识别堆中的液滴的方法和相关联的测序仪与流程

本发明涉及一种用于识别液滴堆中的液滴的改进方法和设备。其对于通过在对生物聚合物的构成单体单元进行分析之前将该构成单体单元捕获在微滴中来对生物聚合物(诸如核酸)进行测序尤其有用。

背景技术：

在我们先前提交的专利申请w02014053854和wo2014167323中，我们已经公开了一种用于通过下述方法对核酸(诸如合成的和天然存在的dna和rna)进行测序的方法：该方法涉及首先从对应的前体分析物产生有序的单核苷酸流；例如，通过逐步焦磷酸解或核酸外切。此后，单核苷酸被捕获在水性微滴中，在那里用猝灭的荧光团标记的寡核苷酸探针系统处理它们，该系统在捕获发生后经受逐步核酸外切，以释放单核苷酸，该单核苷酸带有处于可检测状态的未猝灭荧光团并且其特征性荧光发射使得能够可靠地识别最初捕获的核苷酸。已经在这些和其他专利申请(包括wo201405385和wo2016012789)中描述了适用于该目的的探针和方法的示例。

虽然可以通过产生和操纵例如分散在不混溶的载体介质(诸如硅油)中的液滴流来执行上述方法，但我们最近已经发现：通过在形成液滴时将液滴直接打印到平面基板的表面上，可以有利地并且更有效地执行该方法。我们已经在us2016122802和欧洲专利申请ep15002007.1中描述了这种液滴打印和储存方法的变型。

该方法的一个潜在缺点是，由于在分析大核酸片段时涉及非常大量的液滴，因此基板需要非常大，实际上有时可能需要多个基板。当原始分析物包括生物体基因或染色体特有的数千甚至数百万个核苷酸时尤其如此。为了克服这个缺点，我们已经发明了一种方法，其中打印的液滴不是存储在基板的表面上，而是堆放在设置在基板内的毛细管中，直到准备好进行分析。然后在适当的时间使液滴从管中出现，此时可以如我们之前所教导的那样对它们进行光谱分析。通过这种方式，我们已经能够显著减小我们在开发的对应测序仪的重要部件的大小。此外。我们相信该方法在基于液滴各自的荧光特征在大液滴流中分选液滴方面具有更普遍的实用性。

技术实现要素：

因此，在本发明的第一方面，提供了一种识别液滴流中的各个液滴的内容物的方法，每个液滴都包含荧光团，其特征在于，包括以下步骤：将液滴逐个引入到至少一个开放式(open-ended，两端未封闭的)管中以在其中产生液滴堆；从管中依次释放液滴堆中的每个液滴并在每个液滴出现时沿着管的主轴检测与每个液滴相关联的荧光。

在一个实施例中，所述方法包括基于检测到的荧光表征或分选所述液滴的额外步骤，包括例如在检测荧光信号的同时使用一个或多个分选门(例如机电门)。在另一个实施例中，将液滴引入管的入口端并从对应出口端移除。在另一个实施例中，管竖直对齐，并且液滴被引入顶部处的入口并在底部处的出口端从液滴堆移除。

在一个优选的实施例中，含荧光团的液滴以初始猝灭(未发荧光)状态引入管中，并且所述方法包括在液滴位于液滴堆内的同时激活荧光团的额外步骤。在另一个实施例中，荧光团与探针分子(例如寡核苷酸探针)缔合，该探针分子对用户希望间接识别的分析物分子具有选择性和特征性。关于管的性质、它们可以被如何设置(例如在固体基板中)以及液滴的性质和内容物的进一步细节将在下面具体参考所述方法的一种合适的应用更详细地进行解释；通过表征生物聚合物的构成单体单元对生物聚合物进行测序。

因此，在本发明的第二方面，提供了一种适于表征生物聚合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)逐步将生物聚合物消化成其构成单体的有序流；(2)将单体的流转化为含单体的水性液滴的对应流，每个液滴另外包含探针，该探针能够(a)捕获单体以及(b)此后被消化以释放捕获的单体的未猝灭的荧光团特征；(3)将步骤(2)中产生的液滴流引入到至少一个开放式管的入口端，以在其中产生液滴堆；以及(4)从管的出口端依次释放每个液滴并在每个液滴出现时检测每个液滴中的荧光团。

还将理解，该特定方法可以形成适于对诸如核酸或蛋白质的生物聚合物进行测序的对应测序仪的工作基础。因此，根据本发明的第三方面，提供了一种用于对生物聚合物进行测序的装置，其特征在于，包括：

·消化单元，所述消化单元包括分析物接收位置，在那里所述生物聚合物逐步被消化成其构成单体的对应流；

·分配单元，所述分配单元包括用于将所述单体的流分配作为液滴的对应流的至少一个液滴分配喷嘴；

·基板，通过所述基板设置有开放式管的阵列，每个开放式管在相对面上具有入口和出口，并且所述开放式管的主轴设置成与待分配所述液滴的方向平行；

·用于使所述液滴分配喷嘴相对于所述基板的入口面在垂直于所述管的主轴垂直的至少一个方向上步进(stepping)的机构，从而允许将所述液滴分配到所述管中；

·控制器，所述控制器用于在所述管中产生液滴堆，并且用于根据需要通过所述出口从所述堆中释放所述液滴；

·至少一个电磁辐射源，所述至少一个电磁辐射源适于照射所述基板的出口面中的出口；

·用于使所述出口的照射与所述液滴从该出口的出现同步的机构；以及

·至少一个光电探测器，所述至少一个光电探测器适于检测从所述出口产生的同步荧光辐射信号。

在一个实施例中，生物聚合物是核酸，并且单体单元是核苷酸；例如核苷三磷酸、核苷二磷酸或核苷一磷酸。在另一个实施例中，生物聚合物是蛋白质，并且单体是氨基酸分子。

考虑到在对应的测序仪的消化单元中执行的本发明的第二方面的方法的步骤(1)，在生物聚合物为核酸的一个实施例中，其通过前体核酸分析物的逐步焦磷酸解或核酸外切作用实现。在对应的测序仪中，这将发生在消化单元中的分析物接收位置，在那里例如分析物直接或经由中间元件(诸如适于通过例如吸力或磁吸引力被保持在该位置的功能化珠子)附接到腔室或微流体通道的壁上。

核酸分析物原则上可以是天然或合成来源的任何核酸，包括任何核苷酸链长度的dna或rna片段，直到在基因或染色体中发现的。在一个实施例中，当dna或rna是天然来源时，核酸由带有特征性核碱基胸腺嘧啶(t)、腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)和尿嘧啶(u)中的一个的核苷酸组成。关于可以通过本发明的方法和装置分析的其他核酸、核苷酸和核碱基的范围的进一步信息，读者可以参考上面提到的我们的专利申请中的那些。

在一个实施例中，核酸分析物通过在水性介质中的逐步焦磷酸解或逐步核酸外切消化成单核苷三磷酸或单核苷一磷酸的对应有序流，其中排序对应于分析物的核苷酸序列。该消化适合在包含上面提到的我们的专利申请中的那些中公开的必要试剂和酶的流动介质中实现。优选地，核苷酸是在存在表现出相关焦磷酸解行为的焦磷酸盐和聚合酶的情况下通过分析物的逐步焦磷酸解产生的核苷三磷酸。在一个实施例中，在消化单元的下游提供包括腔室或流体接合点的区域，由此可以引入无机焦磷酸酶以水解任何残留的焦磷酸盐离子。

在被设计为在测序仪的分配单元中执行的方法的步骤(2)中，将核苷酸的流转化为含核苷酸的水性液滴的对应有序流。理论上，流中的每个液滴都可以包含衍生自含核苷酸的流的核苷酸。然而，为了确保每个填充的液滴包含一个且仅一个核苷酸，通常优选相对于含核苷酸的流的流速来调节液滴产生的速率，使得液滴流中的每个填充的液滴被多个空液滴分开。在一个实施例中，流中的每个填充的液滴被从1至20个、优选地2至10个空液滴分开。

除了核苷酸之外，液滴流中的每个液滴适当地包含能够捕获引入其中的核苷酸的探针。在实践中，对于dna和rna，这意味着液滴将包含1、2、3或4种不同的探针类型，每种探针类型选择性用于不同的特征核碱基并且带有对应不同的荧光团类型。优选的探针类型的实例包括在我们的申请wo2014053853、wo2014053854、wo2014167323和wo2016012789中描述的那些，读者可以从中获得关于它们的性质和合成的进一步信息。所有这些探针类型的共同特征是(1)它们适于在存在酶(诸如连接酶和聚合酶)的情况下选择性捕获单核苷酸；(2)在它们未使用的状态下，它们对核酸外切有抵抗作用，但在它们的对应单核苷酸已经被捕获后可以很容易地被核酸外切消化；以及(3)它们包含特征性荧光团，这些荧光团保持猝灭直到因此用过的探针或组分被消化。因此，如果除了探针和核苷酸之外，每个液滴还包含能够表现出连接酶、聚合酶和核酸外切酶行为的酶，则观察者将看到在一段时间的温育之后每个液滴中捕获的特定核苷酸的荧光信号特征的增长。特别优选的是多组分寡核苷酸探针，其包括：(a)用处于猝灭状态的特征性荧光团标记的第一单链寡核苷酸；以及(b)能够在存在靶单核苷三磷酸、连接酶和聚合酶的情况下与第一寡核苷酸上的互补区杂交从而产生基本上双链使用的探针的第二和第三单链寡核苷酸。此后，可以将用过的探针的第一单链组分进行核酸外切消化，以在未猝灭且因此可检测的状态下释放荧光团。在一个优选的实施例中，第二和第三单链寡核苷酸是通过本身可以由核苷酸组成的连接区连接在一起的寡核苷酸区。在该实施例中，探针对靶核苷酸的捕获产生包括第二区和第三区的闭环单链寡核苷酸组分，该组分本身对核酸外切具有高度抗性。此后，在两种情况下并且一旦第一寡核苷酸组分已经被消化以释放其荧光团，则另一寡核苷酸链可以在循环过程中杂交并产生其它用过的探针，这确保荧光信号的快速增长。关于这些探针、合适的荧光团和猝灭剂以及捕获方法的进一步信息可以在wo2016012789中找到。

适当地，在该过程的步骤(2)中以及测序仪的分配单元中产生的液滴是具有小于100微米、优选小于50微米、更优选小于20微米、甚至更优选小于15微米的有限直径的微滴。所有其直径中，最优选的是在2至20微米的范围内。在一个实施例中，在该方法的步骤(2)和分配单元中采用的微滴产生速率在50至3000微滴/秒的范围内，优选100至2000。

可以使用任何合适的方法从含核苷酸的流中产生液滴流，这将在分配单元的设计中反映出来。在一个实施例中，分配单元包括附接到用于在步骤(3)中将液滴分配到管的入口中的一个或多个液滴分配喷嘴的腔室。在该设计的一个实施例中，多个供给线可以邻近喷嘴附接或直接附接到喷嘴；其中一个包括来自步骤(a)的含水核苷酸的流，其它的用于探针和各种酶以及所需的其它化学试剂。然后，在喷嘴头中或喷嘴头附近的混合确保分配的每个液滴包含核苷酸和探针运行所需的所有组分。在另一个实施例中，喷嘴可用于从含核苷酸的流中产生液滴流，之后添加其他组分；例如，通过显微注射、微注射(picoinjection)或通过将每个液滴与随后在基板的表面上打印它们的顶部上的包含其它组分的类似的次级液滴，在通过控制器的作用将它们引入开放式管中之前，聚结在一起。

在该方法的步骤(3)中，将包含核苷酸和各种探针组分的液滴的流引入到至少一个管中以一个在另一个之上产生液滴堆。为了确保液滴的排序保持在堆中，管的内直径应小于液滴直径的两倍。在一个实施例中，为了保持液滴的完整性，将管预先填充与水不混溶的溶剂(诸如硅油)。在另一个实施例中，为了促进液滴在堆放发生时通过管的移动，管的内表面设置有疏水涂层或优选地包括疏水区域和亲水区域的涂层。为了便于在下面的步骤(4)中可靠地检测液滴中的荧光，优选地是，包括液滴和溶剂的水性介质的折射率分别在1.3至1.4和1.3至1.7的范围内。通常，溶剂的折射率的选择将由水性介质的折射率决定，而水性介质又将取决于液滴中包含的探针和其他试剂的准确浓度。在一个实施例中，管可以包括一根或一束空芯光纤。

适当地，通过向出口施加负压来使液滴被吸入管中。这可以通过将吸力施加到连接到管的出口区域的区域或腔室来最方便地实现。在一个实施例中，一旦已经产生了给定管的液滴堆，就可以去除负压，直到发生步骤(4)这样的时候为止。这使得液滴能够在步骤(3)和(4)之间在堆中经历一段时间的温育，在此期间，通过与施加探针相关联的各种酶促过程的作用，允许荧光能力发展。

在用于上面定义的测序仪中的步骤(3)的一个优选实施例中，采用设置在基板中的开放式管的阵列。然后将这些管的入口和出口设置在基板的相对的入口面和出口面上，其中入口面设置在液滴分配喷嘴的正下方。然后，管的主轴在与液滴分配的方向平行的方向上延伸。在一个实施例中，对准处于竖直平面中，从而允许通过重力和/或吸力的作用来填充管。在一个实施例中，基板是其中设置有规则毛细管阵列的材料(诸如金属、半导体、塑料或玻璃)的片材或块。在一个优选的实施例中，基板本身是已经在其中制成毛细管的硅、玻璃或塑料块，而在另一个实施例中，这些毛细管的内表面如上所述被涂覆。适当地处理玻璃或塑料基板，使得其具有一定程度的吸光度。在一个优选的实施例中，玻璃基板具有在1.4至1.7、优选1.45至1.65的范围内的折射率。

为了使管子能够被液滴分配喷嘴填充，测序仪包括用于使液滴分配喷嘴相对于基板的入口面在垂直于管的主轴的至少一个方向上步进的机构；适当地沿着与其垂直的两个轴。考虑到传统的打印机技术，这样做的方法将是容易明显的。在一个实施例中，喷嘴可以安装在可通过计算机控制的电动马达相对于固定基板在两个维度上移动的组件上；在替代性实施例中，基板安装在这样的组件上，而打印机喷嘴的位置是固定的。在又一个实施例中，喷嘴和基板都安装在可单独移动的组件上。

与基板相关联的是用于在每个管中产生液滴堆并根据需要从每个管释放液滴的控制器。如上所述，这种适当地由计算机控制的控制器可以包括用于产生负压的抽吸设备和用于根据需要接通和断开负压的机构。它还将优选地包括与每个管出口相关联的一系列微机电门，该一系列微机电门可以被打开和关闭以控制每个液滴通过出口从堆中的释放。在一个实施例中，这些门包括微机电阀或可穿过出口面移动的多孔板。

在一个实施例中，可以将能够在入射电磁辐射的影响下经历等离子体共振的金属颗粒或金属层与出口面相关联。通过这种方式，可以进一步增强来自每个液滴中的荧光团的荧光信号，从而提高装置的精度并减少下面提到的液滴串扰。

在该方法的步骤(4)中，液滴在管的出口端处依次从堆中释放，以使得能够在出现发生时检测包含在其中的荧光团。在管竖直对齐的情况下，出口将在堆的底部。适合用常规方式执行对这些荧光团的检测；即，用具有能够使荧光团发荧光的波长(例如可见光或紫外光)的电磁辐射照射每个液滴。此后，使用光电探测器或类似设备来检测产生的任何荧光。

适当地在与管的主轴基本平行的方向上执行液滴的照射，在这种情况下，在某些情况下存在检测到的荧光信号被堆中其余部分中在正研究的液滴后面的液滴发射的二次荧光信号复杂化的风险。通过从上述范围内仔细选择液滴、溶剂和玻璃基板的相对折射率；所使用的特定荧光团的性质以及在一定程度上基板的纹理、偏振和几何形状，可以基本上控制、减少甚至消除这种现象产生的荧光信号“串扰”。在一个实施例中，采用由黑色玻璃或其周边已经被黑色涂覆的玻璃制成的基板。在另一个实施例中，基板几何形状被选择为使得其不支持管中的长程波导模式；换句话说，建立的任何模式都是短程的，并且在堆中最多五个相邻的液滴上快速衰减。可以采用波导来帮助实现这一点。在一个实施例中，优选优化这些参数，使得观察到小于10％、优选小于5％的信号串扰。在另一个实施例中，来自在被检测的液滴的电磁辐射的散射抑制由堆中在该液滴后面的液滴对电磁辐射的拾波，例如通过调谐管中的波导模式。

在上面定义的测序仪中，入射电磁辐射源通常是led、激光器或可以借助于辅助光学器件(透镜、反射镜等)聚焦在包含出口的区域上的其他高强度光源。适当地，源连接到用于使出口的照射与来自出口的液滴的出现同步的机构。在一个实施例中，这包括用于使光源与微机电门的打开和关闭同步的微处理器。

最后，测序仪包括至少一个光电探测器等以检测同步的荧光信号。通常，该部件由被设计为同时实现所有出口处的同步测量的光电探测器矩阵组成。然后可以将由光电探测器产生的信号组合成数据流，该数据流被传送到微处理器或独立pc以进行进一步分析。

附图说明

现在参考附图举例说明根据本发明的方法和测序仪，附图示出了使用本发明方法的核酸测序仪的截面示意图。

具体实施方式

附着在珠子1上的dna样品通过消化腔室2中的聚合酶进行逐步焦磷酸解，包含焦磷酸盐和实现消化所需的其它试剂的水性介质流3已经加入通过消化腔室2。在2的下游，现在包含单核苷酸三磷酸4的有序流的3经由微流体管道5传递到包括液滴分配喷嘴7的液滴分配单元6。注射管线8将硅油供给到6的顶部，在6的顶部处产生包括3的液滴10并且使其流过注射管线9，在注射管线9处通过微注射引入根据我们的专利申请wo2016012789的探针、无机焦磷酸酶和外切核酸酶。接着，使现在具有1.3的折射率、其中至少一些包含4的水性液滴10从7出去，在7处液滴10依次被分配到基板11的块或片上。11由具有1.5的折射率并且安装在组件12上的吸光深色玻璃制成，组件12在至少由箭头指示的方向x上可移动。11还设置有开放式毛细管13的矩形阵列，毛细管13中的每一个都设有入口孔14和出口孔15。在其未使用状态下，11的入口面和管13分别涂覆并填充有折射率为1.5的硅油16。13的直径是液滴10的直径的1.75倍。

在11的出口面正下方的是多孔板17，该多孔板可以使用电动马达(未示出)沿轴线y-y′来回移动以部分地打开和关闭出口孔15。11的出口面被封闭在腔室18内，可以经由管19和计算机控制的泵(未示出)远程地施加吸力，以在每个14和15之间建立负压。通过这种方式，并且在每个15被17部分地关闭的情况下，每个液滴10通过16被分配到每个入口孔14中，在那里液滴被吸入其管13中并被堆放，直到每个管充满。此后，11返回其起始位置，并且10的内容物留下来温育一段时间。

当准备好分析液滴10的内容物时，17被致动(通过相对于11的侧向运动)以打开和关闭每个15，从而允许堆中的每个10依次被吸出13并且到11的在17正下方的表面上。在打开和关闭17的同时，用从管的轴略微轴偏移的高强度相干光源(诸如激光(未示出))来照射释放的液滴，这使得每个释放10中的活性荧光团发荧光。同样，与此同时，与每个15相关联的光电探测器阵列20检测在与15平行的方向上反向散射的任何荧光，使得产生多个核苷酸特征信号，该信号可以被组合成数据流以由微处理器(未示出)分析，以便重建1的序列。借助于微处理器21实现同步。