专利名称：一种用于微球多元生物检测的微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用于微球多元生物检测的微流控芯片及其制备方法。该芯片用于检测蛋白质、DNA等生物分子，能够广泛应用于临床检测、检验检疫、环境监测、药物筛选、微生物鉴定以及核酸和蛋白功能分析等领域。
背景技术：
微流控分析芯片是指通过微细加工技术在芯片上构建由储液池、微反应室、微管道等微功能元件构成的微流路系统，加载生物样品和反应液后，在压力泵或者电场作用下形成微流路，于芯片上进行一种或连续多种的反应，以实现对组织和细胞中DNA、蛋白质和其他生物组分的高通量快速分析。它是20世纪90年代初中期在分析化学领域发展起来的一种分析技术，以分析化学和分析生物化学为基础，应用微机电加工技术，在微芯片上加工出微米级的容器、泵、阀、管道等微结构网络，将采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等过程进行集成的微全分析系统。芯片的大小在几个平方厘米左右，选用硅片、玻璃、石英、高聚物等材料作为芯片基本载体，通过蚀刻、光刻或印模等方法加工微通道，采用电、压力、重力、离心力等方式驱动通道内的流体，最后采用化学发光、电化学、吸收光度、荧光检测器等进行检测。该芯片在装置上的主要特征是其容纳流体的有效结构(包括其通道、反应室和其它功能部件)至少在一个维度上为微米级尺度。与宏观尺度的实验装置相比，微流控芯片的微米级结构显著增大了流体环境的比表面积。这一变化在微流控系统中导致一系列与物体表面有关的决定其特殊性能的特有效应，如层流效应，表面张力及毛细效应，快速热传导效应以及扩散效应等。这些效应可以使微流体分析芯片的分析性能得到显著的改善，包括可以使分析装备的体积减小，装备更加的集成化自动化，可以显著提高分析效率以及使试样和试剂消耗显著下降等。把实验室大型设备集成在尽可能小的操作平台上，用以完成不同的实验过程，并能对产物进行分析的技术。它不仅使试剂的消耗降低，而且使实验速度提高，费用降低，充分体现了当今实验室设备微型化、集成化和便携化的发展趋势。现在微流控芯片已在生物化学分析和环境分析诸方面发有了广泛的应用和快速的发展。由于微流控芯片将整个样品分析的过程，包括取样和样品的处理、预浓集、稀释和混合、分离、化学反应和信号检测全部集成化在一块小的芯片上，它与传统的分析装置相比实现了亚微升甚至纳升级的试剂和样品消耗，反应空间的大大缩小使反应的均一性提高，反应速度加快，同时降低了生产成本并便于携带。
发明内容
技术问题:本发明的目的是提供一种以微球为固相载体进行生物分子检测的微流控芯片。将固定有生物探针分子的编码微球通过芯片进行进样、与待测样品反应、洗涤和检测，提供一种检测分析的芯片平台。技术方案:本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
一种用于微球多元生物检测的微流控芯片，其特征在于:该微流控芯片包括盖片、基片以及方孔阵列，所述的盖片上设置有多个并列的进样通道和与所述进样通道连通的反应池，该反应池的出口位于所述的盖片的内表面上；所述的基片上设置有多个并列的出样通道和与所述出样通道连通的出样池，该出样池的入口位于所述基片的内表面上；所述的方孔阵列位于所述盖片的反应池和基片的出样池之间；在所述基片出样通道的出样口还连接有一液滴导出管；在所述反应池内设置有编码的微球，在该微球的表面固定有生物分子探针；所述方孔阵列的孔径小于所述微球的直径。微球的大小在45 μ m 300 μ m之间；反应池和出样池的直径均在1.5mnT2.5mm之间，反应池和出样池的高度均在300 μ πΓ 200 μ m之间，进样通道的进样口直径在200 μ m 1000 μ m之间，长度在5mm 20mm之间；方孔阵列的孔径在40 μ πΓ290 μ m之间。所述生物分子探针是核酸、蛋白质或多肽。所述微球的材料是二氧化硅或聚苯乙烯和聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶；所述盖片的材料是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或聚碳酸酯；所述基片的材料是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或聚碳酸酯；方孔阵列的材料是聚合物膜、硅片或铜网。微球的编码是条形码编码、荧光编码、量子点编码、光子晶体编码、拉曼标签编码、红外光谱编码、形状编码、射频编码、大小编码或位置编码。其工作原理是:
a)利用移液枪吸取一定量的编码微球，将微球连其运载缓冲液通过进样通道的进样口，注入出样池。由于方孔阵列的尺寸小于编码微球的直径，因此微球留在方孔阵列上方的反应池中，而废液通过出样通道的出样口由液滴导出管导出；
b)之后，将液滴导出管与真空泵连接，抽干芯片中的残余液体；
c)此时，用移液枪通过进样口注入待测样品溶液，使样品充满方孔阵列上方的出样池，使待测样品溶液与微球充分反应；
d)反应完毕，继续通过进样口注入洗涤缓冲液；
e)洗涤完全之后，将液滴导出管与真空泵连接，抽气5iTlOS，使微球在气流作用下干燥并卡入方孔阵列中，通过控制微球的数量使其在方孔阵列上呈单层分布，最后在芯片下方检测微球表面的反应结果。有益效果:根据本发明，利用芯片进行注入微球，加样，反应，洗涤和检测的连续化操作，以编码微球为生物分子检测的固相载体具有以下优点:
(1)试剂消耗少:由于杂交反应只在反应池内进行，试剂充满反应池只需要
2μ Πθ μ L，避免了外接管路中样品死体积的产生，减少了试剂消耗；
(2)检测多元化:作为固相载体的微球具有多种编码，分别固定不同的探针分子，可以同时检测同一个样品中的多个指标。同时球形载体比表面积大，检测灵敏度高，反应速度快；
(3)检测通量高:一个芯片可以集成多个结构单元，同时进行多个样品的检测分析。(3)准确度高:微球在方孔阵列上方由于网孔的局限作用相互分隔、有序排列，微球之间的荧光互相不产生影响，便于图像处理以及解码，检测准确性高； (4)荧光背景低:反应试剂滞留在方孔阵列上方，不接触方孔阵列下表面，通过芯片下方进行检测时几乎不产生荧光背景。
(3)可扩展性高:由于采用了微流控芯片的形式，可以方便的同样品预处理等微流控芯片集成，促进了分析系统的微型化和自动化；
(3)本发明同时结合了微球载体以及微流控芯片的生物检测优势，对小尺寸的微球操作简单，具有鲜明的优势。
图1为本发明芯片的剖面图。图2为本发明芯片的盖片的俯视图。图3是本发明芯片的基片的俯视图。图4为本发明芯片检测时，单个微球的检测光路图。图5为本发明芯片检测时，微球与方孔阵列俯视图。以上的图中有:1、盖片，11、进样通道，12、反应池，2、基片，21、出样通道，22、出样池，3、方孔阵列，4、液滴导出管。
具体实施例方式 下面结合附图，对本发明作详细说明，本发明生物芯片由三个部分构成，如图1，包括最上层的盖片1、中间层的方孔阵列3、以及下层的基片2 ;盖片I和基片2结构如图2、图3所示，盖片I内设有多个并列的进样通道11以及反应池12，基片2内设有多个并列的出样通道21以及出样池22，基片在样通道21的出样口连接有液滴导出管4 ;一个进样通道11、反应池12、方孔阵列、出样池22、出样通道21以及液滴导出管4构成一个结构单元，该生物芯片由多个结构单元组成。具有不同编码的微球，其粒径大小在45 μ m 300 μ m，微球的制备材料为二氧化硅、聚苯乙烯和聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)水凝胶等。方孔阵列的材料可以是聚合物膜(如PE、PP、PVC、PET、PC)、硅片、铜网等；方孔阵列的孔径可以在40 μ πΓ290 μ m之间；反应池的直径在1.5mnT2.5mm之间，反应池的高度在300 μ πΓ 200 μ m之间，进样口直径在200 μ m 1000 μ m之间，长度在5mm 20mm之间。芯片的基质材料可以是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)及聚碳酸酯(PC)等。实施例一:以PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)作为芯片材料，在光子晶体编码玻璃微球上固定探针进行生物检测，微球直径为50 μ m,方孔阵列为激光微加工的聚碳酸酯膜，孔径为 40 μ m。a、盖片的制备:采用激光微加工方法。通过AutoCAD设计通道及反应池图形，将CAD图形转换成激光微加工系统可识别指令；采用激光微加工系统在基片(或盖片)上加工所需的结构，其中，进样通道直径为0.8mm，长5mm，反应池直径为2mm，高度为1.2mm ；
b、基片的制备:与盖片制备过程相同，在出样通道的出样口插入外径为0.8_，长度为7mm的PE管；
C、盖片和基片的封合:在基片上涂一层较薄的PDMS(留出反应池部分)，之后将其放入75°C烘箱预固化5min，在半固化的PDMS上放置方孔阵列，并将两片芯片基片对齐粘合，用夹子固定两片基片并放入75°C烘箱固化Ih ；
d、微球上固定探针:洗净的微球经亲水处理和硅烷化，然后将不同的探针分子固定到不同编码的光子晶体微球上；
e、微流控芯片的连接:液滴导出管4接真空泵；
f、进样:通过移液枪将编码微球连同其运载缓冲液注入进样通道11的进样口，然后进入出样池12，最后抽干运载缓冲液，编码微球留在反应池12中；
g、反应:通过移液枪将待检测溶液注入进样通道11的进样口，最后进入反应池12中与编码微球表面的探针分子进行反应；
h、洗涤:反应完毕后，通过移液枪从进样通道11的进样口注入洗涤缓冲液到反应池12对微球进行充分洗涤；
1、检测:抽干反应池12中的洗涤缓冲液，抽气5iTlOS，使微球在气流作用下干燥并卡入方孔阵列中，最后在芯片下方检测微球表面的反应结果。实施例二:以PDMS和玻璃作为芯片材料，在量子点编码聚苯乙烯微球上固定探针进行生物检测，微球直径为210μπι，方孔阵列为铜网，孔径为200μπι。a、基片的制备:选择PDMS的基质和固化剂的比例为10:1 (质量比)，混合均勾后，经真空抽气以除去气泡后，浇注在排布钢针的容器内，进行加热固化60min，其中，钢针长度为2cm，直径为0.8_。固化好后将PDMS从容器上揭下，在钢针末端打孔(孔径2.5_)即制成基片；
b、盖片的制备:与基片制备方法相同，制备完成后用酒精润湿盖片，拔除钢针；
C、盖片和基片的封合:固化好的基片和盖片以及两片洗净的玻璃经氧等离子体处理后，在基片上放置方孔阵列，将基片和盖片夹在两片玻璃之间贴合，然后直接通过热键合方法进行基片和盖片的封装；
d、微球上固定探针:将不同的探针分子固定到不同编码的聚苯乙烯微球表面；
e、微流控芯片的连接:液滴导出管4接真空泵；
f、进样:通过移液枪将编码微球连同其运载缓冲液注入进样通道11的进样口，然后进入反应池12，最后抽干运载缓冲液，编码微球留在反应池12中；
g、反应:通过移液枪将待检测溶液注入进样通道11的进样口，最后进入反应池12中与编码微球表面的探针分子进行反应；
h、洗涤:反应完毕后，通过移液枪从进样通道11的进样口注入洗涤缓冲液到反应池12对微球进行充分洗涤；
1、检测:抽干反应池12中的洗涤缓冲液，抽气5iTlOS，使微球在气流作用下干燥并卡入方孔阵列中，最后在芯片下方检测微球表面的反应结果。
权利要求
1.一种用于微球多元生物检测的微流控芯片，其特征在于:该微流控芯片包括盖片(I)、基片(2)以及方孔阵列(3)，所述的盖片(I)上设置有多个并列的进样通道(11)和与所述进样通道(11)连通的反应池(12)，该反应池(12)的出口位于所述的盖片(I)的内表面上；所述的基片(2)上设置有多个并列的出样通道(21)和与所述出样通道(21)连通的出样池(22)，该出样池(22)的入口位于所述基片(2)的内表面上；所述的方孔阵列(3)位于所述盖片(I)的反应池(12 )和基片(2 )的出样池(22 )之间；在所述基片(2 )出样通道(22 )的出样口还连接有一液滴导出管(4);在所述反应池(12)内设置有编码的微球，在该微球的表面固定有生物分子探针；所述方孔阵列的孔径小于所述微球的直径。
2.根据权利要求1所述的一种用于微球多元生物检测的微流控芯片，其特征在于:微球的大小在45μπι 300μπι之间；反应池(12)和出样池(22)的直径均在1.5mnT2.5mm之间，反应池(12)和出样池(22)的高度均在300μπΓ 200μπι之间，进样通道(11)的进样口直径在200 μ m 1000 μ m之间，长度在5mm 20mm之间；方孔阵列(3)的孔径在40 μ πΓ290 μ m 之间。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于微球多元生物检测的微流控芯片，其特征在于:所述生物分子探针是核酸、蛋白质或多肽。
4.根据权利要求1或2所述的一种用于微球多元生物检测的微流控芯片，其特征在于:所述微球的材料是二氧化硅或聚苯乙烯和聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶；所述盖片的材料是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或聚碳酸酯；所述基片的材料是玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或聚碳酸酯；方孔阵列的材料是聚合物膜、硅片或铜网。
5.根据权利要求1或2所述的一种用于微球多元生物检测的微流控芯片，其特征在于:微球的编码是条形码编码、荧光编码、量子点编码、光子晶体编码、拉曼标签编码、红外光谱编码、形状编码、射频编码 、大小编码或位置编码。
全文摘要
本发明公开了一种用于微球多元生物检测的微流控芯片，该微流控芯片包括盖片、基片以及方孔阵列，盖片上设置有多个并列的进样通道和与进样通道连通的反应池，该反应池的出口位于盖片的内表面上；基片上设置有多个并列的出样通道和与出样通道连通的出样池，该出样池的入口位于所述基片的内表面上；方孔阵列位于盖片的反应池和基片的出样池之间；在基片出样通道的出样口还连接有一液滴导出管；在反应池内设置有编码的微球，在该微球的表面固定有生物分子探针；方孔阵列的孔径小于微球的直径。在芯片的使用过程中，微球与样品的进样、反应、洗涤以及检测都在芯片上进行，具有集成度高，使用方便，样品消耗量小，检测灵敏度高等优点。
文档编号B01L3/00GK103191792SQ20131013548
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者顾忠泽, 赵祥伟, 王晓霞 申请人:东南大学