本发明属于生物化学技术领域。本发明涉及生物化学、化学合成、蛋白分离纯化等技术。
背景技术：
抗体作为药物用于疾病治疗已有很长历史。随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术用于抗体的改造，以被广泛认为是本世纪最具有发展力药物。
目前，约70-80％的抗体纯化使用Protein A、Protein G亲和层析。然而Protein A、Protein G、凝胶介质都具有共同的缺陷。Protein A、Protein G是生物大分子，对人体具有过敏反应，纯化抗体后，须除去残留；Protein A、Protein G、必须通过发酵法进行生产，其生产成本高，纯化难度大；会发生特异性的吸附，在洗脱的过程中，由于其结合能力过高，会出现将IgG的Fc片段拉扯出来的现象，从而破坏了蛋白的空间构象，导致抗体蛋白失去活性；Protein A、Protein G在分离纯化抗体过程中，使用20-30个循环后会失去活性，从而导致失去纯化作用，增加了纯化成本。
如何增加抗体药物的安全性，如何降低抗体药物的纯化成本，成为抗体纯化技术不得不面临的主要问题。针对以上原因，本发明提出以一种新型的小分子配基，替代大分子蛋白为配基产生的不利因素。
本发明采用小分子配基的氨基酸序列为：(RTY)4K2KG，可以模拟蛋白A的空间结构，制备一种新的亲和层析介质，对各种抗体都具有很强的亲和吸附性，只需要采用不同条件，就可以同时吸附不同的免疫蛋白。(RTY)4K2KG配基的凝胶介质可以非常好的解决Protein A、Protein G、凝胶介质的缺陷；(RTY)4K2KG是生物小分子，不会对人体产生过敏反应，没有毒性，抗体纯化后，去除残留简单。(2)(RTY)4K2KG采用多肽合成的方法生产，生产纯化简单，可放大生产。(3)(RTY)4K2KG为配基的亲和凝胶洗脱条件非常温和，不会出现洗脱时对抗体蛋白的构象产生破坏的现象。(4)(RTY)4K2KG分子量小，性能稳定，能够耐受碱性条件，从而增加使用周期，节省成本。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新型的亲和层析凝胶的制备方法，生产工艺和使用。本发明的新型亲和凝胶是以一种小分子的多肽(RTY)4K2KG，替代大分子的蛋白为配基，交联到活化后的琼脂糖凝胶介质上。
多肽(RTY)4K2KG，是通过多肽的化学合成：固相合成法合成，在通过HPLC纯化得到纯品。由于多肽作为配位体的分子量比目标蛋白的分子量小1～2个数量级，多肽配位体与目标蛋白键合不易接近，使用聚乙二醇占位剂生成PEG-HMBA，然后再和多肽结合，生成PEG-HMBA-(RTY)4K2KG，可以增加键合容量。
活化介质使用交联后的6B琼脂糖凝胶，采用CDI活化，偶联效率高，操作简便，偶联容易控制，而且产生的亲和吸附剂无离子交换剂作用，避免如溴化 氢活化后的树脂带有较强电荷而导致非特异性吸附等缺点。并且易于放大生产。
将CDI活化后的交联后的琼脂糖凝胶和PEG-HMBA-(RTY)4K2KG反应，即可得到配基为PEG-HMBA-(RTY)4K2KG的琼脂糖亲和凝胶介质，然后再用三氟乙酸切断PEG-HMBA占位剂，得到配基为(RTY)4K2KG亲和层析凝胶。
具体实施方法
实施例1：(RTY)4K2KG配基的制备：
1)称取1克的Fmoc-Gly-wang resin，用10毫升二甲基甲酰胺溶胀40分钟，然后再用二甲基甲酰胺洗涤三次。
2)在Fmoc-Gly-wang resin中加入10毫升含20％的哌啶二甲基甲酰胺溶液作用20分钟，脱掉FMoc保护基团。再加入1倍量的Fmoc-Lys(FMoc)-OH，和1倍量的HOBT，DIC，以及10毫升的二甲基甲酰胺，反应45分钟。反应后用茚三酮检验连接效率。
3)分别用Fmoc-tyr(otbu)-OH，Fmoc-thr(tbu)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH替代第二步骤中的Fmoc-Lys(FMoc)-OH，进行反应。
4)反应后的树脂用甲醇清洗，冻干，切割。通过HPLC纯化，得到纯度大于98％的产品，即为(RTY)4K2KG
实施例2：PEG-HMBA-(RTY)4K2KG的制备：
1)以安化聚乙二醇和HMBA反应生成占位剂，
2)PEG-HMBA于多肽反应生成PEG-HMBA-(RTY)4K2KG
实施例3：琼脂糖凝胶介质的活化
1)：取交联后的琼脂糖凝胶放入布式漏斗中，用去离子水洗去乙醇溶液。
2)：依次用3倍体积的水∶二甲基亚砜(4∶1)2次；水∶二甲基亚砜(3∶2)2次；水∶二甲基亚砜(2∶3)2次；水∶二甲基亚砜(1∶4)2次；水∶二甲基亚砜(0∶5)2次，混合溶液浸洗凝胶，再用二氧六环溶液清洗，置换出凝胶中的水。
3)：称取脱水后的5.0g的凝胶，悬浮于10ml的二氧六环溶液中，在室温下，加入含有CDI(羰基二咪唑)的二氧六环溶液10ml，然后再在室温下震荡30min。
4)：反应结束后立即用水∶二氧六环(1∶4)；水∶二氧六环(2∶3)；水∶二氧六环(3∶2)；二氧六环(4∶1)，大量的清洗。得到CDI活化琼脂糖凝胶介质。
根据上述反应做放大生产：
准确称量用二氧六环水溶液脱水后的琼脂糖凝胶5千克，放入反应釜中，悬浮于10L的二氧六环溶液，于30min匀速加入含有CDI的二氧六环溶液10L，搅拌均匀，在25℃下反应一小时，再用二氧六环水溶液和大量的水清洗。将得到的CDI活化的琼脂糖凝胶。
将放大生产后的CDI活化凝胶与上述的小实验所得的CDI活化凝胶取同体积，在含有0.015M的NaCl的pH10.0、0.2M的NaHCO3缓冲溶液中偶联BSA，在4℃反应24h。测定偶联的BSA蛋白量为：小实验13.26mg/ml，放大生产12.87mg/ml。说明本实验方案易于放大，且放大生产后的CDI活化凝胶偶联效率没有明显变化。
实施例4：CDI活化琼脂糖凝胶与PEG-HMBA-(RTY)4K2KG的键合
将活化CDI琼脂糖凝胶10g，悬浮于20ml的0.01M的NaHCO3缓冲溶液中，加入PEG-HMBA-(RTY)4K2KG，在室温下反应48h，反应结束后用大量的水清洗抽干，得到亲和凝胶。
在凝胶中加入1％的三氟乙酸溶液处理，切断PEG-HMBA占位剂，即可得到(RTY)4K2KG亲和层析凝胶。
纯化试验结果分析，小分子配基的(RTY)4K2KG亲和层析凝胶与Protein A、Protein G亲和层析对抗体具有同样纯化效果。