一种微孔膜截留的微流体芯片及其溶液流路控制的方法与流程

本发明涉及生物反应检测分析中使用的样品分析微流体芯片，尤其涉及一种高效的微孔膜截留的微流体芯片及其溶液流路控制的方法。

背景技术：

免疫分析技术是其利用抗原与抗体之间高特异性产生的识别和结合反应实现生物分子的检测，具备灵敏度高、特异性强、适用面广、所需设备简单、线性范围较宽等优点，已成为当今最具竞争力和挑战性的分析测试技术之一，在生命科学、临床医学以及环境、食品、药物等领域得到广泛应用。免疫标记分析技术主要包括：放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记等方法。用放射物标记抗原或抗体发展的放射免疫分析(radioimmunoassay,ria)是美国科学yalow和berson于1959年创立的一种微量分析法,它是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术和特异性免疫化学技术相结合而建立的新方法。该技术利用核素标记物的放大效应,改善了待测物的检测下限,同时以抗体或抗原作为结合试剂,大大提高了检测方法的特异性。

以荧光标记的荧光免疫分析(fluoresceinimmunoassay,fia)是由conn等首创于20世纪40年代的一种标记免疫学技术,其所用标记物是荧光素和荧光染料,是将抗原或抗体标记以荧光物质与相应抗原或抗体结合,在荧光显微镜或紫外线照射下,检测荧光强度和荧光现象的一种检测方法。荧光标记免疫法灵敏度高,但荧光素常会产生生物学毒性,导致抗体或抗原的灵敏度和选择性下降

酶标记分析技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年，nakane等和avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术(enzyme-labelledantibodytechnique)，用于生物组织中抗原的定位和鉴定。1971年，engvallvanweemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代，基于酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。

发光标记分析是20世纪80年代末,国外开始用化学发光试剂来标记抗原或抗体,从而建立了发光免疫分析技术。狭义的发光免疫分析(lia)主要是指化学发光免疫分析(clia)。另外,还有酶放大化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析(eclia)。clia是sohrocler和halman在20世纪70年代末期建立的,该方法兼有发光分析的高灵敏度和免疫反应的特异性。其基本原理同酶标记分析法,是用化学发光反应的试剂(可以是发光剂或催化剂等)标记抗原或抗体，标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤(如离心分离、洗涤等),最后以测定发光强度形式测定。

目前免疫分析技术主要采用以微孔板为实验平台的非均相分析模式，需要包埋、洗脱、分离等多步操作，分析过程繁琐，分析时间长，不能满足快速检测和诊断的要求。

生物反应中通过微孔膜进行不同分子量的蛋白及微粒微球的穿越，是一个很常用的技术手段，尤其是在蛋白纯化中常用的离心滤管。但离心滤管一般是溶液手动加入，离心后添加复溶液将穿越的蛋白溶解回收。

国内专利cn201310228708-一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置及其检测方法中公开了一种方法：将标记蛋白的包被微球放入深孔滤板，与标记试剂进行静态的混合孵育反应，随后通过离心力作用将样品溶液及洗涤溶液从滤板的滤膜流尽，标记试剂等小分子或小粒径的物质随溶液流出了深孔滤板，包被微球则在穿越底部滤膜时被部分截留，随后通过光学对膜表面进行检测得到相关检测信号的实验，这个方式的意义在于免疫反应试剂在均相环境中进行了静态孵育，更加降低了对免疫抗体抗原的亲和力要求；同时孵育反应后溶液中承载着反应复合物的包被微球被集聚到滤膜中，起到了良好的反应物质浓缩作用。不过该专利中包被微球粒径与滤膜的孔径的关系没有明确界定，微球将渗入滤膜一定深度，这将导致部分微球会穿越滤膜导致结果不准，也导致滤膜不同深度的微球反射的光谱信号也有差异。如果这些微球全部被截留在滤膜表面，则能解决这个问题。

近年来微流控芯片技术迅速普及，它是一种全新的微量分析技术，可以实现从样品处理到检测的微型化、自动化、集成化及便携化，因此它可以在食品安全检测方面展现出强大的发展活力，提供了一种崭新的技术工具和平台。微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。微型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反应的结构，如毛细管电泳、聚合酶链反应、酶反应和dna杂交反应的微型反应器、免疫学检测反应等。无论在传统的elisa方法，还是新兴的化学发光方法中，绝大部分的免疫检测方法中都需要多种溶液的添加混合反应，因此也就需要多步操作。如何在微流控芯片中尽量减少溶液的种类，并且能让微流控免疫芯片能更自动地运行，减少人员的手动操作，是目前重要的发展方向。在溶液种类少，手动介入步骤也少的目标指导下设计出合适的微流控免疫芯片，同时还能借助微孔膜穿越的作用，将相关免疫学信号更好地检测到，也是具有相当挑战的方向。

技术实现要素：

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有生物反应的检测或分析的芯片检测中存在的问题，提出了本发明。本发明在仅添加两种溶液的情况下，采用微孔膜截留基于微球的免疫反应复合物的方式，实现了良好的检测效果。本发明在微流体芯片上实现了至少两种溶液的自动混合反应，将免疫反应的步骤简化为抗体抗原的静态孵育，随后洗涤液对反应区域进行洗涤后就能进行信号检测。同时静态孵育免疫反应中形成免疫反应微球复合物到达滤膜截留区域时，直径小于滤膜孔径的标记试剂能自由穿越滤膜，但粒径大于滤膜孔径的包被微球及其免疫反应复合物却被截留下来了，因此该发明能大大提高免疫反应的效率及灵敏度。

因此，本发明其中一个目的是提供一种需要样本量较少，试验步骤少，实验时间更短的自动检测的微孔膜截留的微流体芯片。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种微孔膜截留的微流体芯片，包括，第一样品区，自所述任一层面向另一层面凹陷形成容置空间，里面存储放置第一溶液；连通流路，连通芯片上各个区间之间的流路；第一反应区，自所述任一层面向另一层面凹陷形成容置空间，通过所述连通流路与所述第一样品区相连接，包括第一出液端和第一进液端，所述第一出液端置于所述第一反应区的中心底部，所述第一进液端设于所述第一反应区的边缘区域；其中，所述第一反应区内设有孔径均匀的微孔膜，所述微孔膜安置紧贴于所述第一反应区的端面，且盖住了该端面上所述第一出液端。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：所述芯片上还设置第一排气端，所述第一排气端设于所述第一反应区溶液最后充满的部位或所述第一反应区朝向芯片旋转离心中心点的顶部。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：所述微流体芯片区分为第一层面和第二层面，所述连通流路包括上下联络通道，所述上下联络通道贯穿所述第一层面和第二层面，且与所述第一层面和第二层面上下互通。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：还包括，第一控制区和第二样品区；所述第二样品区自所述第二层面向所述第一层面凹陷形成容置空间，里面存储放置第二溶液；所述第一控制区调控所述第二溶液进入所述第一反应区的时间，设于连接所述第二样品区与所述第一反应区的支路上，与所述第一样品区与所述第一反应区之间的流路交汇处。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：所述第一样品区自第一层面向所述第二层面凹陷形成容置空间，里面存储放置第一溶液；所述第一样品区下方设有第一容置空间，所述第一容置空间自第一层面向所述第二层面面凹陷，所述第一容置空间可通过所述上下联络通道与连通流路相连通，过滤所述第一样品区中的杂质。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：所述第一控制区内设有水化膜并盖住与连通流路相连通的上下联络通道。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：还包括，第二反应区，包括第二进液端和第二出液端，溶液自所述第二进液端充满所述第二反应区，并从所述第二出液端排出再流向第一反应区。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：所述第二反应区还包括第二排气端，所述第二排气端设置于溶液流入第二反应区时溶液最后充满的位置；所述第二出液端处设置有第二控制区，第二控制区设有水化膜，能够调控第二反应区的溶液流出的时间。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：还包括，第三样品区，自所述任一层面向所述另一层面凹陷形成容置空间，里面存储放置第三溶液；以及，第三控制区，设于所述第二反应区的下游，所述第一反应区的上游，连通所述第二反应区、第三样品区和所述第一反应区。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：在所述第二反应区的第二排气端相邻位置设置了溢流通道，样品溶液流入第二反应区超过所述第二反应区的容积后，多余的溶液通过溢流通道，流向溢液区。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片的一种优选方案，其中：所述第一反应区中心设有面积不超过10平方毫米的沉孔，所述沉孔与所述出液端相连通，所述微孔膜与所述沉孔的周边底部贴合溶液穿越盖在所述沉孔上的微孔膜，流出所述第一反应区。

本发明的另一个目的是提供一种微孔膜截留的微流体芯片溶液流路控制的方法。

一种微孔膜截留的微流体芯片溶液流路控制的方法，应用微流体芯片，并使其受到驱使外力，所述第一溶液自所述第一样品区沿着所述连通流路，透过第一容置空间过滤后，进入第一控制区时溶液被放行通过，并流向第二样品区进行反应；第二溶液自所述第二样品区却被第一控制区阻止通过，第一溶液在第二反应区反应后被第二控制区阻流；微流体芯片受到第二次驱使外力时，而第二溶液自所述第二样品区被第一控制区放行通过，流入到所述第二反应区后，带着所述第二样品区内的液体流入到第一反应区，并通过第一出液端流到所述废液池；微流体芯片受到第三次驱使外力时，第三溶液自第三样品区通过第三控制区，流入到第一反应区。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片溶液流路控制的方法的一种优选方案，其中：所述第一控制区、所述第二控制区和所述第三控制区内设有水化膜，所述水化膜为遇水后逐渐溶解的膜状物质；所述第一容置空间内设有过微孔滤膜；所述第一溶液自所述第一样品区被驱动流入所述第一控制区，将较大的颗粒物质被第一容置空间内的微孔滤膜截留过滤后的溶液沿着所述连通流路流过第二反应区内反应，并溶解第一控制区、所述第二控制区内的水化膜，第一控制区中的水化膜溶解后，所述第二溶液自所述第二样品区被驱动才能流入所述第一控制区并冲洗第二反应区，第二溶液带着冲洗第二反应区后的溶液流入到第一反应区，并溶解所述第三控制区处的水化膜，第三控制区处的水化膜溶解后，第三溶液自第三样品区流入到第一反应区。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片溶液流路控制的方法的一种优选方案，其中：第一反应区中的微孔膜的孔径均匀且大于20nm，在微流体芯片中设置了至少一种直径基本均匀且大于截留微孔膜孔径的包被微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及直径小于截留微孔膜孔径的标记试剂；捕获试剂及标记试剂中分别具有互为直接或间接配位体关系的物质。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片溶液流路控制的方法的一种优选方案，其中：所述标记信号来源于荧光物质或肉眼直接可见的颜色微粒；其中，颜色微粒包括纳米胶体金、纳米胶体银、纳米胶体硒、乳胶微球、炭黑微粒、带颜色信号的纳米颗粒；其中，荧光物质包括荧光分子、荧光蛋白、量子点粒子或微球、上转换发光粒子或微球、时间分辨荧光物质、包含时间分辨荧光物质的微球。

作为本发明所述微孔膜截留的微流体芯片溶液流路控制的方法的一种优选方案，其中：还包括，对微孔膜表面截留的反应复合物中标记试剂的光谱信号进行光学探测的检测设备；微孔膜受到特定波长的光线照射，集聚在微球表面标记试剂的荧光物质将被激发后发射出特定波长的荧光信号，荧光信号强度与集聚在微孔膜表面的反应复合物数量存在特定的对应关系。

本发明的有益效果：本发明减少了实验中试剂的反应时间，通过微流通道减少了样本的使用量，降低了使用成本，操作改进了实验者隔一段时间滴加试剂的方式，无需操作者一直守在实验仪器旁观测等待，减少了人工成本，操作更为一体化、人性化，最后采集时通过荧光检测，方便快捷。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明提供的微孔膜截留的微流体芯片的第一个实施例的整体结构的示意图；

图2为本发明提供的微孔膜截留的微流体芯片的第一个实施例的沿着图1中箭头剖视的剖视图及局部放大示意图；

图3为本发明提供的微孔膜截留的微流体芯片的第一个实施例中的整体结构的左视图；

图4为本发明提供的微孔膜截留的微流体芯片的第二个实施例中的整体结构示意图；

图5为本发明提供的微孔膜截留的微流体芯片的第三、四个实施例中的整体结构示意图；

图6为本发明提供的微孔膜截留的微流体芯片的第五个实施例中的整体结构示意图；

图7为本发明提供的微孔膜截留的微流体芯片的第五个实施例中的整体结构另一个示意图；

图8为本发明提供的微孔膜截留的微流体芯片的第五个实施例中的整体联盘式的微流体芯片的示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

参照图1～图3，为本发明微孔膜截留的微流体芯片的第一个实施例，该实施例的主体包括第一样品区100、连通流路300和第一反应区200，在本实施例中，芯片区分为第一层面m和第二层面n，第一样品区100是自第一层面m向所述第二层面n凹陷形成容置空间，里面存储放置第一溶液，通过第一溶液通过连通流路300自第一样品区100流入第一反应区200。

具体的，连通流路300连通芯片上各个区间之间的流路，第一反应区200自第一层面m向第二层面n凹陷形成容置空间，通过连通流路300与第一样品区100相连接，第一反应区200包括第一出液端202和第一进液端203，第一反应区200为一个两极级沉槽(第一级槽204a是第二级槽204b的上边缘倒角，便于将渗滤微孔膜贴合到反映区的底部平面)，这里所述的两级沉槽区分为第一级槽204a、第二级槽204b和第三级槽204c，且第一级槽204a的槽径大于第二级槽204b的槽径大于第三级槽204c的槽径。第一级槽204a、第二级槽204b和第三级槽204c的形状可以是圆柱状，可以是四棱柱状，优选的，第三级槽204c末端为圆锥状(即，倒漏斗状)。第一出液端202置于第一反应区200的中心底部(即圆锥状的第三级槽204c的尖端的顶部)。第一进液端203设于第一反应区200的边缘区域，这里所说的边缘区域为第一反应区200第二级槽204b的外边缘的区域，与第二级槽204b的边缘区域相连接后，连通第一反应区200，为了第一进液端203进入第一反应区200的溶液更加均匀地从第一出液端202流出，第一进液端203将在反应区的外边缘至少2个角度对称的位置设立。

较佳的，第一反应区200内设有微孔膜，微孔膜安置紧贴于第一反应区200的底部，且分隔第一出液端202与第一反应区200。

较佳的，微孔膜与沉槽的周边底部紧贴，扩大了微孔膜的截流面积，溶液穿越沉槽的微孔膜，流入第一反应区200。

需要说明的是，这里所指的“扩大了微孔膜的截流面积”，是将微孔膜放置在第二级槽204b与第三级槽204c的交界处，这样拦截的面积大于直接将微孔膜置于第一出液端202处的面积，从而“扩大了微孔膜的截流面积”。

作为较佳的实施例，微孔膜为一种过滤膜。当第一溶液自第一进液端203注入第一反应区200内，微孔膜将截留微球直径超过微孔膜孔径的包被微球及其免疫反应复合物，由于标记信号物质的直径小于微孔膜孔径，它可通过第一出液端202流出第一反应区200。例如，当溶液从第一进液端203流入第一反应区200时，超过一定直径的包被微球不能穿越微孔膜，小于该设定直径的标记信号物质如量子点微粒能穿越微孔膜，并从第一出液端202流出，继而流出第一反应区200。

较佳的，微孔膜的孔径均匀，在第一反应区200中至少存在一种直径均匀且大于微孔膜孔径的包被微球，微球表面标记了hcg单抗a且能溶解在水溶液中；所述第一反应区200中还添加了被约40nm的胶体金标记的hcg单抗b具体操作步骤为：待检测的含有hcg蛋白的孕妇尿液进入第一反应区200，表面包被固定了hcg单抗a的包被微球、胶体金标记的hcg单抗b同时混合溶解在第一反应区200，通过将微流控芯片进行旋转，能对反映区的溶液施加一定离心力让溶液从该溶液第一出液端202且只从微孔膜穿越流出时，表面包被固定了hcg单抗a的包被微球及其免疫反应复合物微球被截留在微孔膜表面，游离的胶体金标记的hcg单抗b穿越微孔膜流出；水溶液流出后，洗涤溶液被加入溶液反应区对在微孔膜表面的的包被微球及hcg免疫复合物微球进行持续洗涤，洗涤溶液从微孔膜穿越流出，微球继续集聚在微孔膜表面作为反应信号检测区域，随后被肉眼或仪器对反应信号进行判读。

需要说明的是，标记信号来源于荧光物质或肉眼直接可见的颜色微粒，其中，颜色微粒包括纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、其他带颜色信号的纳米颗粒；荧光物质包括荧光分子、荧光蛋白、量子点粒子或微球、上转换发光粒子或微球、时间分辨荧光物质、包含时间分辨荧光物质的微球。

优选的，微孔膜通过第一反应区200底部涂布的胶粘剂固定，防止微球从微孔膜与第一反应区200涂布胶的底部之间的间隙中穿越，这里所用的胶，可以是不干胶，可以是固化胶。

第一溶液自第一样品区100通过第一进液端203进入到第一反应区200，因为第一反应区200内设有微孔膜，可以将有效物质保留在过滤的微孔膜上，通过光谱检测采集得到数据的，多余的液体和气体会通过第一出液端202流出。

需要注意的是，在本实施中，连通流路300包括上下联络通道310，上下联络通道310贯穿第一层面m和第二层面n，且第一层面m和第二层面n上下互通。第一反应区200处的第一出液端202和第一进液端203均属于上下互通流道。

较佳的，该实施例中，还包括废液池900，废液池900自第二层面n向第一层面m贯穿形成的容置空间，与第一反应区200相连通，收纳第一反应区200自第一出液端202冲洗出的液体。

参照图4，为本发明微孔膜截留的微流体芯片第二个实施例，该实施例不同于第一个实施例的是，该实施例中，芯片的主体还包括第一控制区400，第一控制区400调控第二溶液进入第二样品区500的时间，设于连接第二样品区500与第一反应区200的支路上，与第一样品区100与第一反应区200之间的流路交汇处。

较佳的，第一样品区100的下方设有第一容置空间k，第一容置空间k自任一层面向另一层面凹陷，第一容置空间k可通过上下联络通道310与连通流路300相连通，过滤第一样品区100中的杂质。

需要说明的是，在本实施例中，第一控制区400内设有水化膜，水化膜为遇水后逐渐溶解的膜状物质，且水化膜设于第二层面n向第一层面m凹陷的一侧；第一容置空间k内设有过滤膜，这里使用的过滤膜为微孔膜的一种，用于过滤掉一些没必要的杂质，且所述过滤膜设于第一层面m向第二层面n凹陷的一侧。

第一溶液在某个作用力下，自第一样品区100流入第一容置空间k，第一溶液将第一容置空间k先对第一溶液进行过滤，过滤之后的溶液沿着连通流路300流入第一反应区200。

较佳的，在本实施例中，第一反应区200还包括第一排气端201，第一排气端201设于第一反应区200朝向芯片旋转离心中心点的顶部(当将芯片放置到离心盘架上旋转时，有一个离心中心点，第一反应区200与离心中心点最近的距离为第一排气端201)。第一溶液在离心力下，通过第一进液端203被甩到第一反应区200中，气体从第一排气端201排出，液体通过第一出液端202排出。在本实施例中，设置第一排气端201的意义是，保证微流体芯片内的气压，使得溶液在离心力的作用力能够往下运动。

较佳的，第一反应区200中心设有面积不超过10平方毫米的沉孔，沉孔与出液端202相连通，所述微孔膜与沉孔的周边底部贴合溶液穿越盖在沉孔上的微孔膜，流出第一反应区200。

参照图5，为本发明微孔膜截留的微流体芯片第三个实施例，该实施例不同于第二个实施例的是，该实施例中，芯片的主体还包括第二样品区500，第二样品区500自第二层面n向第一层面m凹陷形成容置空间，里面存储放置第二溶液。

具体的，在本实施例中，第二样品区500是自第二层面n向第一层面m凹陷形成容置空间，里面存储放置第二溶液。

较佳的，连通流路300包括第一联络通道330和第二联络通道320，第一联络通道330为第一样品区100到第一反应区200的流路(同时也包括自第一反应区200到出气口o的流路)，第二联络通道320为第二样品区500到第一控制区400的流路。第一控制区400为第一溶液与所述第二溶液的交汇处，设于连接第二样品区500所述第一反应区200的支路上，且在第一样品区100与第一反应区200的支路上，为第一溶液与所述第二溶液的交汇处。

当芯片受到某一作用力后，此种作用力优选为离心力，第二溶液自第二样品区500甩到第一控制区400位置，此时第一溶液还未自第一样品区100甩到第一控制区400位置时，第一控制区400相对于第二溶液是不相连通的，因为第一控制区400中设有的水化膜没有溶解，第二溶液无法通过上下联络通道310；当第一溶液自第一样品区100通过第一联络通道330达到第一控制区400后，第一容置空间k内的水化膜润湿并逐渐溶解，第二样品区500中的第二溶液方可通过第一控制区400，继而第二溶液与第一溶液混合，一起流入第一反应区200。第一溶液和第二溶液的混合液再通过第一排气端201将气体从出气口o处排出，多余的液体会通过第一出液端202冲出。

刚开始时，第一反应区200内充满了空气，当溶液流入时要求能稳定可靠地将空气从第一排气端201驱赶出去。

参照图5，为本发明微孔膜截留的微流体芯片第四个实施例，该实施例不同于第三个实施例的是：该实施例中还包括第二反应区600。

具体的，第二反应区600置于第一控制区400的下游，在本实施例中，第二反应区600的内部设有溶质组分，包括第二进液端601和第二出液端602，溶液自第二进液端601充满第二反应区600，并从第二出液端602排出液体。

较佳的，第二反应区600包括第二排气端603，第二排气端603设置于第一溶液与第二溶液混合液流入第二反应区600充满且最后到达的位置(即位第二反应区600的最顶端的位置)。

较佳的，第二出液端602处设置有第二控制区800，能够调控第二反应区600的溶液流出的时间。

优选的，第二控制区800处设有水化膜，且所述水化膜设置的位置为自第二层面n向第一层面m凹陷的一侧处。因为第二控制区800处设置的水化膜的位置，因此通过控制水化膜溶解的时间，控制第二反应区600的溶液流出的时间。

较佳的，第一样品区100的体积略大于或者略小于第二反应区600的体积，是为保证第一样品区100中的第一溶液除了能装满第二反应区600，并与其反应外，还需要留有一些体积的第一溶液留置于第一控制区400，润湿并溶解第一控制区400内的水化膜，打开第一控制区400，使得第二溶液进入。

芯片在进行第一次离心运动时，此时第一溶液自第一样品区100甩到第二反应区600，并第一控制区400位置留有部分第一溶液溶解第一控制区400内的水化膜，使得第二溶液进入，剩余的离心到第二反应区600，并与第二反应区600中的溶质组分发生反应。进行第二次离心运动时，第一控制区400内的水化膜已溶解，第二溶液通过第一控制区400向第一反应区200流动时，通过第二进液端601甩到第二反应区600，并通过第二出液端602将冲洗后的第二反应区600内的液体一起流入第一反应区200。

参照图6，为本发明微孔膜截留的微流体芯片的第五个实施例，该实施例不同于第四个实施例的是，该实施例的主体还包括第三样品区700和第三控制区810，自所述任一层面向所述另一层面凹陷形成容置空间，里面存储放置第三溶液，第三控制区810设于第二反应区600的下游，第一反应区200的上游，连通第二反应区600、第三样品区700和第一反应区200。

具体的，为适应上述实施例中的例子，在本实施例中，第三样品区700自第二层面n向第一层面m凹陷形成容置空间为例，做具体说明。其里面存储放置第三溶液，第三溶液可以为冲洗液，例如，水。举出的例子仅为示意，更为清楚的表述，但不仅限于此溶液的成分。第三控制区810设于第二反应区600的下游，第一反应区200的上游，连通第二反应区600、第三样品区700和第一反应区200，为第一溶液、第二溶液和第三溶液的交汇区。第三溶液自第三样品区700，通过第三控制区810抵至第一反应区200。

当第一反应区200中充满溶液时，第三控制区810持续浸润于第三溶液中，延时一段时间。芯片在进行第一次离心运动时，此时第一溶液自第一样品区100甩到第二反应区600，并在第一控制区400位置留有部分第一溶液打开第一控制区400(即溶解第一控制区400内的水化膜)，并在离心力的作用下，第一溶液甩进第二反应区600，并与第二反应区600中的溶质组分发生反应，在本次离心运动中，第二溶液被阻隔在第一控制区400内，不能向下运动。进行第二次离心运动时，第一控制区400内的水化膜逐渐溶解，使得第二溶液进入到第一控制区400内，并在离心力的作用下，第二溶液通过第二进液端601甩到第二反应区600，此时第二控制区800内的水化膜也逐渐溶解，第二溶液带着冲洗第二反应区600后的溶液通过第二出液端602流入第一反应区200。当芯片经过第三次离心运动时，第一溶液与第二溶液的混合液到达第三控制区810，加快了打开第三控制区810的时间，第三溶液自带着第一溶液以及第二溶液，通过第三控制区810流入至第一反应区200，将所有废气溶液一并冲洗到废液池900。

较佳的，第一控制区400、第二控制区800和第三控制区810为两个层面均向内凹陷的形成的容置区域，即第一层面m向第二层面n凹陷的同时第二层面n也向第一层面m凹陷，直至中间形成一个很薄的挡板位置。

较佳的，第一控制区400、第二控制区800和第三控制区810中放置水化膜，且水化膜设于第二层面n向第一层面m凹陷的一侧，当将溶解的水化膜的溶液滴加在微孔膜上，并干燥处理后，微孔膜能有封堵的作用。需要说明的是，微孔膜为一种微孔亲水膜，举出的例子仅为示意，包含的内容并不仅仅为举例说明的物质。

较佳的，在本实施中，混合溶液在离心作用下甩到第一反应区200内，在第一反应区200被排放至废液池900中时，因为液体的体积比较大，所以溶液除了会从第一出液端202排放外，也可能会从第一排气端201往外流。为了防止溶液从第一排气端201将液体排放流出，在第一联络通道330的出气口o和第一排气端201之间设有防流区1100。

需要说明的是，防流区1100内设有微孔膜，此处的微孔膜防止液体，混合溶液若自第一排气端201往出气口o流的时候，在防流区1100内的微孔膜处混合溶液被堵在微孔膜的外面，气体能自由通过第一排气端201。使得混合溶液无法通过防流区1100，因此混合溶液无法从出气口o流出，混合溶液只能从第一出液端202流入到废液池900。

参照图7和图8，较佳的，还包括溢流区1000，第二反应区600的第二排气端603相邻位置设置了溢流通道1001，样品溶液流入第二反应区600超过第二反应区600的容积后，多余的溶液通过溢流通道1001，流向溢液区1000。

较佳的，流向溢液区1000与出气口o相连通。

参照图8，在本发明中，样品区并不仅限于列出来的第一样品区100、第二样品区500和第三样品区700，若芯片够大或者样品区够小，样品区可以为若干个，各个第一样品区100、第二样品区500和第三样品区700在样品区两两之间首尾相连，相对于中心提供的离心力方向形成峰部和谷部，溶液自首个样品区滴加，一次流入到相邻的样品区内。

本发明还提供了一种微孔膜截留的微流体芯片溶液流路控制的方法，在微流体芯片中，微流体芯片的主体包括第一样品区100、第一反应区200、连通流路300、第一控制区400、第二样品区500、第二反应区600、第三样品区700、第三控制区810、废液池900、溢流区1000和防流区1100。

第一样品区100内放置第一溶液，第二样品区500内放置第二溶液，第三样品区700内放置第三溶液，较佳的，给予芯片的力为一个离心力，那么在芯片中的第一溶液沿着第一联络通道330自第一样品区100流入到第一容置空间k内过滤后，通过第一控制区400、第二进液端601进入到第二反应区600，与第二反应区600中的容质进行充分反应。此时，第二溶液自第二样品区500流入到第一控制区400，但是在第一容置空间k内放置水化膜，所述水化膜是遇水逐渐溶解的化学组分膜。也就是说，当第一溶液流入到第一控制区400内，但未将第一控制区400内的水化膜溶解时，第二溶液被留置在第一控制区400内，无法通过第一控制区400。与此同时，第一溶液在第二反应区600与第二反应区600内的溶质充分反应的同时，被第二控制区800中的水化膜阻流。

在微流体芯片在进行二次离心时(此时的第一溶液已将第一控制区400内的水化膜溶解)，因为在本发明的方法中，第一溶液的体积是经过计算而确定的，作为最优的实施方案中，第一溶液的体积略大于或者略小于第二反应区600的体积，并且第一溶液在流过第二反应区600之前，会残留一些溶液于第一控制区400内溶解水化膜。在经过第一次离心后，第一样品区100中的第一溶液全部被甩出，所以在进行二次离心时，第一溶液的溶液只会从第二反应区600继续往下流，而此时第二溶液因为水化膜溶解，自第一控制区400，并沿着第一联络通道330流入到第二反应区600，由于离心力，第二溶液会带着冲洗第二反应区600后的混合液会顺着第一联络通道330经过第二控制区800，通过第一进液端203流向第一反应区200，气体从第一排气端201到出气口o排出，若液体的容量较大或者离心力较大，第一溶液和第二溶液的混合液会从第一出液端202流入到废液池900内。与此同时，第三溶液仍被第三控制区810阻隔。

需要说明的是，第三控制区810内设有水化膜，且溶解时间比较长，若第一溶液和第二溶液的混合液经过此处，会缩短水化膜的溶解时间。

第三次离心微流体芯片时(第三控制区810内的水化膜溶解的状态下)，第三溶液自所述第三样品区700通过第三控制区810，流至废液池900。

较佳的，第三溶液自第一进液端203进入到第一反应区200，将第一反应区200中的第一溶液和第二溶液冲洗后，自第一出液端202流出。

较佳的，第一反应区200为一个两极级沉槽(第一级槽204a是第二级槽204b的上边缘倒角，便于将渗滤微孔膜贴合到反映区的底部平面)，这里所述的两级沉槽区分为第一级槽204a、第二级槽204b和第三级槽204c，且第一级槽204a的槽径大于第二级槽204b的槽径大于第三级槽204c的槽径。第一级槽204a、第二级槽204b和第三级槽204c的形状可以是圆柱状，可以是四棱柱状，优选的，第三级槽204c末端为圆锥状(即，倒漏斗状)。第一出液端202置于第一反应区200的中心底部(即圆锥状的第三级槽204c的尖端的顶部)。第一进液端203设于第一反应区200的边缘区域，这里所说的边缘区域为第一反应区200第二级槽204b的外边缘的区域，与第二级槽204b的边缘区域相连接后，连通第一反应区200，为了第一进液端203进入第一反应区200的溶液更加均匀地从第一出液端202流出，第一进液端203将在反应区的外边缘至少2个角度对称的位置设立。

在第一反应区200内设有微孔膜，在本实施例中，微孔膜安置紧贴于第一反应区200的底部(设置于其底部只是其中一个实施方式，放置微孔膜的位置不仅限于底部)，且分隔第一出液端202与第一反应区200。微孔膜与沉槽的周边底部紧贴，扩大了微孔膜的截流面积，溶液穿越沉槽的微孔膜，流入第一反应区200。

应当说明的是，这里所指的“扩大了微孔膜的截流面积”，是将微孔膜放置在第二级槽204b与第三级槽204c的交界处，这样拦截的面积大于直接将微孔膜置于第一出液端202处的面积，从而“扩大了微孔膜的截流面积”。

当第一溶液自第一进液端203注入第一反应区200内，微孔膜筛选通过的微球，有且仅有微球的直径小于直径设定值，才可通过第一出液端202流出第一反应区200。例如，当溶液从第一进液端203流入第一反应区200时，超过一定直径的微球不能穿越微孔膜，小于该设定直径的微球能穿越微孔膜，并从第一出液端202流出，继而流出第一反应区200。

优选的，微孔膜通过第一反应区200底部涂布的胶固定，防止微球从微孔膜与第一反应区200涂布胶的底部之间的间隙中穿越，这里所用的胶，可以是不干胶，可以是固体胶。

较佳的，混合溶液在离心作用下甩到第一反应区200内，在第一反应区200被排放至废液池900中时，因为液体的体积比较大，所以溶液除了会从第一出液端202排放外，也可能会从第一排气端201往外流。为了防止溶液从第一排气端201将液体排放流出，在第一联络通道330的出气口o和第一排气端201之间设有防流区1100。防流区1100内设有微孔膜，此处的微孔膜防止液体，混合溶液若自第一排气端201往出气口o流的时候，在防流区1100内的微孔膜处混合溶液被堵在微孔膜的外面，使得混合溶液无法通过防流区1100，因此混合溶液无法从出气口o流出，混合溶液只能从第一出液端202流入到废液池900。

优选的，第二反应区600的第二排气端603相邻位置设置了溢流通道1001，样品溶液流入第二反应区600超过第二反应区600的容积后，多余的溶液通过溢流通道1001，流向溢液区1000，并且流向溢液区1000与出气口o相连通。

优选的，第一反应区200中的微孔膜的孔径均匀且大于20nm，在微流体芯片中设置了至少一种直径基本均匀且大于截留微孔膜孔径的包被微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及直径小于截留微孔膜孔径的标记试剂；捕获试剂及标记试剂中分别具有互为直接或间接配位体关系的物质。

所述标记信号，来源于荧光物质或肉眼直接可见的颜色微粒；其中，颜色微粒包括纳米胶体金、纳米胶体银、纳米胶体硒、乳胶微球、炭黑微粒、带颜色信号的纳米颗粒；荧光物质包括荧光分子、荧光蛋白、量子点粒子或微球、上转换发光粒子或微球、时间分辨荧光物质、包含时间分辨荧光物质的微球。

在竞争免疫反应中，捕获试剂可以是包被在微球上的竞争抗原如偶联了载体蛋白的小分子抗原，标记试剂则是标记了荧光或其他光谱信号的待测物质的抗体；当溶液中的游离抗原在溶液中与全部标记试剂反应后，则捕获试剂将不再有免疫反应复物，因此被截留在微孔膜表面的将是游离的包被微球；当溶液中的游离抗原在溶液中与部分标记试剂反应后，捕获试剂将产生部分的免疫反应复合物，因此被截留在微孔膜表面的将是游离的包被微球及部分带有免疫反应复合物的微球。

将克伦特罗竞争抗原蛋白包被在直径大于800nm的ps微球上，把它固化在样品垫上；将克伦特罗单抗标记了直径小于300nm的荧光粒子，把它固化在试剂结合垫中；当将样品溶液添加在样品垫上时，样品溶液先与包被了克伦特罗竞争抗原蛋白的包被微球混合反应，然后溶液侧向流动穿越孔径均匀且为450nm的样品前处理膜，逐步将试剂结合垫上的标记了克伦特罗单抗的荧光粒子溶解并混合流向前方，经过一定长度层析膜的混合反应，溶液中的游离克伦特罗在溶液中如果与全部标记试剂反应后，则包被微球的捕获试剂将不再有免疫反应复物，因此被截留在微孔膜表面的将是游离的ps微球；当溶液中的游离克伦特罗在溶液中与部分标记试剂反应后，捕获试剂将产生部分的免疫反应复合物，因此被截留在微孔膜表面的将是游离的包被微球及部分带有克伦特罗免疫反应复合物的ps微球。

在免疫夹心法反应中，捕获试剂可以是包被在ps微球上的抗体a，标记试剂则是标记了荧光或其他光谱信号的的抗体b；当溶液中的抗原在溶液中同时被抗体a及抗体b捕获后，截留在微孔膜表面的将是游离的ps微球及带有免疫反应复合物的ps微球。将hcg单抗a包被在直径大于800nm的ps微球上，把它固化在样品垫上；将hcg单抗b标记了直径小于300nm的荧光粒子，把它固化在试剂结合垫中；当将样品溶液添加在样品垫上时，样品溶液先将包被了hcg单抗a的ps微球溶解混合，然后溶液侧向流动穿越孔径均匀且为450nm的样品前处理膜，逐步将试剂结合垫上的标记了hcg单抗b的荧光粒子溶解并混合流向前方，经过层析膜的混合反应，当溶液中的hcg蛋白在溶液中同时被抗体a及抗体b捕获形成免疫反应复合物后，截留在微孔膜表面的将是游离的包被微球及带有免疫反应复合物的微球。

在申请中，包括对微孔膜表面截留的免疫反应复合物中标记试剂的光谱信号到特定波长的光线照射，反应复合物中的至少两种荧光标记物质被激发后发射出不同波长的荧光信号被荧光光谱仪接收后通过微型处理器解析出对应波峰的荧光来检测不同的微球反应复合物，计算得到不同待检测物的浓度。

较佳的，在本实施例中对提出的标记信号的概念通过具体的免疫检测实施例来补充说明——黄曲霉毒素m1的竞争法检测，具体采用的步骤为：

1、制备包被微球和荧光微球标记的抗体抗原：包被微球是黄曲霉毒素m1偶联抗原(afm1-bsa)的500nm聚苯乙烯(ps)微球，荧光信号来源于偶联afm1鼠单克隆抗体的400nm荧光ps微球；

1)、afm1-bsa偶联包被的ps微球：

a、取1ml10mmnah2po4溶液，加入1.5ml离心管中。

b、取100ul10％ps微球溶液，加入同一离心管中。

c、将离心管置于振荡器上约1min，振匀。

d、将离心管放入低温高速离心机中，14000r，4℃，离心30min。

e、将上清液弃去，再加入1ml10mmnah2po4溶液至离心管中。

f、将离心管置于振荡器上约1min，振匀。

g、将离心管放入低温高速离心机中，14000r，4℃，再次离心30min。。

h、将上清液弃去，再加入1ml10mmnah2po4溶液至离心管中。

i、将离心管放入探针式超声仪中，共超声15分钟，得洗涤后的乳胶溶液。

j、于精密电子天平称取1mg以上的edc粉末，再按照称取所得重量加入10mmnah2po4溶液，得到10mg/ml的edc溶液。例：称得粉末2.32mg，加入溶液为2.32*1000/10＝232ul。

k、吸取70ul的10mg/ml的edc溶液，加入洗涤后的乳胶溶液中。

l、吸取相当于400ug的标记蛋白溶液，加入洗涤后的乳胶溶液中。

m、将离心管置于摇床上，振摇过夜。

n、将离心管放入低温高速离心机中，14000r，4℃，离心30min。

o、将上清液弃去，加入1ml乳胶标记复溶液。

p、将离心管放入探针式超声仪中，共超声15分钟，即得所需的乳胶标记溶液。

2)、amf1鼠单抗偶联荧光标记微球

a、分别取990ul50mmcbs，加入2ml离心管中。

b、取10ul400nm荧光标记微球，振荡混匀。

c、取相应计算量的蛋白抗体进行稀释至1mg/ml，溶剂为双蒸水。

d、取1mg/ml50ul蛋白抗体分别添加至a溶液中，振荡混匀。

e、在40℃培养摇床中反应50min。

f、向e中继续加入20％bsa20ul振荡混匀。

g、在40℃培养摇床中反应50min。

h、低温高速离心机中4℃，12000rpm离心30min，去除上清液。

i、向h中加入100ul复溶液复溶于水浴超声5min。

j、紫外灯下观察分布均匀。

3)、在微孔膜截留的离心微流控芯片上包被试剂：

在芯片的第一反应区200滴加并固化一定量的afm1-bsa包被微球，在第二反应区600滴加或固化一定量的afm1单抗标记荧光微球，然后在第一样品区100添加12ul待测样品溶液，通过离心微流控芯片的旋转离心，待测样品溶液被驱使流到了第二反应区600溶解固化的afm1-bsa包被微球，具体的液体流动方法参照本实施例中关于液体流动的控制部分。

需要说明的是，免疫学检测中具有竞争法和夹心法两种方式，一般情况下，竞争法一般针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，夹心法又叫双抗夹心法，用于检测较大分子的抗原或抗体。

较佳的，在本实施例中对提出的标记信号的概念通过具体的免疫检测实施例来补充说明——乙肝表面抗原的夹心法检测，具体采用的步骤为：

1、制备包被微球和荧光微球标记的抗体抗原：包被微球是偶联乙肝表面抗原包被单抗的500nmps微球，荧光信号来源于偶联乙肝表面抗原标记抗体的400nm荧光ps微球；

1)、乙肝表面抗原包被单抗偶联ps微球：

a、取1ml10mmnah2po4溶液，加入1.5ml离心管中。

b、取100ul10％ps微球溶液，加入同一离心管中。

c、将离心管置于振荡器上约1min，振匀。

d、将离心管放入低温高速离心机中，14000r，4℃，离心30min。

e、将上清液弃去，再加入1ml10mmnah2po4溶液至离心管中。

f、将离心管置于振荡器上约1min，振匀。

g、将离心管放入低温高速离心机中，14000r，4℃，再次离心30min。。

h、将上清液弃去，再加入1ml10mmnah2po4溶液至离心管中。

i、将离心管放入探针式超声仪中，共超声15分钟，得洗涤后的乳胶溶液。

j、于精密电子天平称取1mg以上的edc粉末，再按照称取所得重量加入10mmnah2po4溶液，得到10mg/ml的edc溶液。例：称得粉末2.32mg，加入溶液为2.32*1000/10＝232ul。

k、吸取70ul的10mg/ml的edc溶液，加入洗涤后的乳胶溶液中。

l、吸取相当于400ug的标记蛋白溶液，加入洗涤后的乳胶溶液中。

m、将离心管置于摇床上，振摇过夜。

n、将离心管放入低温高速离心机中，14000r，4℃，离心30min。

o、将上清液弃去，加入1ml乳胶标记复溶液。

p、将离心管放入探针式超声仪中，共超声15分钟，即得所需的乳胶标记溶液。

2)、乙肝表面抗原标记单抗偶联荧光微球

a、分别取990ul50mmcbs，加入2ml离心管中。

b、取10ul400nm荧光标记微球，振荡混匀。

c、取相应计算量的蛋白抗体进行稀释至1mg/ml，溶剂为双蒸水。

d、取1mg/ml50ul蛋白抗体分别添加至a溶液中，振荡混匀。

e、在40℃培养摇床中反应50min。

f、向e中继续加入20％bsa20ul振荡混匀。

g、在40℃培养摇床中反应50min。

h、低温高速离心机中4℃，12000rpm离心30min，去除上清液。

i、向h中加入100ul复溶液复溶于水浴超声5min。

j、紫外灯下观察分布均匀。

3)、在微孔膜截留的离心微流控芯片上包被试剂：在芯片的第一反应区200滴加并固化一定量的乙肝表面抗原包被微球和一定量的乙肝表面抗原标记单抗的荧光微球。

4)、在微孔膜截留离心微流控芯片上添加待测样品溶液进行分析：

在第一样品区100添加12ul待测样品溶液，在第二样品区500添加60ul洗涤溶液；通过离心微流控芯片的首次旋转离心，待测样品溶液被驱使流经第一控制区400后到了第一反应区200，溶解固化的乙肝表面抗原的包被微球及标记荧光微球并进行免疫学孵育反应10分钟，同时第一控制区400内的水化膜被溶液逐步溶解；

当离心微流控芯片第二次旋转离心时，在第二样品区500的洗涤溶液通过水化膜溶解后的第一控制区400后进入第一反应区200，推动待测溶液穿过微孔膜进入废液池，而直径大于微孔膜孔径的微球及其免疫复合物则被截留在微孔膜通向第一出液端202的表层。

5)、对离心微流控芯片微孔膜截留的微球进行荧光分析：将离心微流控芯片中截留了微球的微孔膜放在荧光分析仪的荧光光束下，在光束照射到微孔膜的微球时，微孔膜表面截留的免疫反应复合物中的荧光标记物质被激发后发射出荧光信号被荧光分析仪接收后通过微型处理器解析出对应波峰的荧光来检测不同的微球反应复合物，计算得到不同待检测物的浓度。

应当说明的是，在采用竞争法时，需要启动本发明微流体芯片的第二反应区600，将包被标记两个试剂分别添加并固化在第一反应区200和第二反应区600中。

与之不同的是，采用夹心法就不需要使用到第二反应区600，只要将包被标记两个试剂一起添加固化在第一反应区200即可。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。