纳米硒在制备DNA免疫吸附剂中的应用的制作方法

本发明属于血液净化领域，特别涉及纳米硒在制备dna免疫吸附剂中的应用。

背景技术：

系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，sle)是一种多系统损害的慢性自身性免疫性疾病，确切病因不明，常引起多器官系统的不可逆性损害，可累及皮肤、浆膜、关节、肾及中枢神经系统等，病理表现为自身抗体及免疫复合物沉积，影响患者的寿命和生活质量。sle的患病率因人群而异，我国患病以女性多见，尤其是育龄女性。患者血浆中出现以抗核抗体(ana)、抗双链dna抗体(抗dsdna抗体)为代表的多种抗体，其中抗dsdna抗体是参与sle发病的主要抗体，其特异性可达90％，是sle特异性抗体。

早期清除患者血浆中的自身抗体、控制疫病活动、保护肾功能是治疗的关键。免疫吸附疗法是近年来发展起来的新型血液净化技术，它利用吸附材料除去血浆中的致病抗体(如抗dsdna抗体)，达到治疗疫病的目的。免疫吸附是通过抗原抗体免疫反应或物理化学作用除去致病因子，主要是血浆吸附，从而避免了离心式和一次膜血浆分离大量丢弃血浆的弊端。近年来，免疫吸附越来越多地应用于免疫性疾病的治疗。

其中，应用比较广泛的是dna免疫吸附，采用dna免疫吸附疗法可以特异性的吸附和清除抗dsdna抗体，从而对sle患者进行有效的治疗。欧洲专利ep0272792a1制备了基于活性炭或者碳化树脂的dna免疫吸附剂，他们以活性炭或者碳化树脂为载体，以小牛胸腺dna(下文简称dna)为配基，利用火棉胶包埋固载小牛胸腺dna。但是，无论是活性炭还是碳化树脂，均存在碳颗粒易脱落的问题，因而使用之前需要增加时间进行充分预冲至无微粒，从而避免治疗时微粒随血液循环进入人体而导致发生血栓、过敏、刺激等严重的不良反应。此外，dna采用火棉胶包埋方式固载还存在两个缺点：一是部分dna会由于包埋不充分，在后续生产过程中可能发生脱落，导致dna固载量下降；二是部分被包埋过深的dna又无法与抗体接触。因此，提供一种吸附性能好，安全性高的dna免疫吸附剂成为亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供纳米硒在制备dna免疫吸附剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种纳米硒负载dna的免疫吸附剂。

本发明的再一目的在于提供上述纳米硒负载dna的免疫吸附剂的制备方法及应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：纳米硒在制备dna免疫吸附剂中的应用，是基于本发明发明人发现纳米硒用于负载dna得到的dna免疫吸附剂，具有吸附性能好，且安全性能更佳的优点。

所述的纳米硒在制备dna免疫吸附剂中的应用，包括如下步骤：将纳米硒与dna混合，反应，得到dna免疫吸附剂。

所述的纳米硒是通过氧化还原法制备得到的纳米硒，优选为通过如下步骤制备得到：将无机硒和还原剂混合，反应，得到纳米硒。

所述的无机硒优选为亚硒酸、亚硒酸盐和二氧化硒中的一种或至少两种。

所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠(na2seo3)、亚硒酸钾(k2seo3)和亚硒酸锌(znseo3)中的一种或至少两种。

所述的还原剂优选为维生素c、硼氢化钠、巯基乙醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和五水硫代硫酸钠中的一种或至少两种。

所述的无机硒和所述的还原剂的用量按还原剂过量为宜，从而能将无机硒充分还原；更优选为按摩尔比1:3～10配比计算。

一种纳米硒负载dna的免疫吸附剂，是实现上述应用得到的，包括纳米硒和用于与抗dsdna抗体结合的dna，用于与抗dsdna抗体结合的dna负载在纳米硒上。

所述的用于与抗dsdna抗体结合的dna优选为双链dna。

所述的纳米硒是通过氧化还原法制备得到的纳米硒，优选为通过如下步骤制备得到：将无机硒和还原剂混合，反应，得到纳米硒。

所述的无机硒优选为亚硒酸、亚硒酸盐和二氧化硒中的一种或至少两种。

所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠(na2seo3)、亚硒酸钾(k2seo3)和亚硒酸锌(znseo3)中的一种或至少两种。

所述的还原剂优选为维生素c、硼氢化钠、巯基乙醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和五水硫代硫酸钠中的一种或至少两种。

所述的无机硒和所述的还原剂的用量按还原剂过量为宜，从而能将无机硒充分还原；更优选为按摩尔比1:3～10配比计算。

所述的反应的温度优选为0～10℃；更优选为3～5℃；最优选为4℃。

所述的混合的方式优选为：将无机硒溶液和还原剂溶液混合；更优选通过如下方式混合：将无机硒溶液滴加到还原剂溶液中，或是将还原剂溶液滴加到无机硒溶液中。

所述的无机硒溶液的浓度优选为5～15mm；更优选为10mm。

所述的还原剂溶液的浓度优选为30～50mm；更优选为40mm。

上述纳米硒负载dna的免疫吸附剂的制备方法，包括如下步骤：将用于与抗dsdna抗体结合的dna溶液和纳米硒溶液混合，反应，纯化，得到纳米硒负载dna的免疫吸附剂。

所述的用于与抗dsdna抗体结合的dna溶液的浓度优选为1～10mg/ml；更优选为1～5mg/ml。

所述的用于与抗dsdna抗体结合的dna溶液中的溶剂优选为ph值为7～9的缓冲液；更优选为ph值为7.2～8.2的缓冲液。

所述的缓冲液优选为tris-hcl缓冲液。

所述的tris-hcl缓冲液的浓度优选为0.01～0.1m；更优选为0.01～0.05m。

所述的纳米硒溶液的浓度优选为1～10mm；更优选为2～5mm。

所述的用于与抗dsdna抗体结合的dna和所述的纳米硒的用量优选为0.1-5mg:1μmol，更优选为0.5-2mg:1μmol。

所述的反应的温度优选为0～10℃；更优选为3～5℃；最优选为4℃。

所述的反应的时间为0.5～24h。

所述的纯化的方式优选为使用透析袋透析。

所述的透析袋的规格优选为6000～8000kda。

所述的透析的时间为12～48h。

上述纳米硒负载dna的免疫吸附剂在制备血液净化制剂中的应用。

上述纳米硒负载dna的免疫吸附剂在制备用于治疗抗dsdna抗体升高导致的疾病的药物中的应用。

所述的抗dsdna抗体升高导致的疾病优选为系统性红斑狼疮。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明提供的dna免疫吸附剂中的载体senps是一种能够补充人体硒元素，清除体内过剩活性氧自由基，且安全性高的有益物质。因此，本发明的免疫吸附剂无需预冲，节约资源，提高了免疫吸附剂使用的安全性。

2.本发明以senps作为载体，将dna修饰在其表面，制备得到的纳米硒负载dna的免疫吸附剂dna固载量达到了928μg/ml，吸附性能良好。

3.本发明提供的dna免疫吸附剂中，dna分子与抗dsdna抗体充分接触，最大限度发挥其特异性结合能力。

4.本发明提供的dna免疫吸附剂中的载体senps本身也对抗dsdna抗体具有一定的清除效果。

附图说明

图1是dna-senps吸附病人血浆中抗dsdna抗体前后的表征图；其中，图a是吸附前后的纳米粒径大小分布图，图b是吸附前后的电位图，图a和b中1～4分别为吸附61号、28号、70号和23号病例血浆后的dna-senps；图c是吸附前后的紫外光谱图，曲线1为dna-senps，曲线2～4分别为吸附19号、69号、109号病例血浆后的dna-senps；图d是吸附前后的红外光谱图，曲线1为dna-senps，曲线2～4分别为吸附14号、30号、34号病例血浆后的dna-senps。

图2是dna-senps吸附病人血浆中抗dsdna抗体前后的透射电子显微镜图；其中，图a是dna-senps的tem图，图b是吸附17号病例血浆后的dna-senps的tem，图c是吸附31号病例血浆后的dna-senps的tem图，图d是吸附58号病例血浆后的dna-senps的tem图。

图3是dna-senps吸附病人血浆中抗dsdna抗体前后的原子力显微镜和相应的厚度分析图；其中，图a是dna-senps的afm图(上)及相应的厚度分析图(下)，图b是吸附32号病例血浆后的dna-senps的afm图(上)及相应的厚度分析图(下)，图c是吸附33号病例血浆后的dna-senps的afm图(上)及相应的厚度分析图(下)。

图4是dna-senps吸附抗dsdna抗体的的结果图，其中，图a是dna-senps对128个病例的血浆中抗dsdna抗体的清除率统计图；图b是dna-senps对128个病例的血浆中抗dsdna抗体清除后血浆中抗dsdna抗体滴度的统计图；图c是dna-senps、市售产品1和市售产品2三种免疫吸附产品对同一病例病人血浆中抗dsdna抗体的清除率变化图；图d是dna-senps、市售产品1和市售产品2三种免疫吸附产品对同一病例病人血浆中抗dsdna抗体清除过程中的血浆中抗dsdna抗体滴度变化图。

图5是senps与dna-senps对3个病例的血浆中抗dsdna抗体的清除率统计图。

具体实施例

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1dna-senps纳米粒子的制备

4℃下，将1ml浓度为10mm的na2seo3溶液放入小烧杯中，再缓慢加入1ml浓度为40mm的维生素c(vc，阿拉丁公司)溶液，滴加完后加入1ml浓度为5mg/ml的dna(d4522，sigma公司)tris-hcl溶液(0.05m，ph＝7.2)，再用超纯水定容到5ml，4℃反应12h，用透析袋(6000～8000kda)在超纯水中透析24h，得到dna-senps纳米粒子。

senps的制备：4℃下，将1ml浓度为10mm的na2seo3溶液放入小烧杯中，再缓慢加入1ml浓度为40mm的维生素c，再用超纯水定容到5ml，4℃反应12h，用透析袋(6000～8000kda)在超纯水中透析24h，得到senps纳米粒子。

实施例2dna-senps吸附抗dsdna抗体前后的表征

分别将150μl实施例1制备的dna免疫吸附剂加入300μl血浆中(分别来源于128个sle病例)，室温混匀(20rpm，试管旋转混匀器，tzl-5010，苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)吸附2h。通过粒度和电位(马尔文粒度仪)、紫外分光光度计、红外分光光度计、透射电子显微镜(tem)以及原子力显微镜(afm)对吸附抗dsdna抗体前后的dna-senps进行表征，结果见图1-3。吸附前dna-senps的水合粒径大约为126nm，吸附4位病人血浆(由中山三院提供)后，将其离心(12000rpm，10min)，去上清，重悬，检测吸附后dna-senps的水合粒径分别增加到189nm(病例1：吸附前抗dsdna抗体的滴度为563)、254nm(病例2：吸附前抗dsdna抗体的滴度为353)、405nm(病例3：吸附前抗dsdna抗体的滴度为600)和259nm(病例4：吸附前抗dsdna抗体的滴度为336)(图1a)。但是，由于抗dsdna抗体和dna-senps的表面电位相近，吸附前后dna-senps的表面电位没有明显的变化(图1b)。吸附前后dna-senps的紫外可见和红外光谱相一致(图1c和d)。吸附前dna-senps的tem图像表现为单分散的、大小约为107nm的球状纳米粒子，且表面可以清晰地看见一层dna的修饰(图2a)。吸附病人血浆之后，dna-senps的大小基本没变，但是纳米粒子表面的dna层变厚了(图2b-d，分别对应病例17、病例31和病例58)。afm的结果显示吸附后dna-senps的高度明显的增加了(图3)。以上结果都说明抗dsdna抗体被吸附至纳米粒子表面。

实施例3dna-senps吸附抗dsdna抗体的性能评价

将实施例2中吸附后的血浆采用酶联免疫试剂盒(quantadsdnaelisa，708510，inovadiagnostics，awerfencompany，检测步骤按说明书操作)对抗dsdna抗体进行定量检测，最后用酶标仪在450nm和620nm处读取数值。样本数值＝(样本od450nm-样本od620nm)/(dsdnaelisa校准品od450nm-dsdnaelisa校准品od620nm)*375。样品中抗dsdna抗体清除率计算公式如下：抗dsdna抗体清除率＝(吸附前样本数值-吸附后样本数值)/吸附前样本数值*100％。结果如图4a-图4b所示，128个病例的大部分病例中，dna-senps对抗dsdna抗体的清除率都大于50％，而且dna-senps吸附血浆后，血浆中抗dsdna抗体的滴度有显著地降低。

分别取1ml实施例1制备的dna-senps和40mg市售dna免疫吸附剂中各加入同1位sle病人的血浆2ml，室温震荡(20rpm，试管旋转混匀器，tzl-5010，苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)吸附2h，每隔15min取样一次，将吸附前后的血浆采用酶联免疫试剂盒对抗dsdna抗体进行定量检测，最后用酶标仪在450nm和620nm处读取数值。结果如图4c-图4d所示，可见，本发明提供的纳米硒负载dna的免疫吸附剂与市售的免疫吸附产品(市售产品1：dna免疫吸附柱，碳化树脂上固定小牛胸腺dna；市售产品2：选择性血浆成分吸附器，苯基丙氨酸固定化聚乙烯醇凝胶)进行比较，dna-senps在15min的时候清除率就达到了75％，而市售产品1在两小时之内基本没有清除效果，市售产品2在两小时的时候清除率达到了35％。血浆中抗dsdna抗体滴度的变化与清除率的变化相一致。

分别将150μlsenps(实施例1制备)和150μldna-senps加入300μl血浆中(来源于3个sle病例，重复数为3)，室温20rpm混匀，吸附2h，以上述方法检测吸附后的血浆中抗dsdna抗体清除率。结果如图5所示，单独的senps对抗dsdna抗体也具有一定的清除效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。