专利名称：：多色光学编码硅壳纳米棒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种纳米
技术领域：
光致发光材料及其制备方法，具体涉及一种可用于多元生物分析与荧光成像中信号编码的光致发光材料及其制备方法。技术背景生命科学技术的迅速发展给分析技术提出了新的挑战。面对分析对象的日益增多，需要有与之相适应的分析手段相配合，特别需要有能够对同一样品中多种组分进行同时测定的多元分析技术。在多元分析中，往往需要使用多种荧光标记物，最好是仅用一个波长的光就能有效激发出各个标记物的荧光，这要求被选用的标记物具有相近的最大激发波长和明显不同的最大发射波长，然而这样的染料并不多。此外，多数染料分子的荧光并不强，而且易于受到不可逆的光漂白作用。最近发展起来的光学编码技术为多元分析提供了更为广泛的荧光标记物。该技术通常在聚合物微球中包裹两种或多种荧光染料或量子点，通过控制各种染料的比例来实现编码。目前常用于光学编码的材料主要有聚合物荧光编码微球和量子点编码微球。聚合物材料易于发生溶胀而引起染料泄露，亲水性不好，在水溶液中易于团聚；量子点存在着制备条件苛刻，毒性大等问题。
发明内容本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种染料泄露少、生物相容性好、亲水性好、荧光强、性质稳定的多色光学编码硅壳纳米棒，还提供一种工艺简单、染料包裹效率高的多色光学编码硅壳纳米棒的制备方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种多色光学编码硅壳纳米棒，其特征在于所述多色光学编码硅壳纳米棒为核壳型结构，其外壳材料为二氧化硅，内核材料为荧光编码的多聚赖氨酸，荧光编码的多聚赖氨酸含有荧光染料A和荧光染料B,荧光染料A和荧光染料B是荧光共振能量转移供体-受体对;所述荧光编码的多聚赖氨酸是荧光染料A和荧光染料B通过其各自所带有的活性基团与多聚赖氨酸的胺基共价连接而成。上述荧光共振能量转移供体-受体对可以为下表中所列的各荧光染料配对组合中的任意一种表一<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述荧光染料所带有的活性基团为异硫氰酸酯基或琥珀酰亚胺酯基。本发明还提出一种上述多色光学编码硅壳纳米棒的制备方法，其特征在于将荧光染料A和荧光染料B与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖氨酸，以荧光编码的多聚赖氨酸为内核材料，用反向微乳液法将内核材料包裹在二氧化硅基质中制备成多色光学编码的硅壳纳米棒。上述制备方法具体包括以下步骤(1)荧光编码多聚赖氨酸的制备将荧光染料A和荧光染料B按要求的比例同时或依次与多聚赖氨酸在碳酸盐缓冲液中于室温下反应2~3h，用透析法除去过量的荧光染料，制得荧光编码的多聚赖氨酸；(2)编码多聚赖氨酸的包壳将7.2~7.5体积的环己垸、1.61.8体积的表面活性剂曲拉通X-100和1.6-1.8体积的正己醇混合均匀，往混合液中加入0.4-0.8体积的水作为分散相，搅拌均匀后形成反相微乳液；加入0.2~0.6体积4.0x10'5~8.0x10"4mol/L上述制得的荧光编码多聚赖氨酸的水溶液，搅拌均匀后再加入0.2~0.4体积的正硅酸乙酯和0.1~0.2体积氨水(质量分数25~28%)，反应2024h后加入丙酮或乙醇破乳，离心收集纳米棒，并依次用乙醇、水洗涤收集到的纳米棒，最后得到多色光学编码硅壳纳米棒。上述碳酸盐缓冲液的浓度为0.01~0.1mol/L。当荧光染料的活性基团为异硫氰酸酯基时，碳酸盐缓冲液的pH值可以为9.09.5;当荧光染料的活性基团为琥珀酰亚胺酯基时，碳酸盐缓冲液的pH值可以为8.0~8.5。在荧光染料A和荧光染料B与多聚赖氨酸反应制备荧光编码多聚赖氨酸的过程中，当荧光染料A与荧光染料B所带的活性基团相同时，荧光染料A与荧光染料B可以同时与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖氨酸；当荧光染料A与荧光染料B所带的活性基团不同时，应当将荧光染料A与荧光染料B依次与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖氨酸。上述荧光染料A和荧光染料B的配比应当根据所要制备的光学编码材料的要求进行确定，随着荧光染料A和荧光染料B配比情况的变化，以供体染料的最大激发波长的光激发，所述纳米颗粒可发出不同颜色的荧光，从而达到多色光学编码的效果。本发明针对如何制备硅壳纳米棒以及如何将多色光学编码的思路融合于纳米棒的制备的问题，设计了一种简单易行的制备方案。与现有技术相比，本发明不仅克服了现有光学编码材料易于溶胀引起染料泄露、亲水性不好、毒性大等技术缺陷，也改进了现有制备工艺中常见的工艺过程复杂、制备条件苛刻等不足，提供了一种简便易行、染料包裹效率高、染料泄露少的多色光学編码硅壳纳米棒的制备工艺。通过改变硅壳纳米棒中各种染料的配比，而制得的系列性的多色光学编码硅壳纳米棒，在某一特定波长光的激发下，各个纳米棒能发出不同颜色的荧光，光强度较高，具有较好的生物相容性和亲水性，且性质较为稳定。此外，由于硅壳纳米棒表面有硅网结构的存在，可以利用表面硅垸化修饰方法对本发明的硅壳纳米棒表面进行进一步处理，使其带上氨基、羧基等基团，以便于蛋白质、核酸等生物分子的接枝。因此，本发明的多色光学编码硅壳纳米棒在多基因表达分析、蛋白质多元分析、高通量筛选、多通道生物学测定、医学诊断学和组合化学等方面都有着广阔的应用前景。图1为多色光学编码硅壳纳米棒(实施例中第c种硅壳纳米棒)的透射电子显微镜成像图；图2为实施例中制备的七种多色光学编码硅壳纳米棒的荧光发射光谱图；图3为由活体荧光成像仪所拍摄到的七种多色光学编码硅壳纳米棒的荧光成像图；其中每种硅壳纳米棒所发出的荧光颜色在RGB颜色模式下的色值如下纳米棒a的颜色(R:101，G:192，B:107);纳米棒b的颜色(R:250,G:230,B:87);纳米棒c的颜色(R:254，G:190,B:59);纳米棒d的颜色(R:245,G:166，B:44);纳米棒e的颜色(R:247,G:139，B:27);纳米棒f的颜色(R:255，G:119,B:22);纳米棒g的颜色(R:255，G:119，B:10)。具体实施方式实施例一种多色光学编码硅壳纳米棒，通过以下方法制备得到(1)将分子量为715万的多聚赖氨酸溶解在pH8.3,0.1mol/L的碳酸氢钠溶液中，配成40mg/mL的溶液A;将5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(5-TAMRA,SE)用无水二甲亚砜(DMSO)溶解，配制成9.0x1(T3mol/L的溶液B;取30pl溶液B加入到270pl溶液A中，迅速搅拌均匀，在室温下持续轻微搅拌2h，用0.15mol/L的NaCl溶液透析除去过量的染料，再加入pH9.2,0.1mol/L的碳酸盐缓冲液补足1250nl，得到溶液C;(2)取荧光素异硫氰酸酯(FITC)溶于无水DMSO中，分别配制成7.6xl(^mol/L、3.8xl0-4mol/L、1.9x10-4mol/L、9.5x10-5mol/L、4.8xl(T5mol/L的不同浓度的FITC/DMSO溶液；取45pl溶液A，加入162pl、pH值9.2、0.1mol/L的碳酸盐缓冲液和23pl7.6xl0"4mol/LFITC/DMSO得到溶液a1;另取207pl溶液C，加入23plDMSO得到溶液g1;再取五个管，各加入207nl溶液C，然后在各管中分别加入7.6xl(^mol/L、3.8xl0"4mol/L、1.9xl(T4mol/L、9.5x10-5mol/L、4.8xl(T5mol/L的FITC/DMSO溶液，分别得到溶液bi、Cl、d卜ei、f1;将得到的溶液a广gi在室温下持续轻微搅拌3h，分别用0.15mol/L的NaCl溶液和超纯水透析除去过量的FITC染料，得到溶液a2~g2;(3)在七个具塞广口瓶中各加入环己垸7.5mL、表面活性剂曲拉通X-1001.8mL和正己醇1.8mL，混合均匀，加入400pL水作为分散相，搅拌均匀后形成反相微乳液，将溶液a2g2分别加入上述七个瓶中，搅拌均匀后加入200正硅酸乙酯和200质量分数为25~28%的氨水，反应24h后加入乙醇破乳，离心收集纳米棒，依次用乙醇、水洗涤收集到的纳米棒，由此可制得一套包含七种类型的多色光学编码硅壳纳米棒(ag)。(其中b~f为本发明的多色光学编码硅壳纳米棒)用透射电子显微镜来观察制备得到的多色光学编码硅壳纳米棒的形貌(纳米棒c)，得到如图1所示的一个具有代表性的成像图，由图可见，该纳米颗粒呈棒状、有明显的核壳结构，长度主要分布在100200nm之间，宽度约为70nm，壳厚度约为25nm，颗粒分散性好。用荧光分光光度计在相同的激发波长(460nm)下，对纳米棒ag的发射光谱进行测定，如图2所示，由图可见，仅用一种激发波长就能有效激发出纳米棒ag的荧光，各纳米棒在520nm与580nm的发射峰的比值随着FITC与TAMRA投料比的减小而减小，该比值可以用于编码。用活体荧光成像仪以蓝光同时对纳米棒ag进行激发来观察它们的荧光，如图3所示，由图3可见，仅用一个波长的光就能有效激发出各个纳米棒的荧光，荧光强、各颗粒所激发出的荧光随着FITC与TAMRA投料比的减小而由绿色逐渐过渡到橙红色，这些不同的颜色也可以用来进行光学编码。权利要求1、一种多色光学编码硅壳纳米棒，其特征在于所述多色光学编码硅壳纳米棒为核壳型结构，其外壳材料为二氧化硅，内核材料为荧光编码的多聚赖氨酸，荧光编码的多聚赖氨酸含有荧光染料A和荧光染料B，荧光染料A和荧光染料B是荧光共振能量转移供体-受体对；所述荧光编码的多聚赖氨酸是荧光染料A和荧光染料B通过其各自所带有的活性基团与多聚赖氨酸的胺基共价连接而成。2.根据权利要求1所述的多色光学编码硅壳纳米棒，其特征在于所述荧光共振能量转移供体-受体对为下述各荧光染料配对组合中的任意一种组合l:荧光染料A为荧光素异硫氰酸酯，荧光染料B为四甲基罗丹明异硫氰酸酯；组合2:荧光染料A为羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，荧光染料B为羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；组合3:荧光染料A为羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯，荧光染料B为羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯；组合4:荧光染料A为荧光素异硫氰酸酯，荧光染料B为5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；组合5:荧光染料A为Cy2,NHS，荧光染料B为Cy3,NHS;组合6:荧光染料A为Cy3，NHS，荧光染料B为Cy5，NHS;组合7:荧光染料A为AlexaFluor488dye,SE，荧光染料B为AlexaFluor555dye，SE;组合8:荧光染料A为AlexaFluor555dye,SE，荧光染料B为AlexaFluor647dye,SE;组合9:荧光染料A为BODIPYTR，SE，荧光染料B为BODIPY650/655-X,SE。3.根据权利要求l.所述的多色光学编码硅壳纳米棒，其特征在于所述活性基团为异硫氰酸酯基或琥珀酰亚胺酯基。4.一种如权利要求1~3中任意一项所述的多色光学编码硅壳纳米棒的制备方法，其特征在于将荧光染料A和荧光染料B与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖氨酸，以荧光编码的多聚赖氨酸为内核材料用反向微乳液法将其包裹在二氧化硅基质中制备成多色光学编码硅壳纳米棒。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤(1)荧光编码多聚赖氨酸的制备将荧光染料A和荧光染料B按要求的比例同时或依次与多聚赖氨酸在碳酸盐缓冲液中于室温下反应2~3h，用透析法除去过量的荧光染料，制得荧光编码的多聚赖氨酸；(2)编码多聚赖氨酸的包壳将7.2~7.5体积的环己垸、1.61.8体积的表面活性剂曲拉通X-100和1.61.8体积的正己醇混合均匀，往混合液中加入0.4~0.8体积的水作为分散相，搅拌均匀后形成反相微乳液；加入0.2-0.6体积4.0xl(rs8.0xl0"4mol/L的荧光编码多聚赖氨酸的水溶液，搅拌均匀后再加入0.2~0.4体积的正硅酸乙酯和0.1~0.2体积的氨水，反应20~24h后加入丙酮或乙醇破乳，离心收集纳米棒并洗涤，最后得到多色光学编码硅壳纳米棒。6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.01~0.1mol/L。7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于当荧光染料的活性基团为异硫氰酸酯基时，碳酸盐缓冲液的pH值为9.09.5;当荧光染料的活性基团为琥珀酰亚胺酯基时，碳酸盐缓冲液的pH值为8.0~8.5。8、根据权利要求4~7中任意一项所述的制备方法，其特征在于当荧光染料A与荧光染料B所带的活性基团不同时，将荧光染料A与荧光染料B依次与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖氨酸。全文摘要本发明公开了一种多色光学编码硅壳纳米棒，该多色光学编码硅壳纳米棒为核壳型结构，其外壳材料为二氧化硅，内核材料为荧光编码的多聚赖氨酸，荧光编码的多聚赖氨酸含有荧光染料A和荧光染料B，荧光染料A和荧光染料B是荧光共振能量转移供体-受体对。本发明还公开了一种多色光学编码硅壳纳米棒的制备方法，它是将荧光染料A和荧光染料B与多聚赖氨酸反应制备荧光编码的多聚赖氨酸，以荧光编码的多聚赖氨酸为内核材料采用反向微乳液法将其包裹在二氧化硅基质中制备成多色光学编码硅壳纳米棒。本发明的多色光学编码硅壳纳米棒具有荧光强、生物相容性好、亲水性好、染料泄露少、性质稳定等优点。文档编号C09K11/07GK101333436SQ200810032009公开日2008年12月31日申请日期2008年8月6日优先权日2008年8月6日发明者何晓晓,王柯敏,秦迪岚,谭蔚泓申请人:湖南大学