一种酸辅助分散液液微萃取果汁中真菌霉素的方法与流程

本发明涉及检测技术领域，尤其是一种酸辅助分散液液微萃取果汁中真菌霉素的方法。

背景技术

真菌霉素是真菌产生的次级代谢产物，多年来一直在粮食、蔬菜、水果中存在，对人类健康的危险系数增大。目前，实验室内常用的真菌霉素检测方法有四种，多种真菌霉素同时检测，主要是直接提取样品中的霉素，用液相色谱质谱联用同时测定，但是这种方法需要加入全碳标记的稳定同位素霉素作为内标，但是价格昂贵，实验成本较高，现在需要一种提取方法，能够缩短提取时间，提高检测效率，降低成本，提高安全性。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种酸辅助分散液液微萃取果汁中真菌霉素的方法，该方法能够快速达到萃取平衡，不需要超声、涡旋等操作，方法简单。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酸辅助分散液液微萃取果汁中真菌霉素的方法，包括以下步骤：

s101在离心管中加入水作为基质，加入目标毒素混合物10ng/ml；

s102配制盐酸溶液，在盐酸溶液中加入萃取剂，配制成盐酸混合溶液；

s103将s102中的盐酸混合溶液加入s101中的水中，再加入0.5mol·l^-1na3po4缓冲溶液调节ph，形成雾状胶体，离心；

s104测量下层液体体积，再取下层液体进行检测。

优选地，所述目标霉素包括以下中的一种或几种：链格饱单甲醚、链格饱霉酚、赭曲霉素、桔霉素、黄曲霉b1、黄曲霉b2、黄曲霉g1、黄曲霉g2。

优选地，所述萃取剂包括以下中的一种或几种：邻茴香胺、邻甲苯胺、三氯苯胺、对氯苯胺。

优选地，所述萃取剂的含量为60-100μl。

优选地，s102中盐酸混合溶液的ph为0.5。

优选地，盐酸的体积为0.5-1.5ml。

优选地，s103中调节ph至5-7。

优选地，s103中离心的速度为4000r/min，离心的时间为5min。

本发明的技术效果：

本发明的方法中，苯胺类物质正常状态下不溶于水，酸性条件下溶于水，将水中的ph调整为碱性后又析出。在本发明中，将盐酸溶液作为分散剂，与苯胺类萃取剂混合，加入基质中，再加入碱性缓冲溶液，酸碱反应中和的过程中可以快速达到萃取平衡，不需要超声、涡旋等操作，苯胺物质析出，离心将苯胺类物质取出进样，该方法操作简单，条件可控性好，能够快速检测，并且检测的精确度较高。

附图说明

图1不同萃取剂对真菌霉素的提取效果图；

图2不同用量萃取剂对真菌霉素的提取效果图；

图3不同用量分散剂对真菌霉素的提取效果图；

图4平衡体系不同ph对真菌霉素的提取效果图；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

在10ml具塞离心管中加入5ml水为基质，加入10种目标毒素的混合物10ng/ml。配制ph为0.5的盐酸溶液1ml，将100μl邻茴香胺作为萃取剂加入其中溶解。将配好的盐酸混合溶液加入水中，再加入na3po4缓冲溶液，直至不再产生多余雾状胶体，置于离心机中以4000r/min离心5min。

进样方法：去除上层水相溶液，沉积相用180μl甲醇乙腈混合溶液，定容至200μl，溶解后过膜进样。

实施例2

在10ml具塞离心管中加入5ml水为基质，加入10种目标毒素的混合物10ng/ml。配制ph为0.5的盐酸溶液1ml，将100μl邻甲苯胺作为萃取剂加入其中溶解。将配好的盐酸混合溶液加入水中，再加入na3po4缓冲溶液，直至不再产生多余雾状胶体，置于离心机中以4000r/min离心5min。

进样方法：去除上层水相溶液，沉积相用180μl甲醇乙腈混合溶液，定容至200μl，溶解后过膜进样。

实施例3

在10ml具塞离心管中加入5ml水为基质，加入10种目标毒素的混合物10ng/ml。配制ph为0.5的盐酸溶液1ml，将100μl三氯苯胺作为萃取剂加入其中溶解。将配好的盐酸混合溶液加入水中，再加入na3po4缓冲溶液，直至不再产生多余雾状胶体，置于离心机中以4000r/min离心5min。

进样方法：去除上层水相溶液，沉积相用180μl甲醇乙腈混合溶液，定容至200μl，溶解后过膜进样。

实施例4

在10ml具塞离心管中加入5ml水为基质，加入10种目标毒素的混合物10ng/ml。配制ph为0.5的盐酸溶液1ml，将100μl对氯苯胺作为萃取剂加入其中溶解。将配好的盐酸混合溶液加入水中，再加入na3po4缓冲溶液，直至不再产生多余雾状胶体，置于离心机中以4000r/min离心5min。

进样方法：测量下层液体体积，再取下层液体用180μl甲醇乙腈混合溶液溶解后过膜进样，可得约130微升。

实施例1-4中得到的提取效果如图1中所示，以浓缩倍数为判断基础，选用三氯苯胺时萃取效果最好。

实施例5

在10ml具塞离心管中加入5ml水为基质，加入10种目标毒素的混合物10ng/ml。配制ph为0.5的盐酸溶液1.5ml，将不同组份三氯苯胺加入其中溶解。将配好的盐酸混合溶液加入水中，再加入na3po4缓冲溶液，直至不再产生多余雾状胶体，置于离心机中以4000r/min离心5min。

进样方法：测量下层液体体积，再取下层液体用180μl甲醇乙腈混合溶液溶解后过膜进样，可得约130微升。

实验测得，在该条件下三氯苯胺损失约为45μl，所以选择萃取剂含量为60、70、80、90、100μl。

实施例5中不同组份三氯苯胺的萃取结果如图2中所示，在萃取剂含量为60μl时可以得到最高的浓缩倍数，可以大大降低检出限，所以选用60μl萃取剂。

实施例6

在10ml具塞离心管中加入5ml水为基质，加入10种目标毒素的混合物10ng/ml。配制ph为0.5的盐酸，将60μl三氯苯胺加入各组分中溶解。将配好的盐酸混合溶液加入水中，再加入na3po4缓冲溶液，直至不再产生多余雾状胶体，置于离心机中以4000r/min离心5min。

进样方法：去除上层水相溶液，沉积相用180μl甲醇乙腈混合溶液，定容至200μl，溶解后过膜进样。

选取研究的组份为：0.5ml、0.75ml、1.0ml、1.25ml、1.5ml

实施例6中的萃取结果如图3中所示，选取1.5ml的分散剂(盐酸溶液)效果最好。

实施例7

在10ml具塞离心管中加入5ml水为基质，加入10种目标毒素的混合物10ng/ml。配制ph为0.5的盐酸1.5ml，将60μl三氯苯胺加入各组分中溶解。将配好的盐酸混合溶液加入水中，再加入na3po4缓冲溶液，调节到目标ph，置于离心机中以4000r/min离心5min。

进样方法：去除上层水相溶液，沉积相用180μl甲醇乙腈混合溶液，定容至200μl，溶解后过膜进样。

实验表明，在ph＝4.23时，开始产生雾状物，ph＝4.80时沉淀完全。所以分析平衡体系ph为5、6、7。

实施例7中萃取结果如图4中所示，ph为5时，所有的目标物浓缩倍数最高，提取效果最好。

实施例8

综合实施例1-7，实施例8为最佳实施例，步骤和条件为：在10ml具塞离心管中加入5ml水为基质，加入10种目标毒素的混合物10μg/kg。配制ph为0.5的盐酸溶液1.5ml，将60μl3-氯苯胺加入其中溶解。将配好的盐酸混合溶液加入水中，再加约2600μl0.5mol·l^-1na3po4缓冲溶液将ph调节至5，形成雾装胶体，置于离心机中以4000r/min离心5min。

进样方法：去除上层水相溶液，沉积相用180μl甲醇乙腈混合溶液，定容至200μl，溶解后过膜进样。

经检测，购买的果汁为阴性样品。

由于基质效应与溶剂效应较大，所以配制果汁基质标准品进样。

果汁ck处理方法：稀释两倍，经过8μm孔径水相过滤膜处理。作为添加样品。

为了减少基质效应，用水果果汁基质经过3-氯苯胺提取后的溶剂作为基质标。配制1～500μg/l溶液。

所有的基质标准品配制的标准曲线r²大于0.99。

保留时间，检出限，检出量如表1所示。

表18种毒素在不同果汁中的保留时间，检出限，检出量

样品测试

采用实施例8的方法，对荔枝、香蕉、菠萝、芒果、火龙果进行检测，检测结果如表2-6中所示。

表2荔枝果汁平均添加回收率

表3香蕉果汁平均添加回收率

表4菠萝果汁平均添加回收率

表5芒果果汁平均添加回收率

表6火龙果果汁平均添加回收率

上述实施例中，苯胺类物质正常状态下不溶于水，酸性条件下溶于水，将水中的ph调整为碱性后又析出。在本发明中，将盐酸溶液作为分散剂，与苯胺类萃取剂混合，加入基质中，再加入碱性缓冲溶液，酸碱反应中和的过程中可以快速达到萃取平衡，不需要超声、涡旋等操作，苯胺物质析出，离心将苯胺类物质取出进样，该方法操作简单，条件可控性好，能够快速检测，并且检测的精确度较高。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。