一种位移式微流控芯片由表面张力生成液滴的方法与流程

本发明涉及液滴生成领域，尤其涉及一种位移式微流控芯片由表面张力生成液滴的方法。

背景技术

液滴(droplet)在化学、物理、生物及医学方面有非常多的应用。液滴的大小通常可以在微升(μl)到亚皮升(<pl)的体积，通常存在于互相溶解度较低的两项或多项液体中。它提供了非常独特的物理及化学微环境，同时大量的微液滴也可以用于高通量反应。

目前，产生微液滴的方法主要有流体法和芯片法两种：

1.流体法主要是通过特殊的微流控流体管道的设计，用有机液体将水溶液截断生成一系列的液滴。这种方法的描述请参考angew.chem.int.ed.2006,45,7336–7356。流体法的代表之一是交叉流动的液滴形成(cross-flowingdropletformation)。这种方法是通过有机相和水相以彼此成角度(t型或y型)的流动，利用剪切力(shearforce)将水相拉伸并最终生成液滴。另外一种代表的方法是流动聚焦液滴形成(flowfocusingdropletformation)。这种方法通过有机项和水相的非平行流动，经过一个约束的狭窄区域而生成液滴，代表文献为anna,shelley；bontoux,nathalie；stone,howard(2003)."formationofdispersionsusing"flowfocusing"inmicrochannels".americaninstituteofphysics.82:364。另外一种方法是共同流动的液滴生成(co-flowingdropletformation)，这种方法是使分散相(例如水相)管道被封闭在连续相(例如有机相)管道内，在分散相管道的末端，流体被拉伸直至剪切力将其断裂形成液滴，具体描述在anna,shelley(2016)."dropletsandbubblesinmicrofluidicdevices".annualreviewoffluidmechanics.48:285–309。以上所描述的这些方法已经有了一些商品化的产品，其中具有代表性的是伯乐(biorad)的液滴式数字pcr系统(ddpcr)。

2.芯片法主要是通过在微流控芯片上形成微孔或微反应池，再将分散相水溶液分散到微孔或微反应池中，再在微孔上方覆盖一层连续的有机相，使微孔中的水相形成相对独立的微液滴。这其中比较具有代表性的是赛默飞(thermo)的quantstudio3d数字pcr系统。另外一个代表是美国华盛顿大学的danielchiu课题组研究的自数字化芯片。(参考文献：a.gansen,i.k.dimov,l.p.lee,d.t.chiu(2012)"digitallampinasampleself-digitizationchip"labchip12,2247-2254)这些方法都是先使水溶液通过联通的流体通道注入到反应微孔阵列中，再使用有机相将微孔中的水溶液隔离成为相互不连接的微液滴。

滑动芯片(slipchip)是一种新型的微流控芯片，可以通过上下芯片的相对滑动产生微液滴。滑动芯片包含上子芯片和下子芯片。上子芯片的下表面及下子芯片的上表面制备有微孔。在初始位置，将上下子芯片装配到一起，上下子芯片的微孔有部分叠加，从而形成连通的流体管道。待溶液注射到芯片中后，将上下子芯片相对滑动，微孔不再相互部分叠加，从而产生大量的液滴。(参考文献：labchip20099:2286-2292，cn104722342b)

现有技术存在的缺点有：流体法和芯片法生成液滴通常需要复杂的系统和操作，并且系统及耗材成本较高；传统的滑动芯片虽然较为简便，但芯片制备中对精准度要求非常高，对上下子芯片在组装过程中的对其要求非常高(上下子芯片的微孔需要精准的对齐形成连通的流体管道，任何不精准的对齐都会引起溶液无法正常的注入芯片)；传统的滑动芯片需要较复杂的生成加工工艺；流体法生成的液滴无法有效的跟踪每一个液滴的状态；芯片法生成的液滴无法有效的回收。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种位移式微流控芯片由表面张力生成液滴的方法，上下子芯片采用联通管道式设计，通过位置移动和表面张力的作用来生成液滴。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的生成液滴操作复杂、耗材成本较高的缺点，实现简便的液滴生成，简化生产工艺，降低成本，实现液滴回收。

为实现上述目的，本发明提供了一种位移式微流控芯片由表面张力生成液滴的方法，包括以下步骤：

(1)将上子芯片和下子芯片组装到在初始位置，上下子芯片上的流体管道此时未相互重叠；所述上子芯片的流体管道具有重复的宽度或深度的连续变化的结构；

(2)将溶液注入到芯片中，充满流体管道；

(3)将上下子芯片相对移动到第二个位置，上下子芯片上的流体管道相互重叠；

(4)芯片间填充有机相溶液，水相液体会倾向于表面能低的状态，从而形成液滴。

进一步地，所述微流控芯片包含两片相互接触的子芯片，分别为上子芯片和下子芯片。

进一步地，所述芯片是由玻璃、石英、塑料、陶瓷或金属材料制成。

进一步地，所述上子芯片的下表面和所述下子芯片的上表面相互接触，所述上子芯片的下表面和所述下子芯片的上表面有流体管道。

进一步地，所述子芯片的表面经过疏水化处理。

进一步地，所述方法还包括液滴回收的步骤，具体为：利用液滴的密度与有机相密度的差异，使液滴可以进入直通流体管道；再加入附加的有机相、水相、或气体，将液滴推出芯片进行采集回收。

进一步地，所述方法还包括液滴回收的步骤，具体为：将上下芯片再次移动到新的位置或者初始位置，使包含液滴的直流道与另一层的流体管道不再相互重叠；再加入附加的有机相，或水相，或气体，将液滴推出芯片进行采集回收。

进一步地，所述流体管道可通过刻蚀、机械加工、热压或注塑成型方法制备。

进一步地，所述上子芯片中的流体管道的宽度变化范围为25-2500微米。

进一步地，所述有机相和水相溶液包含表面活性剂。

进一步地，所述水相溶液在有机相溶液中与疏水表面的接触角至少为90度。

本发明提出的芯片不需要向传统的滑动芯片需要精准的对齐，所以组装和操作都会更为简易。本发明提出的芯片只需要简单的制备方法。本发明提出的芯片可以对每一个液滴的位置进行跟踪，从而得到液滴的实时信息。因此，本发明可以简便的生成大量的微液滴，不需要昂贵的成本和复杂的手动操作；同时简单易操作，不需要复杂的仪器设备；加工简便，生成的微液滴便于回收进行下一步分析。

相比于以往的滑动芯片，本发明上下子芯片采用联通管道式设计，通过位置移动和表面张力的作用来生成液滴。不需要上下子芯片中的微孔进行对齐，简化了生产工艺，简化了操作过程。本发明生成的液滴可以方便的进行回收，从而进行下一步的分析。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的上子芯片仰视图；

图2是本发明的一个较佳实施例的下子芯片俯视图；

图3是本发明的一个较佳实施例的上下子芯片初始位置组合图

图4是本发明的一个较佳实施例的上下子芯片移动后的位置组合图

图5是本发明的一个较佳实施例的下子芯片流体管道示意图；

图6是本发明的一个较佳实施例的上下子芯片上的管道未相互重叠示意图；

图7是本发明的一个较佳实施例的溶液注入到芯片中时的流体管道示意图；

图8是本发明的一个较佳实施例的液滴形成示意图；

图9是本发明的一个较佳实施例的第一种方法的液滴回收示意图；

图10是本发明的一个较佳实施例的第二种方法的液滴回收示意图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

在附图中，结构相同的部件以相同数字标号表示，各处结构或功能相似的组件以相似数字标号表示。附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的，本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰，附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。

本发明通过联通式位移微流控芯片生成微液滴。本发明微流控芯片包含两片相互接触的子芯片(上子芯片(如图1)和下子芯片(如图2))。芯片可以是玻璃、塑料、陶瓷、金属等及符合材料构成。上子芯片的下表面和下子芯片的上表面相互接触(如图3)。在上子芯片的下表面和下子芯片的上表面有流体管道。流体管道可以通过湿/干法刻蚀(玻璃等)、或机械加工、热压、注塑成型等方法制备。子芯片的表面经过特殊的疏水化处理，例如使用二甲基二氯硅烷使芯片表面疏水化。

其中上子芯片设计的流体管道有重复的较细的连接结构(如图1)，下子芯片包含一个流体管道(如图2和图5)。例如上子芯片中的管道最宽处为500微米，最窄处为25微米，管道的深度为50微米；下子芯片中的管道为等宽500微米，深度为25微米。

将上下子芯片组装到一起在初始位置时，上下子芯片上的管道未相互重叠(图6)。将溶液注入到芯片中，充满实线标注的流体管道(如图7)。将上下子芯片相对滑动到第二个位置，实线标识的流体管道和虚线标识的流体管道相互重叠。由于芯片表面是疏水的，芯片间还填充有机相溶液，水相液体会更倾向于表面能低的状态，从而在管道窄的地方断开连接，形成液滴状(如图8)。

本发明涉及的生成液滴的方法可适用于注入的液体不浸润固体表面的体系，并不局限于水溶液在疏水的表面并有有机相存在的条件下。

本发明使用微流控芯片生成的液滴可以用来做数字基因扩增反应对目标基因进行定量。例如digitalpcr反应：含有pcr试剂(基因扩增酶、缓冲溶液、引物及荧光标记物)的反应溶液可以注射进联通的流体管道(如图6和图7)。通过上下子芯片的相对滑动，可以产生大量的微液滴。将芯片放置在一个pcr热循环仪的平板适配器上，即可进行数字pcr反应。

本发明涉及的微流控芯片可以将生成的液滴进行回收。液滴回收有很多的应用，例如在芯片上进行基因扩增后可以将液滴回收进行下一步的基因测序分析。在本发明提出的芯片设计中，可以利用液滴的密度与有机相密度的差异，使液滴可以进入直通流体管道(图9)。再加入附加的有机相，或水相，或气体，将液滴推出芯片进行采集。第二种方式也可以将上下芯片再次移动到新的位置或者初始位置，使包含液滴的直流道(虚线)与另一层的管道(实线)不再相互重叠(如图10)。再加入附加的有机相，或水相，或气体，将液滴推出芯片进行采集。

本发明通过使用微流控芯片中的一种即位移式微流控芯片来制备微颗粒。本发明所提到的微流控芯片可以由多种材料和加工方法制备而成。例如，该微流控芯片可以选用的材料包括玻璃、石英玻璃、塑料、陶瓷、金属、无机材料、纤维材料、聚合物等等。该微流控芯片的制备有很多不同的方法，包括湿法刻蚀、干法刻蚀、微机械加工、3d打印、热塑成形、压力成形、注模成型、注塑成形等等。

具体的以湿法刻蚀制备玻璃芯片为例。已经镀有铬层和光胶层的sodalime钠钙玻璃由teliccorporation(california,美国)购得。光掩模的设计由autocad软件完成。光掩模由深圳美精微光电股份有限公司打印制备。首先，将光掩模紧密覆盖在玻璃附有光胶的一面，将其置于全功能紫外曝光机中(intelli-ray400w)。采用50％的光源强度，曝光10-20秒。随后，将曝光后的玻璃浸泡于0.1mol/l的氢氧化钠(国药)溶液中1分钟，去除与紫外光反应的光胶部分。随后，将玻璃转移到去铬溶液中1分钟，使光胶已被去除而裸露的铬层得以去除。去铬溶液包含0.6mol/l的高氯酸(国药)和0.365mol/l的硝酸铈铵(麦克林试剂)水溶液。随后，将处理好的玻璃用去离子水进行充分润洗并用氮气吹干。玻璃不需要刻蚀的一面用防水胶布保护后，将玻璃需要刻蚀的一面向上浸没于玻璃刻蚀液中，对已经去除铬的裸露的玻璃进行刻蚀。为了更好的控制刻蚀速率和达到比较均一的刻蚀，湿法刻蚀在40摄氏度的恒温水浴摇床中进行。玻璃刻蚀溶液包含1mol/l氢氟酸(阿拉丁公司),0.5mol/l氟化铵(凌峰化学试剂)和0.75mol/l硝酸(国药)溶液。可以通过该湿法蚀刻方法在该玻璃芯片上形成所需的微孔。玻璃芯片上的微孔的深度可以由湿法刻蚀的时间控制。

制备好的芯片需要进行相应的表面处理。以玻璃芯片为例，需要对其表面进行疏水化处理，具体方法如下：首先将玻璃表面用去离子水充分清洗，并用氮气将表面吹干；其次，将玻璃芯片放置于等离子清洗仪(harrick，美国)中进行1分钟的表面等离子清洗及活化。最后，将玻璃芯片放置于含有20微升二氯二甲基硅烷(伊诺凯科技)的干燥器中进行气相硅烷化反应1小时。将处理好的芯片用氯仿(国药)、丙酮(国药)和无水乙醇(国药)冲洗，氮气吹干后即可进行下一步实验。

实例1：水溶液形成液滴

上子芯片(如图1)和下子芯片(如图2)中间放有矿物油，组装到初始位置(如图3)。矿物油可以提供位移时的润滑作用，并且矿物油、硅烷化表面和水相溶液构成了有利于表面张力驱使的液滴生成体系。水相溶液在矿物油和硅烷化玻璃表面的静态接触角大于140度，这很有利于液滴由于表面张力的作用，在与下子芯片的管道相接触时(如图4和图7)，从中间断开而形成独立的液滴(如图8)。

含有绿色食物染料的水溶液在初始位置注射到微流控芯片中，待溶液注射满后，上子芯片相对于下子芯片向下移动，使上子芯片的流体管道与下子芯片的流体管道相互重叠。在上子芯片管道中的水溶液可以部分的进入下子芯片的管道中。因为表面张力的作用，水溶液在矿物油和硅烷化表面更倾向于形成类球状的液滴。水溶液在上子芯片较窄的管道区域断开，形成独立的水溶液液滴。

实例2：数字基因扩增反应

类似于实例1，水溶液可以是用于基因扩增的反应溶液。例如，检测金黄葡萄球菌的pcr反应溶液包括10μl的2xssofastevagreen扩增溶液(biorad)、0.5μl的引物1(10μmol/l)、0.5μl的引物2(10μmol/l)、2μl的10mg/lbsa溶液(roche)以及5μl的包含目标金黄葡萄球菌基因的水溶液(10ng/ml)。这里引物1是gcgattgatggtgatacggtt，引物2是agccaagccttgacgaactaaagc。将这个反应溶液注射到芯片中，并如实例1所描述的步骤生成一系列液滴。

将这个芯片放置在具有加热平板的热循环仪中，使下子芯片的下表面与加热平板的上表面充分接触。热循环仪可以按照下列参数设置，对金黄葡萄球菌的nuc基因进行扩增和检测：2分钟在94℃启动扩增反应，随后是35个热循环：1分钟94℃、30秒55℃、30秒72℃。最后，可选进行5分钟72℃的最终扩增。最后，反应体系的温度降至4℃℃。芯片冷却后，可以放置在荧光显微镜下进行观测。包含金黄葡萄球菌基因分子的液滴的fam荧光强度会有显著的增强，而不包含金黄葡萄球菌基因分子的液滴的fam荧光强度不会有显著的增强。通过有荧光增强的液滴占总液滴的比例及每个液滴的体积，既可以计算出初始溶液中金黄葡萄球菌基因的绝对浓度。

实例3：基因测序前端扩增富集

类似于实例1，水溶液可以是包含全基因扩增的反应溶液。第二代测序(nextgenerationsequencing)的一个重要环节是对基因进行扩增，控制并减少扩增过程中的偏差(bias)是取得好的测序结果的基础。本发明以multipledisplacementamplification(mda)恒温全基因组扩增反应为例，但并不仅局限于mda反应。将含有mda反应溶液，引物和目标基因的水溶液加入到本发明的微流控芯片中，并按前文描述的过程生成液滴。每个液滴包含mda反应液，引物和单个基因分子。将这个微流控芯片放置于加热板上并保持30℃的温度1小时，在液滴中可以可控偏差的完成对目标基因的扩增和富集。随后，将空气注射到芯片中，空气可以将矿物油和水溶液液滴一起从芯片中推出。推出的溶液可以收集在试管中准备下一步的测序反应。在上述步骤中，也可以通过负压，或者抽真空的方法，从芯片的入口对液体进行回收。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。