一种高活性可吸附真菌毒素的功能化石墨烯的制备方法及其应用与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种高活性可吸附真菌毒素的功能化石墨烯的制备方法及其应用。

背景技术：

真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的有毒次级代谢产物，对人体和动物的健康都有极大的危害，具有致畸、致癌、致细胞突变的作用。目前已知的真菌毒素有300多种，主要包括曲霉毒素类、镰刀菌毒素类、青霉菌毒素类等。常见的对人体健康危害严重的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素、呕吐毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、展青霉素、橘青霉素等。真菌毒素除危害人畜健康外，还导致农产品品质下降，阻碍农产品出口，对农户和农业经济造成巨大损失。在我国，受气候因素和农户个体种植方式的影响，粮油作物及其制品受真菌毒素污染现象比较严重。因此，加强农产品中真菌毒素的控制研究十分必要。但这是一个涵盖农产品从田间、贮藏、运输、加工、销售直至餐桌全程控制的“系统工程”。目前的研究技术远无法满足人们的要求，故各国制定了食品和饲料中真菌毒素的限量标准，以保障人类食品安全。

在农业生产中，防治粮食被真菌毒素污染，可包括两个方面内容：即收割前防止真菌对种子感染；收割后对谷物良好保存；或对轻度污染作物进行去毒处理。本发明主要针对已污染粮食去毒方法，现去除和降解粮食中真菌毒素方法有物理方法、化学方法和生物技术。物理方法主要针对已污染真菌毒素的谷物，处理方法有：剔除(剔除外表有损害部分)、水洗、脱壳、热处理、碾磨、辐照、吸附剂吸附和压煮等。化学方法是利用毒素本身的化学结构和化学性质，故可用活性强或能与之发生化学反应物质将其转变成其它物质，从而达到降解或除毒目的。生物去除方法主要是利用某些微生物可分解特定真菌毒素，进而改变毒素分子的化学结构，达到降解去除真菌毒素目的。目前物理法中的选择吸附剂用于霉菌毒素去除方面，所涉及到的吸附剂种类繁多，常用的吸附剂有活性炭、凹凸棒和活性白土等，其吸附原理是主要依靠自身孔结构的优势进行吸附，虽然对真菌毒素有良好的去除效果，但由于含有大量杂质、吸附速率慢、再生效率低，限制了其应用前景。综合起来，各类吸附剂普遍存在的缺陷是：①吸附功能单一，不能同时吸附粮油中存在的多种不同类型的霉菌毒素；②添加量大，占用过大配方空间；③吸附霉菌毒素的同时，与粮油中的维生素、矿物质等营养成分结合，干扰营养物质利用；④可能含有其他污染物，在一定程度上降低粮油品质。因此，寻找和开发吸附速率快、吸附性能好、可以循环使用的吸附剂仍然是吸附研究领域的重要方向之一。为此，选择的吸附剂：①必须具备高吸附能力；②选择性吸附；③广谱吸附；④具有良好的稳定性；⑤使用量要低且有效，无毒性；⑥必须具备实验室及动物试验双重资料方能证明有效。

近年来研究热门的共轭碳纳米材料氧化石墨烯(GO)，它具有独特的二维结构和高比表面积，吸附作用可以依靠本身片层结构在表面进行，在提高吸附性能的同时还有利于脱附和再生；另外，由于氧化石墨烯表面含有大量羟基、羧基等含氧基团，容易与吸附质分子形成氢键进而将其吸附除去，因此氧化石墨烯在吸附领域必将具有重要的研究价值和应用前景。为提高石墨烯的应用价值，需要对其表面进行修饰和功能化，以提升石墨烯的分散性，甚至还能赋予石墨烯新的性能。在大多数情况下，当有机分子与石墨烯表面共价连接时，破坏了石墨烯原有的共轭结构，能带打开，可以有效调变其结构和电子性能。有机分子与石墨烯产生共价键的位置可以是石墨烯中的碳碳双键，也可以是氧化石墨烯上的含氧基团(如羟基、羧基、环氧基等)。本发明合成出两亲分子双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共价功能化的石墨烯。以氧化石墨烯为原料，用双十二烷基二甲基溴化铵引入氨基基团，再与羧基的氧化石墨烯分子进行酰氨化反应，得到了良好的溶解分散性的功能化石墨烯材料，并使得功能化石墨烯的吸附性能得到进一步提升。目前为止，氧化石墨烯对重金属离子、染料分子和抗生素都表现出优异的吸附性能，对于这种功能化石墨烯材料用于吸附的研究未见报道，尤其还没有相关文献和专利报道用于吸附真菌毒素的研究。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种高活性可吸附真菌毒素的功能化石墨烯的制备方法。

本发明的第二个目的在于提供一种高活性可吸附真菌毒素的功能化石墨烯的应用。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高活性可吸附真菌毒素的功能化石墨烯的制备方法，包括如下步骤：

1)将氧化石墨烯分散液先进行第一次超声处理，使氧化石墨烯分散液形成均一的分散液；然后进行低速离心处理，离心处理后除去下层聚集体，得上层溶液；将所述上层溶液进行第二次超声处理，使所述上层溶液中氧化石墨烯进行完全剥离，然后再进行高速离心处理，离心处理后除去上层未剥离的氧化石墨烯，得剥离的氧化石墨烯；将剥离的氧化石墨烯分散于去离子水中，继续进行第三次超声处理，使剥离的氧化石墨烯均匀分散在去离子水中，得呈单层或多层结构的氧化石墨烯分散液；

2)将呈单层或多层结构的氧化石墨烯分散液和表面活性剂混合，然后进行第四次超声处理，并在室温下搅拌24-48h，得均一的混合液；

3)将所述混合液于70-95℃下搅拌6-10h，得功能化石墨烯。

进一步，所述低速离心处理的转速为2000-5000r/min；所述高速离心处理的转速为8000-20000r/min。

进一步，所述表面活性剂为具有1-4条烷基链的两亲性表面活性剂。

进一步，所述表面活性剂：氧化石墨烯的质量比为0.2-5:1。

进一步，所述具有1-4条烷基链的两亲性表面活性剂为溴化十六烷基三甲胺(CTAB)、双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)或四溴十二烷基铵(TAB)等。

进一步，两亲性表面活性剂的亲水端修饰于石墨烯表面，两亲性表面活性剂的疏水端朝向水相，当将功能化石墨烯加入到真菌毒素样品中并剧烈摇晃，两亲性表面活性剂在石墨烯片层表面充分分散，从而有效阻止了石墨烯的聚集，这为吸附性能的提高增加了反应位点，进而使功能化石墨烯对真菌毒素的吸附性能得以提高。

进一步，所述氧化石墨烯分散液的浓度为0.1-10mg/mL。

一种高活性可吸附真菌毒素的功能化石墨烯的应用，所述功能化石墨烯在吸附真菌毒素中的应用。

进一步，所述真菌毒素为玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、黄曲霉毒素、伏马毒素或赭曲霉毒素。

一种高活性可吸附真菌毒素的功能化石墨烯的应用，它通过如下方法实现：

1)将所述功能化石墨烯分散于水中，进行超声和搅拌，得浓度为1-5mg/mL的功能化石墨烯分散液；

2)将所述功能化石墨烯分散液和浓度为≥0.1μg/kg的真菌毒素样品进行混合，然后进行吸附反应，吸附反应结束后得中间反应液；调节所述中间反应液的pH值，然后进行取样和检测。

进一步，吸附反应的温度为60-95℃(例如：60℃、80℃、90℃或95℃等)。

进一步，吸附反应的时间为1-10h(例如：1h、2h、3h、4h、6h、7h、8h或10h等)。

进一步，利用HCl和NaOH水溶液调节所述中间反应液的pH值至9.0-12.6(例如：9、10、11、12或12.6等)。

在一些实施方式中，利用双十二烷基二甲基溴化铵改性后的功能化石墨烯促进了胶束溶液的形成，将含有玉米赤霉烯酮的玉米油加入功能化石墨烯溶液中，通过充分的震荡，使功能化石墨烯的聚集体重新分散，与有机相中的玉米赤霉烯酮充分接触，这为吸附性能的提高增加了反应位点，进而使功能化石墨烯对真菌毒素的吸附性能得以提高。但当双十二烷基二甲基溴化铵改性量增加到一定程度时，功能化石墨烯分子的空间接触位阻变大，与玉米赤霉烯酮的吸附位点减少，从而使吸附效果呈现下降趋势。

另外注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。

本发明的有益效果如下：

1、本发明以氧化石墨烯为原料，以两亲性表面活性剂为改性剂，通过离子交换和酰胺化反应对石墨烯进行共价功能化改性，得到了具有良好的溶解分散性的功能化石墨烯，并使得功能化石墨烯的吸附性能得以提高。

2、本发明是在纯水体系中制备功能化石墨烯，无需任何有机溶剂，且制备工艺简单、原料价廉，易于规模化生产；本发明的功能化石墨烯对真菌毒素的吸附效果显著，具有很高的实用价值和应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1：(a)为功能化石墨烯的透射电镜图；(b)为石墨烯水凝胶(SGH)透射电镜图；(c)为凹凸棒(ATTP)的透射电镜图；(d)为活性炭(AC)的透射电镜图。

图2为功能化石墨烯对玉米赤霉烯酮脱附率的条形图。

图3为功能化石墨烯、对照组和空白组对玉米赤霉烯酮吸附率的条形图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中使用的反应物硝酸钠、浓硫酸、高锰酸钾、多氧水、盐酸、乙腈、甲醇等均为市售分析纯，目标降解物真菌毒素为Sigma公司购买的标准品，去离子水是自制的。

采用Hitachi HT-7700型透射电镜(TEM)，电子束加速电压为100kV；采用Waters公司生产的Water E2695高效液相色谱检测玉米赤霉烯酮的吸附量，参考《GB/T 23504-2009食品中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》，并做适当修正。具体色谱条件为：色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm，xbridge)；流动相：水/乙腈＝50/50(V/V)；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL；荧光检测器：激发波长(Ex)＝274nm，发射波长(Em)＝440nm。

在一些实施方式中，研究时间对吸附性能的影响是利用准一级动力学方程和准二级动力学方程两种模型来模拟动力学数据。

准一级动力学模型方程式为：

ln(q_e-q_t)＝lnq_e-k₁t

式中q_e和q_t分别代表在平衡状态和不同时间状态t下功能化石墨烯对真菌毒素的吸附量(mg·g^-1)，k₁指准一级动力学方程吸附速率常数(min^-1)；通过以ln(q_e-q_t)对t作图线性拟合得到直线，由直线的截距和斜率求得q_e和q_t。

准二级动力学模型包括吸附过程中所有阶段：外部扩散、吸附、颗粒内扩散，其方程式为：

$\frac{t}{q_t}=\frac{1}{k_2{q_e}^2}+\frac{t}{q_e}$

式中q_e和q_t分别代表在平衡状态和不同时间状态t下功能化石墨烯对真菌毒素的吸附量(mg·g^-1)，k₂指准二级动力学方程吸附速率常数(g·mg^-1·min^-1)；通过以t/q_t对t作线性拟合得到直线，由直线的斜率和截距求得q_e和k₂。

实施例1

1)将5mg/mL氧化石墨烯分散液先进行第一次超声处理，使氧化石墨烯分散液形成均一的分散液；然后以5000r/min速度进行离心处理，离心处理后除去下层聚集体，得上层溶液；将所述上层溶液进行第二次超声处理，使所述上层溶液中氧化石墨烯进行完全剥离，然后以10000r/min速度进行离心处理，离心处理后除去上层未剥离的氧化石墨烯，得剥离的氧化石墨烯；将剥离的氧化石墨烯分散于去离子水中，继续进行第三次超声处理，使剥离的氧化石墨烯均匀分散在去离子水中，得浓度为1mg/mL的呈单层或多层结构的氧化石墨烯分散液；

2)将20mL所述呈单层或多层结构的氧化石墨烯分散液和7.5mg的双十二烷基二甲基溴化铵混合，然后进行超声处理30min，并在室温下搅拌48h，得均一的混合液；

3)将所述混合液置于集热式磁力搅拌器中于90℃下搅拌反应6h，反应结束后进行自然冷却，得灰黑色产物，将所述灰黑色产物分别用去离子水和乙醇进行洗涤，并于60℃干燥箱干燥12h，干燥后进行研磨，得功能化石墨烯。

实施例2

将实施例1中“7.5mg的双十二烷基二甲基溴化铵”换成“3.8mg的双十二烷基二甲基溴化铵”，其它均与实施例1相同的方式进行。

实施例3

将实施例1中“7.5mg的双十二烷基二甲基溴化铵”换成“20mg的双十二烷基二甲基溴化铵”，其它均与实施例1相同的方式进行。

实施例4

将实施例1中“7.5mg的双十二烷基二甲基溴化铵”换成“50mg的双十二烷基二甲基溴化铵”，其它均与实施例1相同的方式进行。

实施例5

将实施例1中“7.5mg的双十二烷基二甲基溴化铵”换成“100mg的双十二烷基二甲基溴化铵”，其它均与实施例1相同的方式进行。

实施例6功能化石墨烯对玉米赤霉烯酮的吸附性能评价

玉米赤霉烯酮的提取方法是参考《SN/T 1745-2006进出口大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的检验方法》并做适当修正。

玉米赤霉烯酮样品的配制：将4mL的乙酸乙酯通过注射器注入到含25mg的玉米赤霉烯酮标准品瓶中，充分震荡，使其完全溶解，得混合液；将所述混合液和1000mL的玉米油混合，并进行超声和震荡，得浓度为25mg/L玉米赤霉烯酮样品，将所述玉米赤霉烯酮样品放入4℃冰箱中备用。

实验组：将所述功能化石墨烯分散于20mL水中，进行超声处理60min，并搅拌30min，得浓度为2.4mg/mL功能化石墨烯分散液；将所述功能化石墨烯分散液和浓度为25mg/L的玉米赤霉烯酮样品进行混合，然后于95℃进行吸附反应6h，吸附反应结束后得中间反应液；调节所述中间反应液的pH至9-12，反应结束后进行冷却和离心处理，取上层油样，提取样品中的玉米赤霉烯酮，待液相监测分析。

结果显示，功能化石墨烯对玉米赤霉烯酮的吸附率为95.1％，平衡吸附量为23.75mg/g。

对照组1：将实验组中“功能化石墨烯”换成“活性炭(AC)”，其它均与实验组相同的方式进行，活性炭对玉米赤霉烯酮的吸附率为8.0％

对照组2：将实验组中“功能化石墨烯”换成“凹凸棒(ATTP)”，其它均与实验组相同的方式进行，凹凸棒对玉米赤霉烯酮的吸附率为10.1％。

对照组3：将实验组中“功能化石墨烯”换成“石墨烯水凝胶(SGH)”，其它均与实验组相同的方式进行，石墨烯水凝胶对玉米赤霉烯酮的吸附率为37.6％

对照组4：将实验组中“功能化石墨烯”换成“双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)”:，其它均与实验组相同的方式进行，DDAB对玉米赤霉烯酮的吸附率为15.5％。

对照组5：将实验组中“功能化石墨烯”换成实施例1制备的“呈单层或多层结构的氧化石墨烯(GO)分散液”，其它均与实验组相同的方式进行，呈单层或多层结构的氧化石墨烯分散液对玉米赤霉烯酮的吸附率为0％。

空白组：将浓度为25mg/L的玉米赤霉烯酮样品于95℃进行反应6h，吸附反应结束后得中间反应液；调节所述中间反应液的pH至9-12，反应结束后进行冷却和离心处理，取上层油样，提取油样中的玉米赤霉烯酮，待液相监测分析。吸附率为10.18％。

实施例7功能化石墨烯对玉米赤霉烯酮的吸附解吸能力评价

将所述功能化石墨烯分散于20mL水中，进行超声处理60min，并搅拌30min，得浓度为2.4mg/mL功能化石墨烯分散液；将所述功能化石墨烯分散液和浓度为25mg/L的玉米赤霉烯酮样品进行混合，然后于95℃进行吸附反应6h，吸附反应结束后将吸附饱和的功能化石墨烯通过离心的方法分离出来；然后先用超纯水洗涤吸附饱和的功能化石墨烯，再用5mL体积分数为90％的乙腈水溶液和洗涤后的功能化石墨烯进行震荡3min，将洗涤和震荡操作重复4次，然后进行离心分离得上层清液；取上层清液测定玉米赤霉烯酮的浓度，考查不同洗脱次数对玉米赤霉烯酮的解吸效果的影响。

结合图2可知，当洗脱次数N＝1时，玉米赤霉烯酮的脱附率为59.4％；当洗脱次数N＝2时，玉米赤霉烯酮的脱附率为92.9％；当洗脱次数N＝4，玉米赤霉烯酮的脱附率为96.1％；吸附解吸的实验表明本发明的功能化石墨烯对玉米刺霉烯酮不仅具有良好的吸附性能，而且功能化石墨烯具有良好的再生使用能力。

实施例8调节pH值对功能化石墨烯吸附玉米赤霉烯酮的影响

将所述功能化石墨烯分散于20mL水中，进行超声处理60min，并搅拌30min，得浓度为2.4mg/mL的功能化石墨烯分散液；将所述功能化石墨烯分散液和浓度为25mg/L的玉米赤霉烯酮样品进行混合，然后于95℃进行吸附反应6h，吸附反应结束后得中间反应液；调节所述中间反应液的pH至9-12.6(例如pH值为9、10、11、12或12.6)，反应结束后进行冷却和离心处理，取上层油样，提取油样中的玉米赤霉烯酮，待液相监测分析。

经过多次重复试验显示，随着pH值的增大，功能化石墨烯吸附玉米赤霉烯酮的吸附率迅速升高，当pH＝12.6时，吸附率达到最大，吸附率为95％，而随着溶液pH的继续增加，功能化石墨烯吸附玉米赤霉烯酮的吸附率随之减小。

实施例9调节吸附温度对功能化石墨烯吸附玉米赤霉烯酮的影响

将所述功能化石墨烯分散于20mL水中，进行超声处理60min，并搅拌30min，得浓度为2.4mg/mL的功能化石墨烯分散液；将所述功能化石墨烯分散液和浓度为25mg/L的玉米赤霉烯酮样品进行混合，然后于60-95℃(例如为60℃、80℃、90℃或95℃)进行吸附反应6h，吸附反应结束后得中间反应液；调节所述中间反应液的pH至12.6，反应结束后进行冷却和离心处理，取上层油样，提取油样中的玉米赤霉烯酮，待液相监测分析。

经过多次重复试验显示，随着吸附温度的增加，功能化石墨烯对玉米赤霉烯酮的吸附率随之增大。当温度达到90℃时，吸附最大，但在95℃时吸附的趋势变得较为平缓，吸附逐渐达到平衡。这是由于随着溶液温度的升高，加速了玉米赤霉烯酮分子在溶液中的运动和扩散，虽然也加快了玉米赤霉烯酮分子从功能化石墨烯表面脱附到溶液中的速率，但是吸附的竞争反应速率明显高于脱附反应的速率。因此，控制合适的温度条件更有利于吸附反应的进行。

实施例10调节吸附时间对功能化石墨烯吸附玉米赤霉烯酮的影响

将所述功能化石墨烯分散于20mL水中，进行超声处理60min，并搅拌30min，得浓度为2.4mg/mL的功能化石墨烯分散液；将所述功能化石墨烯分散液和浓度为25mg/L的含玉米赤霉烯酮的玉米油样品进行混合，然后于95℃进行吸附反应1-10h(例如为1h、2h、3h、4h、6h、7h、8h或10h)，吸附反应结束后得中间反应液；调节所述中间反应液的pH至12.6，反应结束后进行冷却和离心处理，取上层油样，提取油样中的玉米赤霉烯酮，待液相监测分析。

经过多次重复试验显示，功能化石墨烯对玉米赤霉烯酮的吸附率随着吸附时间的延长而增加，并且在一段时间后，达到吸附平衡；在吸附时间达到 6h，功能化石墨烯对玉米赤霉烯酮的吸附率达到 95％，然后趋于吸附平衡，

实施例11功能化石墨烯吸附玉米赤霉烯酮的动力学

表2为功能化石墨烯吸附玉米赤霉烯酮的动力学拟合结果

表2列出了准一级和准二级两种模型拟合计算得到的功能化石墨烯吸附玉米赤霉烯酮的动力学拟合结果，可以看到，用准一级动力学方程拟合结果不理想，相关系数(R²)为0.770，相关性较差，并且拟合出的平衡状态下吸附量的理论计算值(q_e,cal)与实验值(q_e,exp)之间差距很大；相比而言，准二级动力学模型对实验数据的拟合结果比较理想，相关系数(R²)接近0.99，并且拟合出的平衡状态下吸附量的理论计算值(q_e,cal)与实验值(q_e,exp)之间非常接近，偏差在3％以内，这说明功能化石墨烯对玉米赤霉烯酮的吸附动力学过程比较符合准二级动力学模型。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。