一种微流控芯片及其在粒子清洗与换液中的应用的制作方法

本发明涉及微流控芯片制备与细胞清洗
技术领域：
，具体涉及一种微流控芯片及其在粒子清洗与换液中的应用。
背景技术：
：当前微流控芯片借助其成本低、设备小等优点被广泛应用到医学领域。特别是微流控技术还具有消耗样品量少、有较高的分辨精度及灵敏度、易于集成及微型化等优点被广泛地应用于细胞筛选的研究中，并表现出良好的发展前景。细胞换液是很多实验的必须步骤之一，例如在细胞培养和流式细胞检测等实验中换液操作十分重要。目前，人们常使用离心的方式进行换液，例如悬浮细胞，通常需要多次重复实施离心-吸液-加液-吹打步骤。在对细胞进行离心操作时，受离心力和流体静压力的作用，细胞的活性、内部结构、转录模式等会受到一定的影响。而液体如果长时间高转速离心，细胞容易破裂，极易导致细胞的死亡；但液体如果离心时间短、转速低，细胞又很难沉淀到底部，在吸除废液时，很容易造成细胞的损失。而且，离心换液的操作时间一般较长，操作步骤繁琐，很难提高效率，并进一步实现自动化。同时，细胞长时间暴露在空气中，也容易引起细菌、支原体污染。另外，采用离心方式换液还需要使用离心机，但离心机由于体积大难以集成在小型工作系统中，并且离心机在运行过程中会产生很大的震动，震动会影响到整个系统装置的稳定性，甚至会使其他设备无法正常工作。微流控芯片具有成本低，外形小巧，可塑性高，便于集成化的优点，现有技术中有使用微流控芯片进行清洗换液，但需要借助外围设备，比如超声波方法，超声波是有源的，即必须在芯片上加上超声波源，整个体系复杂，成本高。因此，人们需要一种结构简单、高效、成本低、使用便捷的细胞清洗、换液装置。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供了一种结构简单、成本低廉，使用方便、清洗和分离效果高效的微流控芯片，用于进行细胞或微球溶液的清洗和换液。本发明提供的一种微流控芯片，包括芯片本体，所述芯片本体为密封的长方体的腔式结构，芯片本体的左、右侧面设置有上、下两个连接芯片腔内与外界的口，包括左侧进口1，左侧进口2，右侧出口1，右侧出口2；所述芯片本体的腔内，由n列微柱均匀排列组成阵列结构，所述n为≥2的整数；所述微柱的顶面、底面与芯片本体的上、下基底紧密连接；所述阵列结构的排布方式为：第n+1列相对于第n列微柱倾斜排列，倾斜角度<60°，形成斜向排布的阵列；每列内每两个微柱的间距均相同，每个倾斜行微柱的中心连线相对平行；微柱间相邻的空腔为液体流过的微流道。本发明提供的微流控芯片中，所述芯片微流道高度为1-1000μm。进一步地，所述芯片微流道高度为10-800μm；优选地，所述芯片微流道高度为20-500μm；更优选地，所述芯片微流道高度为50-300μm。本发明提供的微流控芯片中，所述微柱的横截面为圆形、平行四边形、正多边形或椭圆形，所述正多边形优选为正三角形。当微柱的横截面为圆形时，芯片本体内腔的俯视剖面图见图1。本发明提供的微流控芯片，当芯片本体内微柱的横截面为圆形时，每个微柱横截面半径相同，均为小于500μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距d1为0.01μm-5000μmμm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距d2为0.01μm-500μm；并且d1总是大于d2。优选地，每个圆形微柱的半径为小于300μm、小于200μm、小于100μm、小于80μm、小于70μm、小于60μm、小于50μm、小于40μm。更优选地，每个圆形微柱的半径为5-30μm、8-25μm、10-23μm、12.5-20μm。优选地，每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为1-1000μm、10-1000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为1-100μm，且二者倾斜角度为为小于60，小于30°、小于20°、小于10°。更优选地，每个圆形微柱的半径为5-30μm、8-25μm、10-23μm、12.5-20μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为40-500μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为3-10μm；且二者倾斜角度为大于0.5°小于10°。当横截面为平行四边形时，平行四边形的边长为小于500μm，平行四边形的锐角夹角为<60°；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距d1为0.01μm-5000μmμm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距d2为0.01μm-500μm，并且d1总是大于d2。优选地，平行四边形的边长为小于100μm、小于80μm、小于70μm、小于60μm、小于50μm、小于40μm，平行四边形的锐角夹角为40°；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距d1为1-1000μm、10-1000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距d2为1-100μm；更优选地，平行四边形的边长为25-35μm，平行四边形的锐角夹角为小于30°；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距d1为35-45μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距d2为20-30μm。本发明提供的微流控芯片，当横截面为正三角形时，正三角形边长为小于100μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距d1为0.01μm-5000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距d2为0.01μm-500μm；优选地，正三角形边长为10-100μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为1-1000μm、10-1000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为1-100μm；更优选地，正三角形边长为20-40μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为40-500μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为3-10μm。具体而言，在本发明的一个实施例中，当芯片本体内微柱的横截面为正三角形时，正三角形边长为16-26μm；每列微柱中相邻两个微柱的中心连线的距离为40-60μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的中心点的相对于芯片本体宽度的垂直距离差为48-52μm，且每斜行微柱的相邻两个微柱中心点的相对于芯片本体长度的垂直距离差为2-4μm。本发明提供的微流控芯片，当横截面为椭圆形时，椭圆形的水平轴长小于100μm，垂直轴长小于100μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距d1为0.01μm-5000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距d2为0.01μm-500μm；并且d1总是大于d2；优选地，椭圆形的水平轴长10-90μm，垂直轴长10-90μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为1-1000μm、10-1000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为为1-100μm；更优选地，椭圆形的水平轴长20-50μm，垂直轴长20-40μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为40-500μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为3-10μm。在本发明的一个实施例中，当芯片本体内微柱的横截面为椭圆形时，椭圆形的水平轴长为50-70μm，垂直轴长为25-35μm；每列微柱中相邻两个微柱的中心连线的距离为40-60μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的中心点的相对于芯片本体宽度的垂直距离差为50-70μm，且每斜行微柱的相邻两个微柱中心点的相对于芯片本体长度的垂直距离差为15-25μm。进一步地，本发明提供的微流控芯片的芯片本体的左侧进口1，左侧进口2，右侧出口1，右侧出口2，分别连接可流通液体的管道，管道与芯片本体长度的锐角夹角为0-30°；和/或进口1和进口2连接微泵，微泵使液体通过芯片本体内腔的流速为10-20μl/min。本发明的微流控芯片在使用时，可将图1的芯片顺时针方向旋转90°，加入溶液时，借助重力，溶液由上面(左侧)的两个进口进入，从下面(右侧)的两个出口出。也可按照图1的示例水平放置，在两个进口连接微泵，微泵可以使进口加入的溶液向对向方向流动。本发明的芯片的材料可选自聚二甲基硅氧烷(pdms)、pmma、玻璃、硅片、金属等，但出于成本及实验方便性考虑，本实施例采用pdms作为实验材料，当运用于大批量生产领域，可以考虑其他材料。本发明提供了所述微流控芯片在对含有粒子的溶液清洗或换液中的应用。所述粒子包括但不限于细胞或微球。本发明提供了一种对含有粒子的溶液清洗或换液的方法，所述的粒子为细胞或微球，是采用本发明所述的微流控芯片对含有粒子的溶液清洗或换液。本发明所述粒子的直径为小于20微米。上述方法中，实际操作时，换液和清洗的粒子直径小于微柱阵列中每列相邻微柱的最短相对距离，且待换液和清洗的粒子直径大于微柱阵列中每斜行相邻两个微柱的最短相对距离(见图1位置的列、斜行)。本发明提供的微流控芯片具有将一种小于20微米细胞或微粒溶液内的细胞或微粒转移至另外一种溶液的能力，同时能够使两种溶液分开重新收集。实际操作时，两种溶液无论浓度如何，只要溶液a中有细胞或其他粒子，就能将其中的粒子转移到同时进行的溶液b中。经过收集后的两种液体细胞或微粒转移率在95％以上。具体操作过程为：将a溶液与b溶液(5～20微米细胞或微粒)同速分别注入同侧两个进口的流道内，两种液体经过芯片本体内腔区的微柱阵列结构，从另一侧流道的出口1和出口2分别流出并收集，收集到a溶液(小于20微米细胞或微粒)与b溶液。本发明采用微柱阵列对微观颗粒进行换液，由于其清洁、简便和可连续分离等优点，在微流控分选技术应用于细胞换液、清洗具有重要作用。分选装置由规则排列的微柱组成，每列微柱与前一列稍微错开，形成斜向排布的阵列。流体在微柱间流动时，自然形成倾斜的主流道和横向的分流道。当粒子直径显著小于微柱阵列中每列相邻微柱的最短相对距离，且待换液和清洗的粒子直接大于微柱阵列中每斜行相邻两个微柱的最短相对距离时，粒子会发生偏移，从而使粒子沿倾斜的主流道运动。粒子的转移率在95％以上，且操作方便，成本低。附图说明图1为本发明微流控芯片的芯片本体内部结构俯视剖面图。图2为本发明实施例1的微流控芯片的芯片本体俯视外形及尺寸图。图3为本发明微流控芯片的芯片本体内腔中圆形阵列外形及尺寸。图4为本发明微流控芯片的芯片本体内腔中平行四边形阵列外形及尺寸。图5为本发明微流控芯片的芯片本体内腔中正三角形阵列外形及尺寸。图6为本发明微流控芯片的芯片本体内腔中椭圆形阵列外形及尺寸。图7为实施例2中掩膜版效果图。图8为实施例2中制得的微流控芯片本体内腔中圆形微柱排练示意图。图9为实施例3中流道仿真图。图10为实施例3中浓度仿真图，左侧为高浓度，右侧为低浓度。图11为实施例3中仿真结果，出口处浓度曲线。图12为实施例3层流现象目镜下观察图。图13为实施例3层流现象摄像头下观察图。图14为实施例4中两种溶液进行微球换球的实验图，表示荧光微球从进口到出口的轨迹图，图中的abcd分别指代从进口到出口的四个不同的时间节点帧图像，表示小球从右下方进入，经过偏移从左上方流出。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。实施例1微流控芯片的结构和内部尺寸本实施例芯片的俯视图如图2所示，芯片本体内腔的俯视剖面图如图1所示。微流控芯片包括芯片本体，所述芯片本体为密封的长方体的腔式结构，芯片本体的左、右侧面设置有上、下两个连接芯片腔内与外界的口，包括左侧进口1，左侧进口2，右侧出口1，右侧出口2；所述芯片本体的腔内，由n列微柱均匀排列组成阵列结构，所述n为≥2的整数；所述微柱的顶面、底面与芯片本体的上、下基底紧密连接；所述阵列结构的排布方式为：第n+1列相对于第n列微柱倾斜排列，倾斜角度<60°，形成斜向排布的阵列；每列内每两个微柱的间距均相同，每个倾斜行微柱的中心连线相对平行；微柱间相邻的空腔为液体流过的孔道。芯片本体的左侧进口1，左侧进口2，右侧出口1，右侧出口2，分别连接可流通液体的管道，管道与芯片本体长度的锐角夹角为0-30°；和/或进口1和进口2连接微泵，微泵使液体通过芯片本体内腔的流速为10-20μl/min。表1图2对应的芯片本体内腔微流道区域的参数表1中的h特指芯片本体内腔微流道高度，其为10-500μm。本发明芯片本体内腔中的微柱的横截面为圆形、平行四边形、正多边形(优选正三角形)或椭圆形。1、当微柱横截面为圆形时，每个微柱横截面半径相同，均为12.5-16μm；每列微柱中相邻两个微柱的中心连线的距离为40-60μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的中心连线的距离为30-40μm，且二者倾斜角度为3.2-60°。见图3，表2。每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为40-500μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为3-10μm。表2图3中对应的芯片本体内圆形微柱的各参数2、当横截面为平行四边形时，平行四边形的边长为小于100μm、小于80μm、小于70μm、小于60μm、小于50μm、小于40μm，平行四边形的锐角夹角为小于40°，；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距d1为1-1000μm、10-1000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距d2为1-100μm；更优选地，平行四边形的边长为25-35μm，平行四边形的锐角夹角为小于30°；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距d1为35-45μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距d2为20-30μm。平行四边形的边长为25-35μm，平行四边形的锐角夹角为<60°；每列微柱中相邻两个微柱的中心连线的距离为40-60μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的中心点的相对于芯片本体宽度的垂直距离差为35-45μm，且每斜行微柱的相邻两个微柱中心点的相对于芯片本体长度的垂直距离差为20-30μm。见图4，表3。表3图4中对应的芯片本体内平行四边形微柱的各参数3、当横截面为正三角形时，正三角形边长为小于500μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为0.01μm-5000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为0.01μm-500μm；并且d1总是大于d2；优选地，正三角形边长为10-100μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为1-1000μm、10-1000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为1-100μm；更优选地，正三角形边长为20-40μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为40-500μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为3-10μm。具体而言，本发明微流控芯片上述正三角形边长为16-26μm；每列微柱中相邻两个微柱的中心连线的距离为40-60μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的中心点的相对于芯片本体宽度的垂直距离差为48-52μm，且每斜行微柱的相邻两个微柱中心点的相对于芯片本体长度的垂直距离差为2-4μm；见图5，表4。表4图5中对应的芯片本体内正三角形微柱的各参数4、当横截面为椭圆形时，椭圆形的水平轴长小于100μm，垂直轴长小于100μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为0.01μm-5000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为0.01μm-500μm；并且d1总是大于d2；优选地，椭圆形的水平轴长10-90μm，垂直轴长10-90μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为1-1000μm、10-1000μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为为1-100μm；更优选地，椭圆形的水平轴长20-50μm，垂直轴长20-40μm；每列微柱中相邻两个微柱的最短相对间距为40-500μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的最短相对间距为3-10μm。本实施例中，椭圆形的水平轴长为30-50μm，垂直轴长为25-35μm；每列微柱中相邻两个微柱的中心连线的距离为40-60μm；每斜行微柱的相邻两个微柱的中心点的相对于芯片本体宽度的垂直距离差为50-70μm，且每斜行微柱的相邻两个微柱中心点的相对于芯片本体长度的垂直距离差为15-25μm。见图6，表5。表5图6中对应的芯片本体内椭圆形微柱的各参数变量abcde参数40～60微米50～70微米25～35微米50～70微米15～25微米本实施例中的所有参数是发明人经过大量实验，反复筛选获得的，采用上述参数之外的其他参数，均无法实现很好地细胞、微球的分离、清洗与换液。实施例2微流控芯片的制备1.确定换液、清洗粒子直径的原理如图2所示，当粒子直径显著小于微柱阵列中每列相邻微柱的最短相对距离，且待换液和清洗的粒子直径大于微柱阵列中每斜行相邻两个微柱的最短相对距离时，粒子会发生偏移，从而使粒子沿倾斜的主流道运动。而当粒子直径小于微柱阵列斜行最短相对距离时，粒子会基本保持原来行进方向，因此，换液、清洗粒子直径应小于微柱阵列中每列(图1的纵向)相邻微柱的最短相对距离，且待换液和清洗的粒子直径大于微柱阵列中每斜行(图1的斜横向)相邻两个微柱的最短相对距离。2.掩膜版图形绘制本发明使用硅片及su-82015光刻胶作为微流控芯片的模板，需要制作光学掩膜版。光学掩膜版是微纳加工技术常用的光刻工艺所使用的图形母版，由不透明的遮光薄膜在透明基板上形成掩膜图形结构，再通过曝光过程将图形信息转移到产品基片上，本发明使用菲林胶片作为掩膜版。掩膜版效果图如图7。图7中白色区域制成菲林胶片后变为透明色，为透光区域，黑色区域制成菲林胶片后为遮光区域。根据确定性横向迁移原理，本发明中的圆形直径为25微米，纵向圆心距为50微米，横向圆心距为37微米，倾斜角度23.962°，示意图如图8。由此设计出的微柱阵列可以分离15微米粒子。3.光刻本发明使用4英寸硅片晶圆作为芯片的模具基底，首先对硅片进行清洁，plasma处理2分钟，使用的su-82015光刻胶需经过水浴30°加热。之后将光刻胶倾倒在硅片中心，进行匀胶(500rpm10s，1300rpm30s)操作。静置10分钟后，95℃软烘4分20秒，进行14s曝光，95℃后烘5分20秒。之后，将硅片晶圆显影4分20秒，清洗干净后150℃坚膜10分钟，即制备完成。由于使用负胶进行制作，被紫外光线照射的区域形成“凸起”的结构，黑色圆形阵列会使这个“凸起”结构上形成“凹槽”阵列。4.微流控芯片制作本发明方法需要制作的微流控芯片可用材料广泛，比如聚二甲基硅氧烷(pdms)，塑料与激光键合技术，3-d打印技术等等。实施例中选取了pdms作为微流控芯片的基底。pdms是一种高分子有机硅化合物，具有光学透明，在一般情况下表现惰性，无毒无害，不易燃，其广泛运用在生物微机电中的微流道系统领域。未经加热的pdms呈粘稠液体状，在实验室中取用20gpdms，并按10:1比例添加硬化剂，充分搅拌3分钟后，以抽真空的方式使混合液中的气泡浮至表面并破裂，再倒入硅片晶圆制成的模具中。使用气吹将表面的气泡吹去，然后将覆盖pdms的模具放在120℃的加热台上，直至pdms凝固为固态。之后，用超声波清洗载玻片。使用真空氧等离子体键合方法，使pdms与载玻片结合，这样便形成了一个内含孔道与微柱阵列，包裹良好的板状结构。此时，本发明具备细胞清洗与换液的微流控芯片制作完成。实施例3微流控芯片的性能测试1.comsolmultiphysics仿真测试使用windows系统中的comsolmultiphysics软件对实施例2制得的微流控芯片的微柱阵列结构进行仿真测试，观察此芯片结构能否产生层流现象以及粒子的确定性横向迁移。首先绘制微流控芯片本体腔内结构如图1，由于整个微流控芯片包含上万个微柱结构，仿真软件无法将整个结构进行仿真，所以本实施例作简化处理，保留了最基本的柱状结构和参数比例，保证流体流道与实际实验相似。在图9的流道仿真图中白色圆点为柱状结构，灰色部分为镂空孔道，可以保证液体从下方流入并从上方流出。从进口2通高浓度液体，进口1通低浓度液体，从出口接收流经整个模型的混合液体。图10浓度仿真图，图11为出口浓度曲线，说明图11中的左侧出口处是高浓度，右侧出口处是低浓度，中间的曲线代表两种浓度交汇处，处在芯片的中间区域，证明两种液体没有发生明显的混合，如果混合的话，那么整个出口处浓度都会趋近一致。从图9-图11可以看出，两种不同浓度的液体同时经过带倾斜角度的阵列结构，他们不会发生明显的混合，而是出现层流现象。即，在出口处的浓度分界线仍然在模型的中间位置。利用这样的仿真结果，我们可以推测出实际实验结果应会出现良好的现象。2.层流现象观察实验本实施例使用红色蓝色墨水来验证层流现象。首先将实施例2制得的微流控芯片水平放置在电子显微镜上，从左侧通水，将芯片内的气体排净，水从右侧排出。之后，左侧两通道为入口，使用搭建在微泵上的针管，分别通入红色、蓝色墨水，右侧为出口，导出流经芯片的墨水废液。显微镜下观察现象如图12、13。从图显示的实验现象可以看出，层流现象十分明显，即两种液体不会发生明显的混合，这对于清洗细胞、细胞换液是十分有效的。实施例4微流控芯片在离子清洗与换液中的应用使用实施例2制得的微流控芯片对15微米的荧光微球作换液处理。首先，将微流控芯片水平放置在电子显微镜上，从左侧通水，将芯片内的气体排净，水从右侧排出。之后，左侧两通道为入口，使用搭建在微泵上的针管，分别通入水、微球混合液，右侧为出口，导出流经芯片的两种液体。显微镜下观察现象如图14。从实验现象可以看出，微球在芯片内会按照阵列偏移方向移动，而两种液体会因层流现象不会发生混合，最终微球会从一种液体中转移向另外一种液体，从而实现换液操作，在实验过程中进行拍照监控和视频监控，目测估算出蚕蛹本发明芯片对荧光微球的分离率为95％左右。本实施例的这种方法可以同样适用于细胞的清洗与换液，此前使用离心法的换液操作步骤繁琐，使用条件要求比较高，而这种基于微流控芯片的细胞清洗与换液方法大大减少了操作步骤，微型化的芯片模型适用范围更广，更有利于设计系统化、集成化的细胞处理一体化设备。本发明采用物理法对粒子(细胞或微球)进行分离、换液或清洗，其另一个显著的优点在于能够把换液过程对细胞的损伤降到了最低，而且实验结果证明了大直径粒子会全部换液出去，所以很大程度上保证了粒子的完整性和换液的彻底性。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12