一种磁性复合微球及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种磁性复合微球及其制备方法及应用，具体涉及一种具有可调聚合物壳层磁性复合微球的合成对菠萝蛋白酶的分离纯化及酶性能研究，属于天然产物分离纯化技术领域。

背景技术：

菠萝蛋白酶，亦称为凤梨酵素，是从菠萝的果茎，叶，皮中提取出来，应用于各个行业，用于食品加工，烘焙，肉类的嫩化。在美容行业中，具有嫩肤，美白祛斑的优异功效。在医药行业，科学家们已经开展了药理学研究调查，证明菠萝蛋白酶可以抑制血小板聚集，治疗心血管疾病，阻碍肿瘤细胞的增殖。该酶对肿胀和炎症也有效。

由于这些宝贵的特性，工业上菠萝蛋白酶的提取方法主要工艺有高岭土吸附法、单宁沉淀法、盐析法和超滤法等高岭土吸附法，凝胶过滤法和水相两相萃取法。但这些方法都各自存在一些不足之处，如工艺流程长，原料消耗多，成本高，酶活总回收率低。而且，这些方法通常需要存在有机化学试剂溶剂和高温，这可能导致靶蛋白的构象发生变化，从而变质。因此，迫切的需要开发出更高效，生物相容性好的提取菠萝蛋白酶技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服目前菠萝蛋白酶提取工艺复杂，酶活损失严重，污染环境等缺陷，而提供一种新型的功能性聚合物壳的核/壳磁性复合微球分离纯化菠萝蛋白酶的新方法，该方法具有操作简便，特异性高，分离效果好，酶活损失少，生产成本低等优点，且磁性微球可循环使用。

本发明采取的技术手段如下：

本发明首先提供一种新型的功能性聚合物壳的核/壳磁性复合微球fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺的制备方法，具体步骤如下：

（1）二氧化硅包覆四氧化三铁聚（n-异丙基丙烯酰-合-n-烯丙基咪唑）（fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)）微球的合成：

称量fe3o4粉末添加至含无水乙醇、蒸馏水中和氨水的混合溶液中，并进行超声分散，于室温条件下开启机械搅拌，使用移液枪向反应体系中逐滴加入正硅酸四乙酯（teos），机械搅拌过夜，利用磁铁分离得到产物二氧化硅包覆四氧化三铁磁性微球（fe3o4@sio2），并利用乙醇和去离子水多次洗涤产物直至上清变为无色，最后干燥至恒重。

fe3o4@sio2表面修饰双键：利用硅烷偶联剂mps在醇水混合溶液中的水解作用可在fe3o4微球表面形成丰富的双键。具体操作步骤为：将0.1-0.5gfe3o4@sio2利用超声分布于含有30-50ml乙醇，5-15ml水，1-2ml氨水和0.3-0.9gmps的混合溶液中，在70℃条件下机械搅拌24h。利用磁铁分离产物，并使用乙醇和去离子水多次洗涤产物直至上清变为无色，最后干燥至恒重。

称量表面修饰双键的fe3o4@sio20.03-0.08g超声分散于30-50ml乙腈中，然后加入共聚单体n-烯丙基咪唑（aim）和n-异丙基丙烯酰胺(nipam)，按照nipam和aim的质量比为1-9:9-1的比例合成，分别加入60-180mg交联剂n,n-亚甲基双丙烯酰胺（mba）和4-8mg引发剂偶氮二异丁腈（aibn）引发反应。将烧瓶浸入到油浴锅中，上接分馏柱，冷凝管和接收装置，将油浴温度在30min内由室温均匀升至乙腈沸点，大约一个小时蒸馏出一半溶剂时，反应终止。将得到的产物依次用乙醇和去离子水多次清洗后，进行干燥至恒重。

（2）二氧化硅包覆四氧化三铁聚（n-异丙基丙烯酰-合-n-烯丙基咪唑）合镍（ⅱ）（fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni2+）的合成：

将40-60mg步骤（1）得到的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)微球分散于8-12ml浓度为0.1m的nicl2溶液中，机械搅拌反应；磁分离产物，用乙醇和水洗涤几遍；在干燥至恒重；后将所得产物分散于nicl2溶液中，室温搅拌2h；磁分离产物，用去离子水洗涤几遍，真空干燥至恒重。

本发明还提供该新型磁性微球fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺用于分离纯化菠萝蛋白酶，并实现对菠萝蛋白酶的热保护作用，具体内容如下：

将浓度为0.1-1.0mg/ml的菠萝蛋白酶溶液与0.1-0.3mgfe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺微球混合，用浓度为0-1.5m的nacl调节ph为4-8，在15℃到40℃的恒温震荡箱内震荡10分钟-50分钟，磁铁分离磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未吸附的菠萝蛋白酶，测定吸附前后菠萝蛋白酶溶液的吸光值。

本发明具有如下优点：

（1）本发明中，在fe3o4表面包覆sio2可以有效避免fe3o4之间的磁性偶极相互作用造成的聚集现象，并且外界环境中的酸不易侵蚀到内部的fe3o4，提高了其生物相容性，并且包覆sio2后，其粒子表面的硅羟基含量也进一步得到提高，有利于各种聚合物的进一步修饰。引入1-乙烯基咪唑单体作为螯合金属离子的连接臂，可在磁性微球表面形成高密度连续壳层，增加了材料对菠萝蛋白酶的吸附量。

（2）本发明中所设计合成的可调聚合物壳层磁性微球由于fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺中nipam对温度的特殊敏感性，可作为对酶热保护的响应型开关，将达到吸附平衡的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺与菠萝蛋白酶的混合液，分别置于25,55,60,65,70,75,80℃的环境中保持10min，后将吸附剂上的菠萝蛋白酶洗脱下来测酶活，对照组与上述操作一样，结果见图6，以室温下的酶活为基准，可以发现，游离菠萝蛋白酶在80℃时酶活几乎完全损失，而在有吸附剂材料存在时，酶活性比游离酶高，由于菠萝蛋白酶的最适温度是55℃，所以在55℃条件下变性10min后，酶的活性损失并不多，但随着变性温度的增加，结合酶的活性明显高于游离酶，表明fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺对菠萝蛋白酶有一定的热保护作用。

（3）本发明中制备合成的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺该材料具有很好的重复利用性，在循环使用6次后，菠萝蛋白酶的吸附量仍然能够保持为原来的90%；此外，将吸附剂材料的每一次循环利用后的洗脱液保留，进行sds-page凝胶电泳分析，从电泳图中可以直观的看出材料能够实现循环利用，有助于其进一步的工业应用。

（4）与现有的分离纯化菠萝蛋白酶技术相比较，本发明中使用的分离纯化方法操作简便，特异性高，分离效果好，酶活损失少，且对环境无污染。另外，从菠萝皮、菠萝茎等部分提取菠萝蛋白酶不但可以改善环境，同时也提高了菠萝产业的增值，实现了废弃资源的重新利用，将产生良好的经济和社会效益。

附图说明

图1为按照实施例1和实施例3制备的fe3o4（a）和fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)（b）的tem图。

图2为按实施例1和实施例3制得的fe3o4（a）、fe3o4@sio2（b）和fe3o4@p(gma-co-nipam)（c）的红外谱图。

图3为按实施例1和实施例3制得的fe3o4（a）、fe3o4@sio2（b）,fe3o4@sio2/mps(c),fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)(d),fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺(e)的vsm图。

图4为实施例6中的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附菠萝蛋白酶循环6次的吸附量（a）、吸附市售菠萝蛋白酶（b）、吸附菠萝皮粗提液中的菠萝蛋白酶（c）的凝胶电泳图。

图5为实施例6中菠萝蛋白酶液（泳道p）、经fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附后的溶液（泳道l）和fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附菠萝蛋白酶后经洗脱下来溶液（泳道1）凝胶电泳分析结果图，图中，泳道m为marker。

图6为实施例8中fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺对菠萝蛋白酶热保护效果图。

图7为实施例9中fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺分离纯化菠萝蛋白酶洗脱前后的菠萝蛋白酶进行了ft-ir（a）和cd（b）分析结果图。

具体实施方式

下面通过实例进一步描述本发明，并结合附图说明使得本技术方案更加清晰易懂，显然，所列举的实施例并不是全部的实施例，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进替换或变型均属于本发明的保护范围。

本发明中所涉及的菠萝蛋白酶的制备方法如下：

在当地超市购买新鲜的菲律宾进口菠萝，清洗干净后，剥皮，将菠萝皮置于冰箱中预冷12h，将菠萝皮与磷酸盐缓冲液按照1:1的比例进行榨汁，然后保持10min后，过滤，将滤液倒入10ml离心管中，在6000r/min离心机中离心20min，温度设置为4℃，上清液放入-18℃冰箱中保存，即得到粗提菠萝蛋白酶液。

实施例1：fe3o4@sio2的制备与表面修饰双键

（1）fe3o4的制备

将1.350gfeci3·6h2o，3.854g乙酸铵和0.400g柠檬酸三钠完全溶解于70ml乙二醇中，室温条件下机械搅拌1h，此时溶液变为黄褐色，添加到聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中。然后进行封装，放入200℃干燥箱中保持16h。取出后，利用磁铁分离得到产物fe3o4，并使用乙醇除去杂质后，干燥至恒重。

（2）fe3o4@sio2的制备与表面修饰双键

利用溶胶凝胶法将sio2壳层包覆在fe3o4表面。具体实验步骤为：称量0.3gfe3o4粉末添加至含40ml无水乙醇、10ml蒸馏水中和1.5ml氨水的混合溶液中，并进行超声分散，于室温条件下开启机械搅拌，使用移液枪向反应体系中逐滴加入0.6ml的正硅酸四乙酯（teos），机械搅拌过夜，利用磁铁分离得到产物fe3o4@sio2，并利用乙醇和去离子水多次洗涤产物直至上清变为无色，最后干燥至恒重。

利用硅烷偶联剂mps在醇水混合溶液中的水解作用可在fe3o4微球表面形成丰富的双键。具体步骤为：将0.3gfe3o4@sio2利用超声分布于含有40ml乙醇，10ml水，1.5ml氨水和0.6gmps的混合溶液中，在70℃条件下机械搅拌24h。利用磁铁分离产物，并使用乙醇和去离子水多次洗涤产物直至上清变为无色，最后干燥至恒重。

实施例2：fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺的合成

（1）fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)的合成

称量0.03g表面修饰双键的fe3o4@sio2超声分散于30ml乙腈中，然后加入共聚单体aim和nipam，保持共聚单体总量为200mg，按照nipam：aim为1:3的比例依次合成，分别加入60mg交联剂mba和4mg引发剂aibn引发反应。将烧瓶浸入到油浴锅中，上接分馏柱，冷凝管和接收装置，将油浴温度在30min内由室温均匀升至乙腈沸点，大约一个小时蒸馏出一半溶剂时，反应终止。将得到的产物依次用乙醇和去离子水多次清洗后，进行干燥至恒重。

（2）fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺的合成

量取40mgfe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)加入到8ml0.1m的nicl2溶液中，室温条件下机械搅拌2h，磁分离产物并用去离子多次清洗以去除未结合的ni²⁺，干燥至恒重。

实施例3：fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺的合成

（1）fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)的合成

称量0.08g表面修饰双键的fe3o4@sio2超声分散于50ml乙腈中，然后加入共聚单体aim和nipam，保持共聚单体总量为200mg，按照nipam：aim为1:1的比例依次合成，分别加入180mg交联剂mba和8mg引发剂aibn引发反应。将烧瓶浸入到油浴锅中，上接分馏柱，冷凝管和接收装置，将油浴温度在30min内由室温均匀升至乙腈沸点，大约一个小时蒸馏出一半溶剂时，反应终止。将得到的产物依次用乙醇和去离子水多次清洗后，进行干燥至恒重。

（2）fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺的合成

量取60mgfe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)加入到12ml0.1m的nicl2溶液中，室温条件下机械搅拌2h，磁分离产物并用去离子多次清洗以去除未结合的ni²⁺，干燥至恒重。

实施例4：fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的合成

（1）fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)的合成

称量0.06g表面修饰双键的fe3o4@sio2超声分散于35ml乙腈中，然后加入共聚单体aim和nipam，保持共聚单体总量为200mg，按照nipam：aim为1:9的比例依次合成，分别加入150mg交联剂mba和6.4mg引发剂aibn引发反应。将烧瓶浸入到油浴锅中，上接分馏柱，冷凝管和接收装置，将油浴温度在30min内由室温均匀升至乙腈沸点，大约一个小时蒸馏出一半溶剂时，反应终止。将得到的产物依次用乙醇和去离子水多次清洗后，进行干燥至恒重。

（2）fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺的合成

量取55mgfe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)加入到11ml0.1m的nicl2溶液中，室温条件下机械搅拌2h，磁分离产物并用去离子多次清洗以去除未结合的ni²⁺，干燥至恒重。

本发明中图1是按照实施例1和3制备的fe3o4（a）和fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)（b）的tem图。

由图1（a）可以看出，合成的fe3o4微球形貌均匀，粒径大约为250nm，外表面呈绒毛状，包覆sio2壳层后，如图1（b）所示，可以明显看出磁性微球fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)呈双层壳式结构，证明单体aim和nipam的共聚成功。

本发明中图2是按照按实施例1和实施例3制得的fe3o4（a）、fe3o4@sio2（b）和fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)（c）的红外谱图。如图所示，在3条谱带600cm^-1处均出现了fe3o4中fe-o的振动峰。修饰双键后，图2（b）中1087cm^-1处出现了双键的特征峰，证明mps成功的修饰在fe3o4表面。包覆p(gma-co-nipam)壳层后，图2（c）1521cm^-1和2949cm^-1处为nipam中n-h键和亚甲基的伸缩振动峰，918cm^-1和1228cm^-1处为aim中咪唑基的振动峰。证明聚合物壳层的修饰成功。

本发明中图3是按照实施例1和实施例3制得的fe3o4（a）、

fe3o4@sio2（b）、fe3o4@sio2/mps(c)、fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)(d)、fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺(e)的vsm图。测定了fe3o4、fe3o4@sio2、fe3o4@sio2/mps、fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)、

fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺的饱和磁化强度值（ms）分别是62.56、39.26、35.21、21.36和19.77emu/g，且所合成的磁球在室温时几乎没有明显的剩磁，表明均是超顺磁性的。尽管在包覆聚合物以后微球的饱和磁化强度值大幅度下降，但从图3中的插图照片可以看出，fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺仍然能够迅速的从蛋白酶溶液中分离出来，发挥其在实际应用中的优势。

实施例5：fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺用于分离纯化菠萝蛋白酶

（1）fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附量考察：

将300μl浓度为0.1mg/ml的菠萝蛋白酶溶液与0.2mg本发明中实施例3制备的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺微球混合，调节ph为4，nacl浓度为0m，在15℃的恒温震荡箱内震荡10分钟，磁铁分离磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未吸附的菠萝蛋白酶，测定吸附前后菠萝蛋白酶溶液的吸光值，此时吸附量为142.6mg/g。

（2）洗脱前后菠萝蛋白酶酶活测定：

将0.2mg结合菠萝蛋白酶的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺微球分散于200µl洗脱液（pbs,0.2m;ph=4;nacl,1.0m）中，40℃恒温震荡30min，磁铁分离磁性材料，用酪蛋白法测定上清液中菠萝蛋白酶酶活。通过紫外分析，红外分析结果证明其酶分子的结构在洗脱前后没有发生变化。并且得到结果fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺对菠萝皮粗提液中菠萝蛋白酶的纯化倍数为1.27，比活力为21.21a/u﹒mg^-1，提取回收率达到65%，纯化效果显著。

实施例6：fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺用于分离纯化菠萝蛋白酶

（1）fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附量考察：

将300μl浓度为1mg/ml的菠萝蛋白酶溶液与0.2mg本发明中实施例3制备的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺微球混合，调节ph为6，nacl浓度为0.1m，在30℃的恒温震荡箱内震荡30分钟，磁铁分离磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未吸附的菠萝蛋白酶，测定吸附前后菠萝蛋白酶溶液的吸光值，此时吸附量为198.6mg/g。

（2）洗脱前后菠萝蛋白酶酶活测定：

将0.2mg结合菠萝蛋白酶的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺微球分散于200ul洗脱液（pbs,0.2m;ph=4;nacl,1.0m）中，40℃恒温震荡30min，磁铁分离磁性材料，用酪蛋白法测定上清液中菠萝蛋白酶酶活。

为验证所制备的材料fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺循环利用的效果，将磁铁分离后的材料继续用于吸附，如此循环，作为对比，同时对购买的市售菠萝蛋白酶和本发明中制备的粗提菠萝蛋白酶液进行试验。结果如图4所示，图4a中，随着吸附剂材料不断被循环利用，吸附量逐步减少，可能是因为酸性洗脱液会破坏aim中咪唑基和ni²⁺的螯合作用，使得金属离子流失，造成吸附量的降低，但fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺在第6次循环利用时，其吸附量仍可达到190.5mg/g。表明该材料可实现循环利用，在生态循环方面具备价值。此外，将吸附剂材料的每一次循环利用后的洗脱液保留，进行sds-page凝胶电泳分析，图4b为fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附市售菠萝蛋白酶溶液循环6次的凝胶电泳图，图4c为fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附菠萝皮粗提液中的菠萝蛋白酶循环6次的凝胶电泳图，泳道m为蛋白质分子量marker，泳道1-6为每一次循环利用后从吸附剂材料上洗脱下来的菠萝蛋白酶溶液，从电泳图中可以直观的看出材料能够实现循环利用，有助于其进一步的工业应用。

图5为将菠萝蛋白酶液（泳道p），经fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附后的溶液（泳道l）和fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附菠萝蛋白酶后经洗脱下来溶液（泳道1）进行凝胶电泳分析。泳道m为marker，可以看出，菠萝皮粗提液中有多种杂蛋白，在经过材料吸附后，经fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附后的溶液中酶含量明显减少，从材料上洗脱下来的菠萝蛋白酶在电泳图中只出现一个条带，无其他杂带，证明该材料分离得到的菠萝蛋白酶其纯度已经达到电泳纯级别。通过紫外分析，红外分析结构证明其酶分子的结构在洗脱前后没有发生变化。fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺对菠萝皮粗提液中菠萝蛋白酶的纯化倍数为1.68，比活力为26.21a/u﹒mg^-1，提取回收率达到80%，纯化效果最好。

实施例7：fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺用于分离纯化菠萝蛋白酶

（1）fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺吸附量考察：

将300μl浓度为0.5mg/ml的菠萝蛋白酶溶液与0.2mg本发明中实施例2制备的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺微球混合，调节ph为8，nacl浓度为1m，在40℃的恒温震荡箱内震荡50分钟，磁铁分离磁性材料。用缓冲溶液冲洗材料两次以去除未吸附的菠萝蛋白酶，测定吸附前后菠萝蛋白酶溶液的吸光值，此时吸附量为141.6mg/g。

（2）洗脱前后菠萝蛋白酶酶活测定：

将0.2mg结合菠萝蛋白酶的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺微球分散于200ul洗脱液（pbs,0.2m;ph=4;nacl,1.0m）中，40℃恒温震荡30min，磁铁分离磁性材料，用酪蛋白法测定上清液中菠萝蛋白酶酶活。通过紫外分析，红外分析证明其酶分子的结构在洗脱前后没有发生变化。此时吸附量为163.6mg/g。fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺对菠萝皮粗提液中菠萝蛋白酶的纯化倍数为1.32，比活力为22.21a/u﹒mg^-1，提取回收率达到68%，纯化效果显著。

实施例8：fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺对菠萝蛋白酶的热保护作用

将300μl浓度为1mg/ml的菠萝蛋白酶溶液与0.2mg本发明中实施例3制备的fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺微球混合，调节ph为6，nacl浓度为0.1m，在30℃的恒温震荡箱内震荡30分钟后，将温度升至70℃保持10min，然后室温保持2h复性菠萝蛋白酶。磁分离产物，将产物分散于200ul洗脱液（pbs,0.2m;ph=4;nacl,1.0m）中，40℃恒温震荡30min，磁铁分离磁性材料，用酪蛋白法测定上清液中菠萝蛋白酶酶活。

本发明中图6为fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺对菠萝蛋白酶热保护效果图。将结合fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺的菠萝蛋白酶与游离菠萝蛋白酶均在25、55、60、65、70、75、80℃条件下保持10min后测酶活，可以明显看出游离酶酶活损失的更多，说明该材料对菠萝蛋白酶酶活有一定的热保护作用。

实施例9：fe3o4@sio2@p(nipam-co-aim)/ni²⁺对菠萝蛋白酶的保护作用

为了证明吸附和洗脱过程对菠萝蛋白酶分子的结构没有造成破坏，将洗脱前后的菠萝蛋白酶进行了ft-ir和cd分析。如图7(a)，吸附前，对蛋白质骨架震动敏感的酰胺ⅰ带出现在1627cm^-1处，洗脱后，酰胺ⅰ带的位置移动到了1630cm^-1处，其他各位置的峰情况保持一致，通过红外分析证明吸附和洗脱过程并没有使酶分子的结构遭到破坏。图7(b)为吸附之前和洗脱之后的菠萝蛋白酶溶液在195-250nm近紫外区的cd光谱。出现在208和222nm处的负峰为菠萝蛋白酶中α-螺旋结构，两条谱图的整体变化趋势相同，表明菠萝蛋白酶分子的结构在洗脱前后没有发生变化。证明了吸附和洗脱过程对菠萝蛋白酶分子的结构没有造成破坏。