聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱及其制备方法和应用与流程

本发明属于萃取柱制备技术领域，特别涉及一种聚苯乙烯-二乙烯基苯无加热固相皂化萃取柱及其制备方法和应用。

背景技术

皂化作为一种流形的样品预处理技术，常用于将目标分析物从脂质样品基质中释放放出来，例如将甘油酯转化为甘油和脂肪酸盐，从而降低液液萃取中进入有机相的负荷或干扰。皂化已经被广泛的用于测定一些疏水性物质过程中的样品处理，如生育酚类，多环芳香烃类，脂溶性维生素类，植物甾醇类，类胡萝卜素，矿物油，多氯联苯，胆固醇等。

传统的液-液皂化反应通常反应时间长，需要水浴加热回流或者需要采用特殊仪器进行加热。传统的液-液皂化反应的反应温度一般应保持在室温到混合物的沸点这个范围内，反应时间也从30min到24h不等，或者需要更长的反应时间。所以传统的皂化方法既费时费力，而且材料消耗量大，更难以实现对样品的快速有效分析。

技术实现要素：

本发明的目的在于，针对现有液-液皂化反应中存在的上述问题，提供一种聚苯乙烯-二乙烯基苯无加热固相皂化萃取柱及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：

一种聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱，包括空柱管，所述空柱管内从下向上依次设置有出口筛板、聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层、隔离筛板和koh粉末填料层，所述空柱管的内径为0.3cm～5cm，所述聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层的高度为0.5cm～3cm，所述koh粉末填料层的高度为0.5cm～3cm，所述出口筛板和隔离筛板为脱脂棉、滤纸、玻璃棉或多孔陶瓷中的一种。

进一步的，所述空柱管为一次性塑料注射器或商品型固相萃取柱，且所述空柱管的材料为聚丙烯、聚乙烯或聚四氟乙烯中的一种。

进一步的，所述聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒的粒径为3μm～100μm，所述聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒为孔径为的多孔颗粒或无孔颗粒。

聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱的制备方法，包括如下步骤：

s1、取一下端设有出口的空柱管，并向空柱管的底端压入出口筛板；

s2、向出口筛板上填充聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层并压实；

s3、向聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层上压入隔离筛板；

s4、向隔离筛板上填充koh粉末填料层并压实，制得所述聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱，并真空保存备用。

一种聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱在含脂质液体的样品前处理中的应用。

进一步的，所述聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱用于含脂质液体的样品前处理的过程是：

a、将含脂质液体的样品点入无加热固相皂化萃取柱的koh粉末填料层中，并滴加高纯水，使萃取柱浸润，反应4min～10min；

b、再用高纯水冲洗萃取柱，待流出的液体呈中性后，用5ml～20ml有机溶剂洗脱萃取柱3～5次，收集洗脱液，所述洗脱液中含有目标分析物；

c、将洗脱液中的溶剂蒸干后，再加入0.5ml～1.5ml的有机溶剂，震荡溶解，过0.22μm的滤膜，制得分析溶液，待用。

进一步的，所述含脂质液体的样品为液体油脂、动物奶、血液、血清、溶解有奶油的溶液或者溶解有奶粉的溶液；所述目标分析物为胆固醇、植物甾醇类、脂溶性维生素、生育酚、多环芳烃、类胡萝卜素、多氯联苯或番茄红素。

进一步的，所述有机溶剂为正己烷、甲醇、乙腈或异丙醇中的一种或两种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)这种聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱在使用时无需加热，使用方便。

(2)这种萃取柱的制备方法简单、快捷、安全且花费低。

(3)这种萃取柱在应用中摒弃了传统液相皂化在样品前处理过程中费时、费力、费溶剂等缺点，显著降低了皂化时间，且无需额外的加热和固相萃取(spe)步骤，节省大量的时间和手工劳动，并可获得良好的净化效果。

附图说明

图1是本发明具体实施例中胆固醇标准曲线(a)，猪血(b)和地沟油(c)的hplc色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达到目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明的实施例中使用的仪器和试剂如下：

仪器：agilent1260高效液相色谱仪；mtn-2800d氮吹仪；artmiccrad-8匀浆器；ms3基本型旋涡混合器；bt125d电子天平。试剂：乙腈(色谱纯)，koh、异丙醇、正己烷(分析纯)；通过milli-q超纯水仪制备的超纯水。

标准物质：从dr.ehrenstorfer公司购买的胆固醇。

液相色谱条件为：

色谱柱：agilentc18，250mm×4.6mm，5μm；流动相:乙腈/异丙醇(60/40，v/v)；柱温35℃；流速1.0ml·min-1；检测波长210nm；进样量10μl。

实施例1

一种聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱，包括空柱管，空柱管内从下向上依次设置有出口筛板、聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层、隔离筛板和koh粉末填料层，空柱管的内径为0.3cm，空柱管是材质为聚丙烯的一次性塑料注射器，聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层的高度为0.5cm，聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒是粒径为3μm～100μm的无孔颗粒，koh粉末填料层的高度为0.5cm，出口筛板和隔离筛板为脱脂棉。

上述聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱制备过程如下：

s1、取一下端设有出口的空柱管，并向空柱管的底端压入出口筛板；

s2、向出口筛板上填充聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层并压实；

s3、向聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层上压入隔离筛板；

s4、向隔离筛板上填充koh粉末填料层并压实，制得所述聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱，并真空保存备用。

实施例2

一种聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱，包括空柱管，空柱管内从下向上依次设置有出口筛板、聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层、隔离筛板和koh粉末填料层，空柱管的内径为2.5cm，空柱管是材质为聚四氟乙烯的商品型固相萃取柱，聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层的高度为2.5cm，聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒是粒径为3μm～100μm的无孔颗粒，koh粉末填料层的高度为2.5cm，出口筛板和隔离筛板为玻璃棉。

上述聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱制备过程与实施例1相同。

实施例3

一种聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱，包括空柱管，空柱管内从下向上依次设置有出口筛板、聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层、隔离筛板和koh粉末填料层，空柱管的内径为5cm，空柱管是材质为聚乙烯的商品型固相萃取柱，聚苯乙烯-二乙烯基苯颗粒填料层的高度为3cm，苯乙烯-二乙烯基苯颗粒是粒径为3μm～100μm多孔颗粒，且孔径为koh粉末填料层的高度为3cm，出口筛板和隔离筛板为多孔陶瓷。

上述聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱制备过程与实施例1相同。

为了进一步的探究上述实施例1～3中制备的聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱的应用，以实施例2制备的聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱为例，用于含脂质液体的样品前处理，过程如下：

(1)样品的制备

量取添加有抗凝剂的猪血液样品500μl于试管中，并用生理盐水稀释至1.0ml，使用时直接移取100μl。

地沟油样品不需要处理，使用时直接移取100μl。

(2)样品前处理

a、用移液枪将样品点入萃取柱的koh粉末填料层中，并滴加高纯水，使萃取柱浸润，并反应6min；

b、再用高纯水冲洗萃取柱，待流出的液体呈中性后，用10ml正己烷洗脱萃取柱3次；

c、收集洗脱液，用氮气吹干溶剂后，再使用乙腈/异丙醇(60:40，v/v)定容至1ml，震荡溶解，过0.22μm的滤膜，制得分析溶液，待用。

本发明自热固相皂化的原理在于：当滴加蒸馏水浸润koh粉末填料层，固体koh的溶解热可使柱体温度迅速上升至60～80℃，同时过量的koh可以提高oh-浓度，可以促使皂化反应快速进行(5分钟内完全反应)，同时高浓度的koh可以快速促使血液中的细胞破裂，快速释放目标分析物。

(3)标准工作溶液的配制

准确称取胆固醇标准物质1mg，用无水乙醇定容至10ml，得0.1mg/ml标准储备液，4℃暗处储存待用。

准确移取上述标准储备液，逐级稀释，配制成5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和500μg/ml的胆固醇标准溶液。将不同浓度的标准工作液进行反相液相色谱法(rplc)测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线，如表1。

表1胆固醇的标准曲线

(4)样品的检测与方法性能评价

a、样品中胆固醇含量的检测

在与测量胆固醇标准曲线的相同条件下将经过前处理的样品溶液进行rplc测定，测得血液样品中胆固醇的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中胆固醇含量，然后根据样品溶液所代表试样的质量计算得到样品中胆固醇残留量。若上机溶液中胆固醇残留量超过线性范围上限，需用提取溶剂将上机溶液稀释至线性范围之内。

b、方法性能评价

a、加标回收率和重复性：

在不同的血液样品(见表2)中加入一定量的胆固醇标准溶液，混匀后按上述血液样品前处理步骤进行处理后，进行高效液相色谱测定。将测定浓度与理论添加浓度进行比较，得到样品添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表2。由表2可以看出，胆固醇的平均回收率为97.6％～101.3％，平均相对标准偏差(rsd)为2.5％～3.7％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表2胆固醇的加标回收率和相对标准偏差rsd％

b、检出限：

将不同浓度的胆固醇基质标准工作溶液注入hplc，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比计算检出限，胆固醇的检出限为2μg/kg。

图1给出了上述2种含胆固醇液体样品按本方法处理后的高效液相色谱图，其中胆固醇目标峰完全与基线分离，且色谱图很“干净”，没有杂峰，表明这种无加热自热皂化固相萃取柱用于上述两种样品的前处理过程是成功的。

综上所述：

(1)这种聚苯乙烯-二乙基苯无加热固相皂化萃取柱在使用时无需加热，使用方便。

(2)这种萃取柱的制备方法简单、快捷、安全且花费低。

(3)这种萃取柱在应用中摒弃了传统液相皂化在样品前处理过程中费时、费力、费溶剂等缺点，显著降低了皂化时间，且无需额外的加热和固相萃取(spe)步骤，节省大量的时间和手工劳动，并可获得良好的净化效果。

以上公开的仅为本发明的较佳实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。