ATP荧光检测微流控芯片，荧光检测系统，荧光检测方法及其应用与流程

本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及一种用于atp荧光检测的微流控芯片，荧光检测系统，荧光检测方法及其应用。

背景技术：

菌落总量是食品安全和环境监测的重要指标(“gb4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定”，菌落培养，时间1-3天)，国标方法耗时长、设备大型、操作繁复，不利于检验检疫等需要现场实时检测的应用领域。

atp(三磷酸腺苷)是所有生物生命活动的能量来源，atp生物发光法是利用atp试剂中若干组分，如荧光素-荧光素酶等，与被测样本反应产生光子，再利用专门研制的设备来捕捉和检测发光值，由于被测样本所含细菌等微生物的数量与所含的atp值、以及atp值与发光值之间存在一定的函数关系，因此通过检测发光值即能得到被测标本所含细菌等微生物含量。目前，市面上已经出现了基于atp生物发光原理来快速检测atp的检测设备。

近年来，微流控芯片作为新型的分析平台，具有微型化、自动化、集成化等优点，已经受到环境检测等相关领域的广泛关注。搭建微流控芯片平台用于微生物检测已经有部分报道，这些芯片检测在设计上没有充分发挥圆盘式芯片的优点，实际操作复杂，不利于多个样品同时检测，并且芯片适用范围窄，灵活性差。在芯片上实现高分辨率和高灵敏度的微生物检测应用尚未有实质性的突破。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种atp荧光检测微流控芯片，以克服现有技术的不足。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种atp荧光检测微流控芯片，包括一可绕中心点转动的芯片基体以及贴合于所述芯片基体上的芯片盖板，所述芯片基体上环绕中心点布设有多个检测单元；

所述检测单元包括形成于所述芯片基体上的裂解液池、样本池、酶溶液池和反应池，所述反应池离中心点的距离最远，且裂解液池、样本池和反应池与中心点的距离依次增加；所述裂解液池通过第一微流道与样本池连通，样本池通过第二微流道与反应池连通，酶溶液池通过第三微流道与反应池连通，所述第二微流道和第三微流道上均设有突破阀；

所述芯片盖板上设有多个加样孔，每个所述裂解液池、样本池和酶溶液池分别与对应的加样孔连通，通过该加样孔可向各池中加样。

突破阀，又叫虹吸阀，其具有固定的临界转速。本发明中，当微流控芯片的转速低于突破阀的临界转速时，样本池与反应池之间、酶溶液池与反应池之间不会导通；当转速达到或超过临界转速时，样本池、酶溶液池与反应池之间的通路被导通，溶液开始进入反应池。因此，当控制微流控芯片的转速低于突破阀的临界转速时，在离心力的驱动下，裂解液池中的裂解液会顺着第一微流道流入样本池中，与样本混合，而此时样本池、酶溶液池与反应池之间的通路并不会被导通。接着，控制微流控芯片的转速达到或超过突破阀的临界转速，此时样本池、酶溶液池与反应池之间的通路被导通，样本池中的混合液、酶溶液池中的酶溶液分别顺着第二微流道和第三微流道进入到反应池中，从而在样本池中发生荧光反应。

本发明中，突破阀除了控制第二微流道和第三微流道的导通，还起到了蓄氧的作用，能够提高溶液中的氧气含量，有利于atp与酶的充分反应。

作为优选，所述多个检测单元环绕所述中心点均匀布置于芯片基体上。

作为优选，所述芯片基体呈圆盘状，其中心部位具有用于安装到转轴上的安装孔。

作为优选，所述芯片盖板上还设有多个排气孔，每个所述裂解液池、样本池、酶溶液池和反应池分别与对应的排气孔连通。所述排气孔用于排出加样溶液中的气泡。

作为优选，所述第一微流道为具有多个s形弯折的流道。弯折的流道既能起到充分混合裂解液的作用，又能增加溶液中的溶氧量。

作为优选，所述芯片基体自下而上依次包括相互贴合的第一芯片层和第二芯片层，所述裂解液池、样本池、酶溶液池、反应池和突破阀均贯穿第二芯片层。

作为优选，所述第一微流道、第二微流道和第三微流道为凹设于第二芯片层上表面的流道槽。在另一种实施方式中，第一微流道、第二微流道和第三微流道凹设于芯片盖板的下表面上。

本发明还提供了一种atp荧光检测系统，包括前述的atp荧光检测微流控芯片以及荧光检测设备。所述荧光检测设备可为任意能够检测荧光强度的设备，包括但不限于荧光分光光度计、手持式atp荧光检测仪和台式atp荧光检测仪。当荧光检测设备为台式atp荧光检测仪时，优选地，其同时具备离心和检测的功能。

本发明还提供了采用前述的atp荧光检测微流控芯片进行荧光检测的方法，包括以下步骤：

(1)通过加样孔向裂解液池、样本池和酶溶液池中分别加入裂解液、样本和酶溶液；

(2)以第一离心速度对atp荧光检测微流控芯片进行离心，使得裂解液进入样本池，与样本混合；

(3)以第二离心速度对atp荧光检测微流控芯片进行离心，使得酶溶液和样本池中的混合液进入反应池，发生荧光反应；

(4)使用荧光检测设备检测荧光的强度。

本发明中，第二离心速度大于第一离心速度，其具体的数值需要根据芯片的结构确定。

作为优选，步骤(2)中，裂解液进入样本池后，控制微流控芯片交替正反转，使裂解液和样本充分混合，以充分提取样本中的atp。更优选地，所述混合的时间为1-3min。

由于荧光的强度衰减很快，因此在荧光反应后，需及时检测荧光强度。作为优选，在荧光反应后5min之内检测，更优选的为在1min之内检测。

此外，本发明还提供了前述的atp荧光检测微流控芯片在微生物检测中的应用。

本发明的有益效果：

本发明的atp荧光检测微流控芯片，试剂用量少，效率高，一张芯片可满足多组样本的在线分离和平行检测。

本发明的荧光检测方法，检测的速度快、精度高，自动化程度高，可实现现场的实时检测。

附图说明

图1是本发明一实施例的atp荧光检测微流控芯片的第一芯片层的结构示意图；

图2是第二芯片层的结构示意图；

图3是图2中的检测单元的结构示意图；

图4是芯片盖板大的结构示意图；

图5是与本实施例的atp荧光检测微流控芯片配合使用的atp荧光检测仪的结构示意图；

图中标号说明：

100、第一芯片层；110、安装孔；

200、第二芯片层；210、检测单元；211、裂解液池；212、样本池；213、酶溶液池；214、反应池；215、突破阀；216、第一微流道；217、第二微流道；218、第三微流道；

300、芯片盖板；310、加样孔；320、排气孔。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

参照图1-4所示，本发明的atp荧光检测微流控芯片的一实施例，包括一可绕中心点转动的芯片基体以及贴合于所述芯片基体上的芯片盖板300，芯片基体上环绕中心点均匀布设有六个检测单元210。当然，在可选的实施方式中，检测单元210的个数包括但不限于6个。

每个检测单元210均包括形成于芯片基体上的裂解液池211、样本池212、酶溶液池213和反应池214，其中，反应池214离中心点的距离最远，且裂解液池211、样本池212和反应池214与中心点的距离依次增加。裂解液池211通过第一微流道216与样本池212连通，样本池212通过第二微流道217与反应池214连通，酶溶液池213通过第三微流道218与反应池214连通。在第二微流道217和第三微流道218上均设有突破阀215。

本实施例中，所述芯片基体呈圆盘状，其自下而上依次包括相互贴合的第一芯片层100和第二芯片层200。

本实施例中，裂解液池211、样本池212、酶溶液池213、反应池214和突破阀215均贯通第二芯片层200，第一微流道216、第二微流道217和第三微流道218均为凹设于第二芯片层200上表面的流道槽。在其他实施方式中，裂解液池211、样本池212、酶溶液池213、反应池214和突破阀215可为凹设于第二芯片层200表面的凹槽，而不贯通第二芯片层200。

本实施例中，第一芯片层100为一空白的基板，其贴合于第二芯片层200的下方，以封堵第二芯片层200上贯通的孔道，从而形成裂解液池211、样本池212、酶溶液池213、反应池214和突破阀215。

芯片盖板300上设有多个加样孔310和排气孔320，每个所述裂解液池211、样本池212和酶溶液池213分别与对应的加样孔310连通，每个所述裂解液池211、样本池212、酶溶液池213和反应池214分别与对应的排气孔320连通。其中，通过加样孔310向各池中加样，排气孔320用于排出加样溶液中的气泡。

本实施例中，第一芯片层100、第二芯片层200和芯片盖板300的中心均设有用于安装到转轴上的安装孔110。

本实施例中，第一微流道216为具有多个s形弯折的流道。弯折的流道既能起到充分混合裂解液的作用，又能增加裂解液中的溶氧量。

本发明中，第一芯片层100、第二芯片层200和芯片盖板300的材质可为pmma、石英或玻璃，优选为pmma，三层可通过热压键合在一起。

本发明中，由于突破阀215自身的特性，当微流控芯片的转速低于突破阀215的临界转速时，样本池212与反应池214之间、酶溶液池213与反应池214之间不会导通；当转速达到或超过临界转速时，样本池212、酶溶液池213与反应池214之间的通路被导通，溶液开始进入反应池214。因此，当控制微流控芯片的转速低于突破阀215的临界转速时，在离心力的驱动下，裂解液池211中的裂解液会顺着第一微流道216流入样本池212中，与样本混合，而此时样本池212、酶溶液池213与反应池214之间的通路并不会被导通。接着，控制微流控芯片的转速达到或超过突破阀215的临界转速，此时样本池212、酶溶液池213与反应池214之间的通路被导通，样本池212中的混合液、酶溶液池213中的酶溶液分别顺着第二微流道217和第三微流道218进入到反应池214中，从而在样本池212中发生荧光反应。

本发明中，突破阀215还起到了蓄氧的作用，能够提高溶液中的氧气含量，有利于atp与酶的充分反应。

本实施例中，上述的微流道、裂解液池211、样本池212、酶溶液池213、反应池214和突破阀215、进样孔和排气孔320可以通过计算机数控磨床、激光刻蚀、liga技术、模塑法、热压法、化学腐蚀制备，也可通过软刻蚀技术制备。

实施例2

本实施例提供了一种atp荧光检测系统，包括实施例1所述的atp荧光检测微流控芯片以及如图5所示的atp荧光检测仪。该atp荧光检测仪上设有用于放置微流控芯片的检测位，并且同时具备离心和检测的功能。该atp荧光检测仪在使用时，只需将加好样的芯片放到检测位上，设置好离心和检测的参数，即可自动完成离心和检测。

实施例3

一种微生物的荧光检测的方法，包括以下步骤：

(1)通过加样枪向微流控芯片的裂解液池、样本池和酶溶液池中分别加入裂解液5ml、待测的菌液5ml和酶溶液5ml；

(2)将加样完成的微流控芯片放入atp荧光检测仪的检测位上，盖上翻盖，设定第一离心转速为500r/min，离心时间为3min；设置第二离心转速为2000r/min，离心时间为1min；启动atp荧光检测仪，进行离心和检测；

(3)在atp荧光检测仪的显示屏上显示荧光检测结果，比对标准曲线，即可得到菌落的数目。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。