具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，编码它们的DNA序列，含有该DNA序列的表达载体，含有该表达载体的宿主细胞，以及采用该宿主细胞制备人猪嵌合尿酸氧化酶的方法。该人猪嵌合尿酸氧化酶的序列是将SEQ ID NO：1所示序列进行若干位点氨基酸残基替换所得的重组氨基酸残基序列。与现有技术相比，本发明的人猪嵌合尿酸氧化酶有着更高的催化活性，具有制备低免疫原性甚至无免疫原性降尿酸药物或药物组合物的良好前景。
【专利说明】
具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶
技术领域
[0001] 本发明涉及一种具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 痛风和高尿酸血症是目前危害人类健康的常见疾病;据统计，高尿酸血症的发病 率已经达到了人群的10%。痛风是由于血尿酸水平过高而造成尿酸盐结晶在关节中沉积而 导致的一种急性关节炎。目前控制痛风的药物主要是别嘌呤醇和丙磺舒类药物。由于这两 类药物均需要长期服用，加之该类药物都存在明显的肝肾毒性以及过敏反应，尤其是别嘌 呤醇，可以引起严重的剥脱性皮炎，甚至会危及患者的生命。这些因素导致目前对这类疾病 的控制并不理想，进而造成患者痛风石的形成和肾功能的障碍。目前，高尿酸血症已被列为 心血管疾病的独立风险因素。因此，寻找有效的治疗手段势在必行。
[0003] 在动物体内，其尿酸的水平仅为人类的1/10。因此，痛风和高尿酸血症也被认为是 人类独有的疾病。动物体内尿酸水平低的原因是由于其体内存在尿酸酶，能够把尿酸进一 步分解为极易溶解的尿囊素。通过对比发现，人类的基因组中也存在尿酸酶基因，但是在人 类进化的过程中，由于该基因的突变，造成其不能表达有功能的蛋白质，从而成为假基因。 由此可见，尿酸酶是治疗痛风与高尿酸血症的理想药物。
[0004] 具有活性的尿酸酶是四聚体蛋白，由4个相同的亚基组成，每个亚基分子量在34kD 左右、且由301 - 304个氨基酸残基组成。在溶液中，尿酸酶发挥酶活性的最适pH为8.0 (BayolA etaLBiophysChem. 1995 · 54:229 - 235 ·)。在目前所知的所有来源的尿酸酶中，比 活性最高的来源于黄曲霉，为27IU/mg;其次是来源于枯草芽胞杆菌，它的比活性保持在 13IU/mg(HuangS H，Wu T K.Eur J Biochem.2004.271:517 - 523·)。另外，来源于豆类植物 的尿酸酶，其活性只有2 -6IU/mg;来源于哺乳动物的尿酸酶，经过重组表达后，猪的尿酸酶 活性可以达到5 I U / m g，狒狒的尿酸酶酶活性只有1 I U / m g ( M i c h a e 1 Η，S u s a η J. K. 2006. US7056713B1)，而人源尿酸酶无活性。
[0005] 在药物研究中，微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性，使得这 两大来源的尿酸酶成了目前开发应用重组尿酸酶的研究热点。但黄曲霉来源的尿酸酶与推 测出的人源尿酸酶的同源性不足40%(1^6(：(：，111父，6丨1^8 1?八，(：〇〇1^1?6，]\1似1^0 1， CaskeyC T.Science. 1988.239:1288 -1291.)，人体易产生抗黄曲霉来源尿酸酶抗体，黄曲 霉来源尿酸酶的功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。20多年前， 黄曲霉尿酸酶(Uricozyme)在法国和意大利批准。本世纪初，黄曲霉来源尿酸酶基因的酵母 基因工程菌表达的尿酸酶(Rasburicase)在美国和欧盟批准。由于这两种尿酸酶的基因均 来自于黄曲霉，有很强的免疫原性，Ur icozyme和Rasburicase出现严重过敏反应的比例达 5%以上，并且还有近半数的患者出现发热，恶心呕吐等不良反应。
[0006] 目前在美国用于临床的尿酸酶(Pegloticase)是经过PEG化修饰的猪和狒狒的重 组尿酸酶嵌合蛋白，商品名为KRYSTEXXA。虽然该尿酸酶来源于哺乳动物(猪和狒狒），但由 于与人类的差异造成的过敏反应，加之PEG化的影响，其免疫原性仍然较强。每两周一次静 脉注射KRYSTEXXA的患者中92 %产生了抗peglot icase的抗体，42 %的患者产生了抗PEG抗 体;输液反应的发生率达到26%。尽管如此，美国FDA于2010年批准了该药上市。由此可见该 类药物有着巨大的市场需求。
[0007] 发明人曾于2014年2月11日申请了申请号为201410048071.9、申请公布号为 CN103834623A、名称为《具有催化活性的人源尿酸氧化酶》的中国发明专利申请，其中对人 尿酸氧化酶进行具体位点氨基酸残基替换、或者进行外显子位点氨基酸残基替换，并最终 获得了具有催化活性的人源尿酸氧化酶。此后，发明人将研究重点转向获得具有更高催化 活性的人源尿酸氧化酶。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是:针对现有技术存在的问题，提供一种具有催化活 性的人猪嵌合尿酸氧化酶，与发明人之前的成果相比，具备更高的催化活性。
[0009] 本发明解决其技术问题的技术方案如下：
[0010] 一种具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，该酶的序列是将SEQ ID NO: 1所示序列进行若干位点氨基酸残基替换所得的重组氨基酸残基序列;所述若干位点氨 基酸残基替换由1 一 3个外显子替换、以及0至2个定点替换组成；
[0011]所述外显子替换选自：
[0012] 第84至122位氨基酸残基序列替换为SEQ ID N0:2的第84至122位氨基酸残基序 列；
[0013] 第149至211位氨基酸残基序列替换为SEQ ID N0:2的第149至211位氨基酸残基序 列；
[0014] 第212至252位氨基酸残基序列替换为SEQ ID N0:2的第212至252位氨基酸残基序 列；
[0015] 所述定点替换选自：
[0016] 第24位谷氨酸替换为天冬氨酸；
[0017]第83位谷氨酸替换为甘氨酸。
[0018]优选地，所述若干位点氨基酸残基替换由3个外显子替换和1 一 2个定点替换组成。
[0019] 优选地，所述若干位点氨基酸残基替换由3个外显子替换和2个定点替换组成。
[0020] 优选地，所述重组氨基酸残基序列为SEQ ID N0:3至SEQ ID N0:5之一。
[0021] 本发明还提供：
[0022] 上述人猪嵌合尿酸氧化酶用于制备降尿酸药物或药物组合物的用途。
[0023] 含有上述人猪嵌合尿酸氧化酶的药物组合物。
[0024] 编码上述人猪嵌合尿酸氧化酶的基因序列。
[0025]含有上述基因序列的表达载体。
[0026]含有上述表达载体的宿主细胞。
[0027] 制备前文所述人猪嵌合尿酸氧化酶的方法，包括:采用前文所述的宿主细胞表达 所述人猪嵌合尿酸氧化酶，然后经分离、纯化后获得人猪嵌合尿酸氧化酶成品。
[0028] 与现有技术相比，本发明的人猪嵌合尿酸氧化酶有着更高的催化活性，具有制备 低免疫原性甚至无免疫原性降尿酸药物或药物组合物的良好前景。
【附图说明】
[0029]图1为猪尿酸酶中24位氨基酸的结构分析示意图。
[0030]图2为猪尿酸酶中83位氨基酸的结构分析示意图。
[0031]图3为人猪嵌合尿酸氧化酶分离纯化电泳图。泳道1:人猪嵌合尿酸氧化酶的菌液； 泳道2:人猪嵌合尿酸氧化酶菌液在超声破碎后的上清;泳道3:人猪嵌合尿酸氧化酶在盐析 后以缓冲溶液复溶的溶液;泳道4:人猪嵌合尿酸氧化酶在层析前的溶液;泳道5:人猪嵌合 尿酸氧化酶在层析后的溶液。
【具体实施方式】
[0032] 1.本发明的主要技术成果
[0033] 发明人应用生物信息学技术，对14种不同生物来源(人、黑猩猩、猩猩、大猩猩、长 臂猿、狒狒、猕猴、食蟹猴、夜猴、家兔、小鼠、狗、牛、猪）的尿酸氧化酶氨基酸序列进行了比 对，鉴别出错意突变位点主要分布在人尿酸酶基因的3号、5号、6号外显子区域内。哺乳动物 猪尿酸酶氨基酸与人源尿酸酶氨基酸同源性在88%以上，活性区域高度一致。利用外显子 替换技术，在不具有尿酸酶活性的人尿酸酶氨基酸序列中，通过外显子替换技术引入部分 影响酶催化活性的猪源尿酸酶氨基酸序列，最终获得具有尿酸酶活性的人猪嵌合尿酸酶， 且提高了与推导出的无活性人源尿酸酶氨基酸序列的同源性，从而实现降低人体中免疫原 性的目的。
[0034]将人的尿酸酶基因3、5、6号外显子与猪尿酸酶基因的相应外显子替换，得到有活 性的人猪嵌合尿酸酶，该嵌合蛋白氨基酸序列（SEQ ID N0:3)与人源尿酸酶氨基酸序列同 源性可以提高至90%以上。
[0035] 如本领域技术人员所知，在研制重组蛋白质药物中需尽量克服蛋白的物理和化学 不稳定性。尿酸酶蛋白的高疏水性等生物物理性质决定了相对高浓度的蛋白质溶液（> 5mg/ml)处于非生理条件下（如高温或弱酸性pH值)时会加速其交联和聚集（即较差的物理 稳定性和不利于制备成生物制品的特性）。运用生物信息学技术对重组的尿酸酶进行了序 列比对、同源模建，分析关键氨基酸残基对其结构造成的影响，从而再对关键氨基酸残基进 行定点突变，进而改善其活性和稳定性。
[0036] 发明人经进一步研究发现，在本发明前述的重组人猪嵌合尿酸酶氨基酸序列的基 础上，经过2个氨基酸(24位和83位)的定点突变，不仅提高了原蛋白的酶活性，还增强或改 善了嵌合蛋白的理化性质(减少了疏水介导的聚集，提高了与溶剂的相容性，增加了体外热 稳定性，延长了体内代谢半衰期，等等）。该人猪嵌合尿酸氧化酶氨基酸序列为SEQ ID N0: 5,其中3、5、6号外显子来源于猪尿酸酶氨基酸序列（SEQ ID N0:2)，其余外显子来源于人尿 酸酶氨基酸序列（SEQ ID N0:1)，且24位和83位氨基酸定点突变。
[0037]需要说明的是，第1至10位氨基酸残基对应于1号外显子，第11至83位氨基酸残基 对应于2号外显子，第84至122位氨基酸残基对应于3号外显子，第123至148位氨基酸残基对 应于4号外显子，第149至211位氨基酸残基对应于5号外显子，第212至252位氨基酸残基对 应于6号外显子，第253至280位氨基酸残基对应于7号外显子，第281至305位氨基酸残基对 应于8号外显子。
[0038]由图1中分析可知，在猪尿酸酶中的24位氨基酸，天冬氨酸（D)可与相邻亚基的 K291、Y289形成氢键(或通过水分子），谷氨酸(E)则由于与V47形成氢键，远离相邻亚基的 K29UY289,不利于二聚体稳定位于β?折叠中的柔性部位，可能对β?延伸方向存在影响，因 此在此位点，天冬氨酸(D)能提高3 - 5 - 6人猪嵌合尿酸酶的酶活性和稳定性。
[0039]由图2分析可知，在猪尿酸酶中的83位氨基酸，（1)83位氨基酸位于α螺旋2、α螺旋3 两个螺旋之间的回转处，甘氨酸(G)有利于消除由附近氨基酸残基造成的空间位阻，而谷氨 酸(Ε)能增加空间位阻，影响柔韧性。⑵谷氨酸(Ε)为酸性氨基酸，可能与附近的Κ85，Κ47等 存在作用力，影响螺旋定位。（3)活性位点Thr68和Asp69位于α螺旋2的另一侧，而α螺旋2的 空间定位并不牢固，Ε83可能会不利于与两者的空间定位，进而影响酶活性。
[0040]用于编码本发明前述人猪嵌合尿酸氧化酶的多核苷酸序列可用本领域技术人员 熟知的DNA重组、PCR等各种技术来获得，但不局限于本发明较佳实施方案中采用的两轮重 叠延伸PCR法以及Strantagene的quick change中描述的定点突变方法。
[0041]将上述多核苷酸与相应表达载体进行有效连接后，转化或转导入宿主细胞中表 达。上述载体可以通过附加体或整合到宿主染色体的形式在宿主生物中进行复制。在适当 的启动子控制下，人猪嵌合尿酸氧化酶可以在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌或其它细胞 中表达。优选大肠杆菌作为宿主细胞表达本发明的多核苷酸。其他适用的微生物宿主包括 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas) 和葡萄球菌属(Staphylococcus)等。也可以在这些原核宿主中制备表达载体，也可具有众 多公知启动子中的任一种，如乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β内酰胺酶启动子系统 或噬菌体λ或Τ7来源的启动子系统。通常这些启动子会控制表达，且具有核糖体结合位点序 列等，以便起始和完成转录及翻译。
[0042] 同时，酵母或真菌等其它微生物也可用于表达。优选的酵母宿主为毕赤酵母 (Pichia pastoris)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)以及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia angusta)。真菌宿主包括黑 曲霉（Aspergillus niger)、里氏木霉（Trichoderma reesei)及裂裙菌（Schizophyllum commune)，也可选择使用其他真菌。
[0043] 此外，哺乳动物细胞培养也可用于表达生产本发明的人猪嵌合尿酸氧化酶。优选 的细胞包括:CH0细胞系、多种C0S细胞系、NS0细胞、叙利亚地鼠（Syrian Hamster)卵巢细胞 系、Hela细胞或人胎肾细胞系（即HEK293、HEK293EBNA)。
[0044] 可以通过公知的方法将含有目的多核苷酸序列(如人猪嵌合尿酸氧化酶的编码序 列以及表达控制序列）的载体转移到宿主细胞内，所采用的方法取决于细胞宿主的类型。例 如，对原核细胞通常采用氯化钙转染法，而对于其他细胞宿主可以使用磷酸钙处理或电穿 孔法。
[0045] 如前所述的本发明人猪嵌合尿酸氧化酶可以从宿主细胞内部或外部(如培养基） 分离得到，且纯化为高纯度的均一蛋白。此种蛋白分离纯化的方法不限于任何特定方法。事 实上，可用任何本领域已公知的方法，例如柱层析法、过滤法、超滤法、盐析法、等电点沉淀 法、透析法等。对于层析，例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层 析、吸附层析等都可以应用。这些层析可用液相层析如HPLC和FPLC来操作。可采用通用的蛋 白检测方法检测蛋白浓度和纯度，例如HPLC法、SDS-聚丙烯酰胺电泳法、等电点电泳法、 BCA法、Lowry法、Western Blot法等。因此，本发明可提供高纯度重组的尿酸酶嵌合蛋白及 其突变体蛋白。
[0046] 2.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例 子。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;试剂和材料，如无特殊说明， 均可通过商业途径获得。
[0047]实施例1人猪嵌合尿酸氧化酶压-#3!14?5-6117- 8-24突变体DNA的构建及其在大肠杆 菌BL21中重组表达。
[0048] 以蛋白（Seq ID No:3)的DNA序列为原始模板，用重叠延伸PCR法突 变制备含有目标突变的DNA。
[0049] 制备Hi 一 2P3H4P5-6H7-8 - 24片段的过程如下。
[0050] 第一阶段PCR:模板序列为出一2?3贴5-6117- 8蛋白的0嫩序列，引物为表1中引物1和引 物4，PCR反应体系和方法均采用PCR反应试剂盒(TAKARA，大连），按商家的说明书设置。
[0051 ] PCR 条件为：95 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 20s，共 30 个循环，第一个循环 95 °C 变性 5min， 最后一个循环72°C延伸lOmin，最终获得产物-24上片段。
[0052]第二阶段PCR:模板序列同第一阶段PCR，引物为表1中引物2和引物3。
[0053] PCR 条件为：951€3〇8,551€3〇8,72°(：10〇8，共30个循环，第一个循环95°(：变性51^11， 最后一个循环72°C延伸lOmin，最终获得产物Hi-2Ρ3Η4Ρ5-6H7- 8-24下片段。
[0054] 第三阶段PCR:模板为-6H7-8 - 24上片段和-6H7- 8 - 24下片段的 1:1混合溶液，引物为表1中引物1和引物2，按上述PCR条件扩增获得产物HuP^Ps-6H7-8- 24片段，其编码的人猪嵌合尿酸氧化酶序列为SEQ ID No:4。
[0055] 将 H1-2P3H4P5-6H7-8 - 24片段和pET - 22b( + )同时使用NdeI和HindIII进行双酶 切，回收酶切片段，使用T4一DNA连接酶连接两个酶切片段，使用《分子克隆》(卢圣栋编）中 所述的标准方法将连接混合物转入大肠杆菌表达宿主菌BL21。
[0056] 在含有AMP抗性的LB平板上进行转化反应，经过12 - 16h小时的生长，挑取单克隆 转化菌落，在AMP+的LB液体培养基过夜培养，进行菌落PCR初步筛选出阳性克隆，经测序确 定含有出-#3114?5-6117-8-240嫩的阳性重组质粒中的尿酸氧化酶序列与理论完全一致。
[0057]使用大肠杆菌 BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)或 BL21 Star(DE3)plysS、表达人猪嵌 合尿酸氧化酶蛋白。这些菌株仅是许多适用于表达嵌合蛋白中的一些，它们可以分别通过 商业渠道自Novagen，Invitrogen及Stratagen获得。利用转化体在含有AMP的LB平板上的生 长能力可将其鉴别出来。
[0058]将上述经过测序正确的BL21表达重组菌，按照1 %的甘油管接种量接入LB培养基 装液量为30ml的250ml的三角瓶中，且培养基中含有100μg/ml的AMP。于37°C，220rpm摇床中 培养至〇D6Q()约为1.7时，加入终浓度为0.2μΜ的IPTG进行尿酸酶的诱导表达，诱导6h后收集 菌体，离心得到湿菌体，并以SDS-PAGE监测。
[0059] 实施例2人猪嵌合尿酸氧化酶HHP3H4P5-6H7-8 - 24 - 83突变体DNA的构建及其在大 肠杆菌中重组表达。
[0060]以Η^ΡΛΡδ-6H7-8 -24蛋白DNA序列为原始模板，用重叠延伸PCR法突变制备含有 目标突变的DNA。
[0061 ] 制备压一必!14?5-6117-8 - 24 - 83的具体过程如下。
[0062] 第一阶段PCR:模板序列为实施例1所得出一必!^5-6117- 8 - 24片段，引物为表1中引 物1和引物6，PCR反应体系和方法均采用PCR反应试剂盒(TAKARA，大连），按商家的说明书设 置。
[0063] PCR 条件为：95 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 33s，共 30 个循环，第一个循环 95 °C 变性 5min， 最后一个循环72°C延伸lOmin，最终获得产物出-必!14?5-6117-「24 -83上片段。
[0064] 第二阶段PCR:模板序列同第一阶段PCR，引物为表1中引物2和引物5。
[0065] PCR 条件为：95 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 90s，共 30 个循环，第一个循环 95 °C 变性 5min， 最后一个循环72°C延伸lOmin，最终获得产物-24 -83下片段。
[0066] 第二阶段 PCR:模板为 Hi-2P3H4P5-6H7-8 - 24 - 83 上片段和 Hi-2P3H4P5-6H7-8 - 24 - 83 下片段的1:1混合溶液，引物为表1中引物1和引物2,按上述PCR条件扩增得到产物Hh2P3H4P5-6H7-8-24 - 83突变体DNA，其编码的人猪嵌合尿酸氧化酶序列为SEQ ID No:5。
[0067] 将含所得DNA序列用Nde I和BamH I进行双酶切，连接、转化、筛选、表达方法同实 施例1。
[0068]各引物序列见表1。
[0069]表1各实施例所用引物序列
[0070]
[0071] 实施例3人猪嵌合尿酸氧化酶的纯化。
[0072]将实施例1、2培养的发酵液以4000rpm、20min离心，收集菌体，菌体再用pH8.6的 0.05M Tri s-He 1缓冲液按1 g菌体10ml体积的比例重悬，离心，洗涤两遍。取菌体，每1 g菌体 补入10ml缓冲液(pH8.6 Tris-Hcl)悬浮菌体，搅拌均匀并冷冻过夜，然后37°C水浴中迅速 解冻，如此反复冻融4次。将上述菌体悬液融化后，超声(功率60%、40min、超声5s、间隙5s)， 注意超声破壁时温度保持在10度以下;待破菌完全后，8000r/min，4°C离心30min，分别取上 清、沉淀进行SDS-PAGE电泳分析和酶活性测定。
[0073] 取破壁菌体悬液离心后的沉淀，每克沉淀以150ml缓冲液(0.1M Na2C03 - NaHC03、 pH 10.3)溶解，在4 °C中搅拌使沉淀溶解，然后以8000r/min，离心30min，取上清和沉淀分别 进行SDS-PAGE电泳分析和酶活性测定。
[0074] 将溶解后蛋白溶液在4°C，以8000r/min离心30min，弃沉淀，取上清即为尿酸酶粗 酶溶液。先将10 %的硫酸铵加入到尿酸酶粗酶溶液，4°C放置过夜。4°C，12000r/min离心 15min，收集沉淀，缓冲液(0.1M Na2C03 - NaHC03、pH 10.3)溶解，即得蛋白样品溶液。SDS - PAGE电泳分析，以分级沉淀的方式确认最优盐析浓度。
[0075] 0 36?11&仰86?上阴离子填料装柱（1.2\20〇11)，用？!110.3 0.謂碳酸盐缓冲液平 衡过夜，流速为1. 〇ml/min。将所得蛋白溶液上样，流速为0.5ml/min;上样完毕后用pHIO. 3 0.1M碳酸盐缓冲液冲洗柱子至基线，然后用pHIO. 3 0.1M碳酸盐缓冲液+0.5M NaCl梯度洗 脱，最后用pHIO. 3 0.1M碳酸盐缓冲液+2.0M NaCl洗脱，洗脱流速为0.5ml/min。整个洗脱过 程用部分收集器收集流出液，每试管3ml，紫外280nm检测蛋白流出情况，并用SDS -PAGE电 泳分析纯化效果，最后合并目的蛋白峰(所得即为高纯度人猪嵌合尿酸氧化酶），BCA法测定 蛋白含量，此时进行SDS-PAGE和HPLC检测纯度，均可达到95 %以上。
[0076]上述过程中，针对实施例2样品纯化时进行的SDS-PAGE电泳分析结果如图3所示。
[0077]实施例4各尿酸氧化酶的活性检测。
[0078]尿酸氧化酶的活性测定:尿酸氧化酶催化尿酸降解，尿酸在293nm处具有特征吸收 峰，但是尿酸降解后的产物在此波长无吸收峰，因此可以根据293nm处吸光值的减少量来确 定尿酸被尿酸氧化酶降解的量，然后使用尿酸的摩尔消光系数算出尿酸浓度，根据尿酸浓 度的变化可以计算出尿酸氧化酶的活性。将紫外分光光度计波长调至293nm处，预热30min， 使用硼酸一硼酸钠缓冲液作为空白调零，取3ml于37°C预热30min的60μΜ的尿酸溶液加入石 英比色皿中，补加0.5ml的上述粗酶液快速混勾，开始计时，每lmin记一次吸光值读数，测量 5min内293nm吸光度的变化值。
[0079]在37°C、pH8.5时，每分钟转化Ιμπιο?尿酸为尿囊素的酶量定义为一个国际单位 (IU)。按照如下公式计算尿酸酶活性。
[0080]
[0081] 上式中：U =尿酸酶活力单位;Αο为反应初始时的0D293吸光值，Α为反应5min后0D293的吸光值;Vt =反应液总体积(ml) ;df =稀释倍数;11.254为尿酸在293nm波长下的微摩尔消 光系数;Ve =酶液体积(ml)。
[0082] 各尿酸酶蛋白按实施例3方法分离纯化后比活计算结果如下表所示，
[0083]
'[0084] 注1:PU0X(猪尿酸酶）的酶活数据获得过程为:采用与实施例1相同的方法获得猪 尿酸氧化酶基因的DNA，并进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、发酵后，按实施例3方法纯 化，检测纯化所得蛋白的酶活数据。
[0085] 注2: SEQ ID N0:3的酶活数据获得过程为:采用与实施例1相同的方法获得SEQ ID NO: 3的DNA，并进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、发酵后，按实施例3方法纯化，检测纯化 所得蛋白的酶活数据。
[0086] 由以上结果可知，SEQ ID NO :3所示人猪嵌合尿酸氧化酶、SEQ ID NO :4所示人猪 嵌合尿酸氧化酶、SEQ ID NO:5所示人猪嵌合尿酸氧化酶都是具有催化活性的尿酸氧化酶， 其中以SEQ ID N0:5所示人猪嵌合尿酸氧化酶的活性最为突出。而且，SEQ ID N0:5所示人 猪嵌合尿酸氧化酶的酶活数据是猪尿酸酶的接近1.4倍，明显高于发明人之前申请的发明 (申请号201410048071.9)中酶活最高的E24A-Ml 121- I115H-H119R-C141V-Q145V - Q151I - K208D - I214A-M219L-S222F - L232S - T233A-C240Y 尿酸酶(该尿酸酶的酶活数 据是猪尿酸酶的约1.1倍），这一优势在进行本研究之前是无法预料的。
[0087] 本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均 落在本发明要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，该酶的序列是将SEQIDNO: 1所 示序列进行若干位点氨基酸残基替换所得的重组氨基酸残基序列;所述若干位点氨基酸残 基替换由1 一3个外显子替换、以及0至2个定点替换组成； 所述外显子替换选自： 第84至122位氨基酸残基序列替换为SEQIDNO: 2的第84至122位氨基酸残基序列； 第149至211位氨基酸残基序列替换为SEQIDN0:2的第149至211位氨基酸残基序列； 第212至252位氨基酸残基序列替换为SEQIDNO: 2的第212至252位氨基酸残基序列； 所述定点替换选自： 第24位谷氨酸替换为天冬氨酸； 第83位谷氨酸替换为甘氨酸。2. 根据权利要求1所述具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，所述若干位点 氨基酸残基替换由3个外显子替换和1 一 2个定点替换组成。3. 根据权利要求1所述具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，所述若干位点 氨基酸残基替换由3个外显子替换和2个定点替换组成。4. 根据权利要求1所述具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，所述重组氨基 酸残基序列为SEQIDNO: 3至SEQIDNO: 5之一。5. 权利要求1至4任一项所述人猪嵌合尿酸氧化酶用于制备降尿酸药物或药物组合物 的用途。6. 含有权利要求1至4任一项所述人猪嵌合尿酸氧化酶的药物组合物。7. 编码权利要求1至4任一项所述人猪嵌合尿酸氧化酶的基因序列。8. 含有权利要求7所述基因序列的表达载体。9. 含有权利要求8所述表达载体的宿主细胞。10. 制备权利要求1至4任一项所述人猪嵌合尿酸氧化酶的方法，其特征是，包括以下步 骤:采用权利要求9所述的宿主细胞表达所述人猪嵌合尿酸氧化酶，然后经分离、纯化后获 得人猪嵌合尿酸氧化酶成品。
【文档编号】A61K38/44GK105838686SQ201610316709
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】陈建华, 谢光蓉, 李苗苗
【申请人】中国药科大学