用于蛋白质捕获的微流控芯片的制作方法

本实用新型涉及一种与神经退行性疾病产生有关的蛋白质例如β-淀粉样蛋白、tau蛋白、a-突触核蛋白等的捕获中采用的装置。

背景技术：

世界人口在不断的老龄化，据世界卫生组织统计，目前全球有3560万痴呆患者，到2030年这一数字将增加一倍，2050年这一数字将增加至三倍以上。痴呆类型包括阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病等神经退行性疾病。普遍认为大量错误折叠的蛋白质，如β-淀粉样蛋白（amyloid beta）、tau蛋白、a-突触核蛋白（α-synuclein）在细胞内聚集是神经退行性疾病产生的物质基础。因此在开发针对这些疾病的治疗药物的过程中，需要有一种简单易用的方法捕获这些蛋白，并实时监控这些物质对于蛋白质聚集的影响。

水凝胶是由交联的聚合物链形成的三维聚合物空间网状结构。它不溶于水但亲水性使其能够容纳大量的水。此外，可以通过调节聚合物浓度和前体的分子量来改变孔径。其内部多孔结构可以将药物分子包裹在聚合物网络内。此外，这种结构也可以作为细胞封装的支架：其纳米级孔径可以允许后续向细胞供应营养物，但同时防止较大物质如抗体或酶的渗透。此外，水凝胶的生物相容性使其能更好地模拟蛋白质折叠的自然环境。

水凝胶通常分为物理凝胶和化学凝胶两种。其中物理凝胶包括热可逆凝胶，其在常温下呈稳定的凝胶态，但加热后可转变为溶液。但是，其中温度的改变可能影响蛋白质反应速度，破坏蛋白质结构。而化学凝胶使用较多的包括含有甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯基团的超支化聚丙三醇（hPG）和聚乙二醇（PEG）。通过将这些大分子单体与光引发剂一同暴露于紫外线下进行快速交联，或利用加热手段引发自由基进行聚合。综上，无论是利用加热或紫外线辐照的方法，均会影响蛋白质反应，从而使得检测结果不准确。此外，现有常规的物理凝胶和化学凝胶捕获方法捕获的不仅有错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维，也会捕获错误折叠程度低的小分子蛋白质和部分小尺寸单体，无法对错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维进行针对性研究。

技术实现要素：

本实用新型所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种在蛋白质捕获过程中采用的微流控芯片，基于该芯片并按照合适的工艺可以实现对错误折叠程度高的蛋白质寡聚物和纤维进行针对性捕获，以及同时可以获得更准确的分析结果。

为解决以上技术问题，本实用新型采取的技术方案如下：

一种用于蛋白质捕获的微流控芯片，包括芯片本体，微流控芯片还包括形成于芯片本体上且在一端部相交汇构成第一聚焦区的第一微通道、第二微通道和第三微通道，形成于芯片本体上且在一端部相交汇构成第二聚焦区的第四微通道、第五微通道和第六微通道，形成于芯片本体上的第七微通道，其中第四微通道的另一端与第一聚焦区连通，第七微通道的一端与第二聚焦区连通。

优选地，在各微通道的进口端设置有过滤器。

优选地，第一微通道、第二微通道和第三微通道分别用于通入超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液以及带有标记的待捕获蛋白肽溶液，第五微通道和第六微通道内用于通入油相物质。

优选地，芯片本体由聚二甲基硅氧烷构成。

优选地，微流控芯片还包括用于将各微通道封闭的表面平整的基底。

优选地，基底为显微镜用载玻片。

本实用新型微流控芯片可通过软刻蚀法制作，具体步骤如下：

i)将设计好的第一微通道、第二微通道、第三微通道、第四微通道、第五微通道以及第六微通道印刷在醋酸膜上，并将醋酸膜放置于涂覆有光刻胶的硅晶片顶部，经过紫外光照射，得到芯片模板；

ii)将聚二甲基硅氧烷预聚物和其交联剂灌注在所述芯片模板上，进行固化，将固化的聚二甲基硅氧烷模具剥离芯片模板，并对各所述微通道的出入口进行压力穿孔，之后运用表面平整的基底对各微通道进行密封；

iii)将表面疏水剂注入各微孔通道并静置，使得微通道表面疏水即得所述微流控芯片。

利用本实用新型进行蛋白质捕获的一种方法如下：

（1）使超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、带有标记的待捕获蛋白肽单体溶液分别注入微流控芯片的第一微通道、第二微通道和第三微通道中，三者在第一聚焦区混合得到混合液，所述混合液经第四微通道流至第二聚焦区并被从第五和第六微通道注入的油相物质包裹，获得微液滴，所述微液滴内，所述超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇发生巯基-烯的点击化学反应形成水凝胶，得到外层为油相内层为含有蛋白肽溶液的微凝胶；

（2）对所述微凝胶进行培养使其中的蛋白肽单体发生折叠聚集，得到外层为油相内层含有不同折叠程度的聚合蛋白的微凝胶；

（3）向经过步骤（2）的体系中加入脱乳化剂以破坏所述油相外层并进行清洗以除去所述微凝胶内小于所述微凝胶孔道的聚合蛋白或未聚合蛋白，即得捕获了蛋白的水凝胶微笼，所述捕获了蛋白的水凝胶微笼可用于后续的检测分析。

根据本实用新型所述蛋白肽单体为人β淀粉样蛋白1-40，人β淀粉样蛋白1-42，tau蛋白或a-突触核蛋白。

根据本实用新型所述油相物质优选为选自氟化液、矿物类油、植物油及脂肪酸中的一种或多种的组合。

根据本实用新型的一个具体且优选方面，所述脱乳化剂为全氟辛醇油，所述清洗采用pH 7-8的磷酸缓冲溶液，在离心旋杯柱中进行清洗。

根据本实用新型，聚乙二醇双胺、超支化聚丙三醇的分子量可根据需要的微笼孔径来设计。优选地，所述聚乙二醇双胺的分子量为1-5 kDa，超支化聚丙三醇的分子量为10-30 kDa。更优选地，所述聚乙二醇双胺的分子量为2-3 kDa，超支化聚丙三醇的分子量为15-25 kDa。

根据本实用新型，所述微凝胶的大小约为30-80微米，优选为40-60为微米，更优选为45-55微米。

由于以上技术方案的实施，本实用新型与现有技术相比具有如下优点：

本实用新型创新提出的微流控芯片，可以为采用巯基-烯点击反应结合微流控技术捕获蛋白质提供必要的装置，其可获得单分散性的水凝胶蛋白质捕获微笼。

附图说明

图1为微流控芯片的结构示意图，其中，1、芯片本体；2、第一微通道；3、第二微通道；4、第三微通道；5、第四微通道；6、第五微通道；7、第六微通道；8、过滤器；A、第一聚焦区；B、第二聚焦区；

图2显示了利用微流控芯片制备外层为油相内层为含有蛋白肽溶液的微凝胶的示意图；

图3为实施例制备的微液滴和微笼的光学显微镜图；

图4为实施例制备的微液滴和微笼经光学显微镜图观察并绘制的粒径分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本实用新型做进一步详细的说明，但本实用新型并不限于以下实施例。实施例中未注明的条件为常规实验条件。

实施例1 微流控芯片的设计和制作

微流控芯片设计为如图2所示，其包括芯片本体1，形成于芯片本体1上且在一端部相交汇构成第一聚焦区A的第一微通道2、第二微通道3和第三微通道4，形成于芯片本体1上且在一端部相交汇构成第二聚焦区B的第四微通道5、第五微通道6和第六微通道7，以及形成于芯片本体1上的第七微通道9，其中第四微通道5的另一端与第一聚焦区A连通，第七微通道9的一端与第二聚焦区B连通。在第一至第六微通道7的进口端分别设置有过滤器8。本例中，过滤器8的过滤精度为1微米。

以软刻蚀法制作微流控芯片，具体步骤如下：

i)将设计好的各微通道印刷在醋酸膜上，并将醋酸膜放置于涂覆有光刻胶的硅晶片顶部，经过紫外光照射，即得芯片模板；

ii)将聚二甲基硅氧烷预聚物和其交联剂灌注在芯片模板上，进行固化；将固化的聚二甲基硅氧烷模具剥离芯片模板，并对各所述微通道的出入口进行压力穿孔，之后运用表面平整的基底（例如显微镜用载玻片）对各微通道进行密封；

iii)将表面疏水剂（如玻璃镀膜剂Aquapel）注入微孔道并静置5分钟，使得通道表面疏水，最后加装过滤器即得微流控芯片。

实施例2 微流控芯片应用于捕获人β淀粉样蛋白1-42蛋白

（1）制备外层为油相内层为含有蛋白肽溶液的微凝胶

将2-亚氨基硫烷盐酸盐、聚乙二醇双胺（2 kDa）以及超支化聚丙三醇（20 kDa）分别溶解在pH 7.4的Napi缓冲溶液中，获得浓度分别为21g/L、300g/L和1000g/L的2-亚氨基硫烷盐酸盐、聚乙二醇双胺以及超支化聚丙三醇的水溶液。

将2-亚氨基硫烷盐酸盐水溶液与聚乙二醇双胺水溶液以体积比0.75:1混合，室温下搅拌30分钟，使二者反应转化成双巯基聚乙二醇，得到双巯基聚乙二醇水溶液。

将超支化聚丙三醇水溶液及双巯基聚乙二醇水溶液分别注入200微升固定针气密注射器中。

用HiLyte Fluor™ 488对人β淀粉样蛋白1-42肽单体侧链的N-末端进行荧光标记，并溶解于1wt%的氨水中做为预备蛋白肽单体溶液。将预备蛋白肽单体溶液以pH 7.4的磷酸缓冲溶液稀释成所需浓度（如5微米），得到HiLyte Fluor™ 488修饰的人β淀粉样蛋白1-42的水溶液（以下简称蛋白肽溶液），注入注射器，并置于冰浴中。

参见图2，取超支化聚丙三醇水溶液、双巯基聚乙二醇水溶液、蛋白肽溶液分别以流速200微升/小时注入微流控芯片的第一微通道、第二微通道和第三微通道，三者在芯片的第一聚焦区混合得到混合液。混合液自第四微通道流入第二聚焦区，并在第二聚焦区被以流速2000微升/小时注入的氟化液HFE-7500包裹形成单分散微液滴(微液滴的光学显微镜图参见图3A，粒径分布图参见图4A，微液滴大小为约48微米，且呈现非常好的单分散性)，微液滴从第七微通道流出收集。微液滴在芯片上的生成过程通过安装在IX71倒置显微镜的单色幻影V7.2相机进行成像。然后利用LabVIEW 8.2计算液滴的生成频率，约为1.2千赫兹。在这过程中， 超支化聚丙三醇和双巯基聚乙二醇在微液滴中发生巯基-烯的点击化学反应，并快速形成水凝胶。

（2）培养

将步骤（1）制备得到的外层为油相内层为含有蛋白肽溶液的微凝胶置于37℃下培养一定时间，使蛋白肽折叠聚集。当培养结束，冰浴冷却60秒淬灭反应。

（3）破坏微凝胶的油相外层并进行清洗

向经过步骤（2）的体系中加入全氟辛醇油，打开微液滴的油相外层，并用pH 7.4的磷酸缓冲溶液于离心旋杯柱（0.45微米孔径）中清洗3次，并保存在pH7.4的磷酸缓冲溶液中，得到内含高程度聚合蛋白的水凝胶微笼，(水凝胶微笼的光学显微镜图参见图3B，对应的粒径分布图参见图4B，微笼大小为约47微米，且呈现非常好的单分散性)。

上述实施例只为说明本实用新型的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本实用新型的内容并据以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围。凡根据本实用新型精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。