH4. 0 10、251 401下进行。
全文摘要
本发明提供了一株可降解二噁烷的新菌株一黄色杆菌D7及其在微生物分解处理二噁烷的应用。黄色杆菌(Xanthobacter sp.)D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2010年9月9日，保藏编号CCTCC NOM 2010225。本发明提供的二噁烷降解菌为好氧非发酵型革兰氏染色阴性菌，能利用二噁烷作为唯一碳源与能源繁殖并将该底物矿化成CO2和H2O；在纯培养条件下，该菌于pH4.0～10、25℃～40℃范围内均能将二噁烷降解；该菌株有较强的环境适应能力，可用于污染环境的生物修复，为生物法净化含二噁烷废水及废气的工程应用奠定了基础。
文档编号B01D53/84GK102168038SQ20101057207
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者朱润晔, 金小君, 陈东之, 陈建孟 申请人:浙江工业大学